Anastasija Jankovic BICB

1)

ß-Glucosidase aus Mandeln, leicht gelb: ß-D-Glucosidase + H20 mit ß-Glucosidase --> D-
Glucose + Alkohol --> Spektrophotometrie Stop Rate Bestimmung bei 400 nm in der Testtube im
Wasserbad bei 37°C 
pH: 2 – 9.5 
2 aktive Untereinheiten 
molares Gewicht: 117 und 66,5 
0,1 M Acetat Buffer pH5 … 1ml 
Substrat … 1ml 
Enzymlösung … 0,1 ml 
10-60 U/mg Protein 
 

 
p-Nitrophenol wird hergestellt bei der Reaktion und wird gemessen. Das Produkt ist gefärbt, leicht
gelb. Reaktion ist diskontinuierlich, weil sie gestoppt wird nach ungefähr 20 Minuten. Absorption
von p-Nitrophenol bei 400 nm wird gemessen, es wird aufgenommen. Messung vom Produkt,
Gesamtaktivität und Aktivität pro ml. 
Für eine bestimmte Zeit (Start-15min) und nach einer Zeit (Stopp-5min)
Berechnung U/ml, weil

1)

ß-Galactosidase (= Lactase) katalysiert die Reaktion: Substratspezifisch und reaktionsspezifisch

ß-Galactosidase

Lactose + H2O ---------------------------> Glucose + D-Galactosid

Man misst Aktivität des Enzyms und Konzentration der Färbung.

oNPG + H2O --------------------------> Galactose + oNP (gelb im alkalischen Milieu)

O-Nitrophenol (oNP) ist ein Produkt bei der Spaltung, das gelb gefärbt ist (im alkalischen
Medium).

Es wird ein Phosphatpuffer verwendet. pH-Wert soll 6,5 sein.

Lässt es insgesamt 25 min mischen und stehenlassen (für die Entstehung der Farbe). Alle
Reaktionