2.

4 Elektrophorese
Proteine werden in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (Sodiumdodecylsulfat SDS), einem
anionischen Detergens, ihrer Größe nach auf einem Elektrophoresegel aufgetrennt (Laemmli,
1970). Zur Reduzierung der Disulfidbrücken wird Dithioerythrit (DTE) verwendet. Um die
Proteinbanden zu fokkusieren wird ein diskontinuierliches Puffersystem verwendet.
Die aufgetrennten Proteine können am Gel unspezifisch durch Coomassie-Brilliantblau oder
das sensitivere Färbemittel Silbernitrat gefärbt werden. Die Färbung kann auch zuerst mit
Coomassie-Brilliantblau und dann mit Silbernitrat erfolgen, wobei Proteinmengen, die mit
dem ersten Farbstoff keine deutlichen Banden zeigen, besser sichtbar gemacht werden.
Ein proteinspezifischer Nachweis kann mittels Western Blot (Towbin und Gordon, 1984)
durchgeführt werden. Die Proteine werden elektrophoretisch vom Gel auf eine
Nitrocellulosemembran transferiert. Die Membran wird dann mit einem Antikörper gegen ein
Epitop rekombinanter GnT I inkubiert und die Bindung dieses Antikörpers wird mit einem
Sekundärantikörper nachgewiesen. An diesen zweiten Antikörper ist Meerettichperoxidase
(Horse radish peroxidase HRP) gebunden, die das Substrat Luminol unter Aussendung von
Chemiluminiszenz abbaut. Die ausgesendeten Lichtblitze werden auf einem Röntgenfilm
detektiert.
2.4.1 SDS-PAGE

- Glasplatten mit Aceton reinigen und in das vorgesehene Gestell einsetzen, wobei
entweder1.5 mm (dicke) Spacer oder 0.75 mm (dünne) Spacer zwischen die Platten
gebracht werden.Für Färbegele werden dünne Spacer verwendet, für Gele, denen ein
Westernblot folgt, benötigt man dicke Spacer.

- Trenngel herstellen (für 2 dicke Gele)

7 ml 30% (w/v) Acrylamid
2,2 ml 1% (w/v) Bisacrylamid
4,2 ml 1,5 M Tris/HCl; pH 8,8
3,2 ml A.bi.
3-4 min entgasen
168 l SDS 10% (w/v)
10 l TEMED
100 l 10% (w/v) Ammoniumpersulfat

- Gel rasch ausgießen, mit Isopropanol überschichten (schützt vor Austrocknung) und 1
h polymerisieren lassen
- Sammelgel herstellen 1,3 ml 30% (w/v) Acrylamid
0,89 ml 1% (w/v) Bisacrylamid
1,7 ml 0,5 M Tris/HCl; pH 6,8
2,87 ml A.bi.
3-4 min entgasen
70 l SDS 10% (w/v)
5 l TEMED
50 l 10% (w/v) Ammoniumpersulfat
- Isopropanol absaugen und mit Sammelgel überschichten
- Probenkamm (mit 10 Kämmen) einsetzen und Sammelgel 45 min polymerisieren
lassen
- Proteinelektrophoresepuffer (600 ml) herstellen 1,8 g Tris
8,6 g Glycin
0,6 g SDS
 - Gelkämme entfernen und Probentaschen mit Proteinelektrophoresepuffer
überschichten
- Proben je nach Proben- und Auftragsmenge mit 2fach-Probenpuffer verdünnen oder in
1fach Probenpuffer aufnehmen (Endkonzentration an Puffer soll 1fach sein)
- Proben werden 5 min bei 95°C reduziert und danach auf Eis gekühlt
- Proben mittels geeigneter Spitzen in die Geltaschen überführen, wobei zwei Standards
zur Anwendung kommen
Broadrange Protein Marker (Biolabs) für Färbegele
Prestained Protein Marker (Biolabs, vorgefärbt) für Westernblot
- Proteinelektrophoresepuffer in die Elektroapparatur füllen, bis der untere Gelrand
bedeckt ist
- Elektophorese bei const. 200 V laufen lassen, bis die Bromphenolblaufront
(Färbemittel im Probenpuffer) den unteren Gelrand erreicht hat (ca. 45 min)

2.4.2 Proteinnachweis am PA-Gel

2.4.2.1 Coomassie Brilliant Blaufärbung

 PA-Gel mindestens 30 min in Fixierlösung I inkubieren

40% (v/v) Methanol
10% (v/v) Essigsäure
50% A.bi.
 Gel 20 min in Färbelösung (0,1% (w/v) Coomassie-Brilliant Blue G250 (Biorad) in
Entfärbelösung) inkubieren
 Gel mindestens 2 h (besser über Nacht) in Fixierlösung I inkubieren

2.4.2.2 Silberfärbung
 Gel mind. 30 min in Fixierlösung I inkubieren
 Gel mind. 20 min in Fixierlösung II inkubieren 30% (v/v) Ethanol
0,125% (v/v)Glutardialdehyd
0,2% (w/v) Formaldehyd
6,8% (w/v) Natriumacetat
 Gel 3 mal in A.bi. waschen
 Gel 20 min in Silberlösung inkubieren 0,25% (w/v) Silbernitrat
0,015% (v/v) Formaldehyd (37%)
 Gel bis zum deutlichen Sichtbarwerden der Banden (1-10 min) in der
Entwicklerlösung inkubieren 2,5% (w/v) Natriumcarbonat (wasserfrei)
0,0074% (v/v) Formaldehyd (37%)
 Gel 10 min in 1,46% (v/v) EDTA.2 Na stoppen
 Das Gel kann in 5% Essigsäure einige Wochen gelagert werden, wobei allmählich
Schwarzfärbung eintritt

2.4.2.3 Western Blot mit Immundetektion

- Towbin-Puffer (1l) herstellen und bei 4°C lagern 14,4 g Glycin
3,03 g Tris
0,37 g SDS
200 ml Methanol
- Elektophoresegel, Hybond C-pure Membran (Amersham Pharmacia), Schaumstoff
und Filterpapier 5 min in Towbin-Puffer äquilibrieren
- Sandwich in folgender Reihenfolge anfertigen
KATHODE (SCHWARZ)
 Schaumstoff
Filterpapier (3 Lagen)
Gel
Membran
Filterpapier (3 Lagen)
Schaumstoff
ANODE (ROT)
- Sandwich und Kühlkassette in Blotapparatur einlegen und Transfer bei const. 100V 1
h lang durchführen
- Membran entnehmen und Position der Gelecken durch Einschneiden der Membran
markieren
- Bei Verwendung des Broad Range Protein Markers wird die Membran 5 min mit 0,2%
Ponceau S in 3% (w/v) TCA gefärbt und die Banden des Standards mit Bleistift
markiert
- Membran mit Wasser entfärben und 2 mal 5 min mit ca. 10 ml PBS (1l) waschen
8 g NaCl
0,2 g KCl
1,4 g Na2HPO4.2H2O
0,256 g KH2PO4
- Membran mindestens 1 h (besser über Nacht) in 3% (w/v) BSA in PBS/+ 0,02% (w/v)
NaN3 blockieren
- Abgesättigte Membran zweimal 5 min mit PBS/+ 0,05% Tween 20 (PBST) waschen
- 1. Antikörper (AK) Anti-Xpress (Invitrogen) bei 14000 rpm zentrifugieren und 1:5000
verdünnen (2 l in 10 ml 3% (w/v) BSA in PBST/+ 0,02 NaN3)
- Membran 1 h lang in 1. AK-Lösung unter Schwenken inkubieren
- Membran fünfmal für 5 min mit PBST waschen
- 2. AK (Sekundär-AK) GoatMouse IgG HRP (Jackson) wie oben zentrifugieren und
1:10000 verdünnen (1 l in 10 ml 0,5% (w/v) BSA in PBST)
- Membran 1 h lang in 2. AK-Lösung unter Schwenken inkubieren
- Membran fünfmal für5 min mit PBST waschen
- Membran einmal kurz in PBS waschen
- Membran auf Haushaltsfolie mit frisch bereitetem ECL-Reagens (SuperSignal West
Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce) für 2 min inkubieren
- Membran in frisch bereitete Haushaltsfolie einschlagen
- Film in der Dunkelkammer für 2 sec bis 30 min mit einem Röntgenfilm in einer
Röntgenfilmkassette exponieren
- Film für 2 min in Entwicklerflüssigkeit legen
- Film für 30 sec in H2Odest. waschen
- Film für 2 min in Fixierbad tauchen
- Film gründlich mit H2Odest. waschen

2.5 Chromatographische Methoden

2.5.1 Enzymaktivitätsbestimmungen

Die katalysierte Reaktion der GnT I ist schematisch in Abb. wiedergegeben. Als
Akzeptor können Man3-octyl und Man5-PA dienen. Bei der
Anionenaustauschchromatographie wird ein 14C-markiertes UDP-GlcNAc als Donor
eingesetzt und reagiert mit Man3-octyl als Akzeptor. Die Säulenmatrix der
Ionenchromatographie ist Dowex 1x8, das ein stark basisches, tertiäres Ammoniumion als
geladene Gruppe trägt. Dieses bindet den negativ geladenen Nukleotidzucker (UDP-
[14C]GlcNAc) und trennt ihn von den anderen Komponenten. Der radioaktive Kohlenstoff
im Reaktionsprodukt GlcNAc-Man3-octyl, das aus UDP-[14C]GlcNAc umgesetzt wurde,
wird im Szintillationszähler gemessen.

2.5.1.1 Anionenaustauschchromatographie mit Dowex 1x8 Matrix

- Assaypuffer (1 ml) immer frisch bereiten
500 l 0,4 M Mes-Puffer, pH 6,3
50 l 20 mg/ml BSA
100 l 10% (w/v) Triton X-100
10 l 100 mM DTT
1 l 5 mg/ml E-64 (in DMSO gelöst)
1 l 5 mg/ml Leupeptin (in DMSO gelöst)
5 l 200 mM PMSF (in Methanol gelöst)
333 l A.bi.

- die Ansätze für die Assays werden gemäß Tab. hergestellt

Zellüberstände [l] Gereinigtes Enzym [l] Zusammensetzung

10 10 Assaypuffer
2 2 5 mM Man3-octyl
1 Swaisonin (100 g/ml)
1 0,1 M AMP
1 1 0,4 M MnCl2 (am Schluß zugeben)
2 100 M Inhibitor “G”
8 2 Enzym
1 1 2 mM UDP-[14C]GlcNAc
4 DdW
20 20 Gesamt

- von jeder Probe werden auch Ansätze ohne Akzeptor (anstatt von Man3-octyl 2 l
ddW) als Negativkontrolle mitgeführt
- als 0% und 100%-Wert werden 2 l ddW statt der Enzymlösung eingesetzt
- Ansätze werden 1 bis 16 h bei 37°C inkubiert
- Reaktionen werden mit 500 l Stoppreagens 20 mM Natriumtetraborat
2 mM EDTA gestoppt
- für die Chromatographie werden kleine Schaumstoffstücke in kurze Pasteurpipetten
gestopft
- Dowex 1x8 (Supelco) vorbereiten 10 g Dowex 1x8 in 100 ml A.bi. 30 min
Quellen, Überstand absaugen, Gel in 50 ml
A.bi. suspendieren und 100 l 10% (w/v) N
NaN3-Lösung als Konservierungsmittel
zugeben
- 2 mal 500 l Dowex 1x8 zupipettieren und 2 mal mit 500 l ddW spülen
- Szintillationsröhrchen vorbereiten und Proben auf die Säulen auftragen
- Säulen 2 mal mit 500 l ddW spülen
- 2 ml Szintillationscocktail zu den Lösungen in den Röhrchen zugeben
- als Blindwert (BW) werden 10 l Assaypuffer mit 500 l Stoppreagens, 1 ml ddW
und 2 ml Szintillationscocktail vermischt. Der BW dient zur Abschätzung des
 Hintergrundsignals des Cocktails. BW und 100%-Wert werden nicht über die Säule
geschickt.
- Messung der Radioaktivität im Szintillationszähler (Packard Instruments)

2.5.2 Proteinreinigung
Bei der Ionenaustauschchromatographie mit CM-Trisacryl M werden die zu reinigenden
Proteine bei pH 6,5 an Carboxymethyl (-OCH2COO-), ein negativ geladenes Molekül, das
selbst an einem Acrylharz immobilisiert ist, gebunden und mit einem Salzgradienten
eluiert.
Die Chelating Sepharose dient bei der Affinitätschromatographie als stationäre Phase.
Sepharose ist ein Agarosegel, das die Matrix, an die Iminodiessigsäure gekoppelt wird,
darstellt. Die Iminodiessigsäure fungiert als Ligand eines Metallkomplexes mit
Nickelionen als Zentralatome. An die Metallionen binden Aminosäuren wie Histidin, die
im rekombinanten Fusionsprotein als His-Tag vorkommen. Es wird mit einem
Imidazolgradienten eluiert.

2.5.2.1 Affinitätschromatographie

Beladen der Chelating Sepharose:

- 5 ml Gel absitzen lassen und Überstand absaugen
- Gel mit 0,1 M NiCl2 (237,7 mg NiCl2.6H2O in 5 ml A.bi. gelöst) mischen und 5 min
inkubieren
- Überstand abheben
- Gel 3 mal mit 40 ml A.bi. waschen
- Gel in 3 mal 20 ml Startpuffer II (200 ml) äquilibrieren:
10 mM Natriumphosphat, pH 7,0 0,31 g NaH2PO4
20 mM Imidazol 0,27 g Imidazol
40 mM NaCl 0,47 g NaCl
0,02% (w/v) NaN3 0,4 ml 10% (w/v)Lösung
- Gel in Säule packen und mit 10 ml Startpuffer II äquilibrieren
Durchführung der Chromatographie:
- Zellkulturüberstand von Kaninchen GnT I exprimierenden Sf 21 Zellen werden 30
min bei 20000 g bei 4°C zentrifugiert
- Dialyse (siehe Punkt ) durchführen
- Probe auftragen und den Auftrag 2 mal wiederholen
- Durchbruch auffangen
- Säule 5 mal mit 5 ml Startpuffer II waschen
- Säule 5 mal mit 5 ml Startpuffer II mit 40 mM Imidazol waschen
- Säule 5 mal mit 5 ml Startpuffer II mit 80 mM Imidazol waschen
- Säule 5 mal mit 5 ml Eluationspuffer (Startpuffer II mit 250 mM Imidazol) eluieren,
wobei nach der ersten 5 ml Fraktion die Säule 20 min abgeklemmt wird
- Säule 5 mal mit 5 ml Startpuffer II waschen
- Säule mit Startpuffer II überschichten und bei 4°C lagern

2.5.3 Affinitätschromatographie von RbGnT I an UDP-Hexanolamin-Sepharose:

2.5.3.1 RbGnT I (wild type)
Die Sepharose dient bei der Affinitätschromatographie als stationäre Phase, an die UDP-
Hexanolamin gekoppelt ist. Ausgenutzt wird das Bindungsvermögen von GnT I an UDP,
wobei dies von der Konzentration an UDP in Gel abhängig ist. Eluiert wird mit einem
NaCl-Gradienten.
* Säule I: UDP-Hexanolamin-Sepharose (Sigma; ~2,5 mol UDP/ml Gel)
 * Säule II: UDP-Hexanolamin-Sepharose (Joziasse; ~8 mol UDP/ml Gel)
Durchführung:
Pufffer A Puffer B Puffer C
25 mM Mes, pH 6,5
0,1 M NaCl Puffer A +20% (w/v) Pufffer B; aber 1,0 M NaCl
Glycerin
0,1% Triton X-100
0,02% NaN3
10 mM MnCl2

- 200 l RbGnT I (wt) mit Puffer A auf 1,0 ml verdünnen, ein Aliquot von 50 l bei
4°C aufbewahren
- Säulen mit 10 ml Puffer B äquilibrieren
- Proben auf die Säulen auftragen, dies dreimal wiederholen
- Durchbruch aufbewahren
- Säule 5 mal mit 1 ml Puffer B waschen
- Mit Puffer C fünf mal 1 ml eluieren, wobei nach der ersten Fraktion die Säule 15 min
abgeklemmt wird
- Säule mit 10 ml Puffer B äquilibrieren, bei 4°C aufbewahren
- Von den einzelnen Fraktionen werden Enzymaktivitätsassays (s. Punkt )
angefertigt
- Fraktionen werden bei 4°C gelagert

2.5.3.2 Affinitätschromatographie von RbGnT I-Mutanten an UDP-Hexanolamin-Sepharose

* Säule: UDP-Hexanolamin-Sepharose (Joziasse; ~8 mol UDP/ml Gel)

Einfachmutanten: D291N (A106)
D291E
Doppelmutanten: R269/H187
F269/H187
E269/H187 (´00)
E269/H187 (´01)
Durchführung: siehe 2.5.3.1
Da diese Mutanten wenig bis keine Aktivität mehr besitzen, werden die
einzelnen Fraktionen mittels Silbergelfärbung (siehe Punkt ) und
Western Blot (siehe Punkt )analysiert

2.5.4 Untersuchung des Verunreinigungsgrades von UDP-Glc und UDP-GlcNAc-Lösungen

mittels HPLC
Da UMP und UDP-Glc bzw. UDP-GlcNAc aufgrund ihrer freien Phosphatgruppen ähnliche
Retentionszeiten in einem geeigneten HPLC-Lauf besitzen, ist es möglich Verunreinigungen (
im 1%-Bereich) an freiem UDP in den Lösungen zu erfassen.

2.6 Inhibition von wt RbGnT I mit UDP-Glucose und Ermittlung der Inhibitionskonstante Ki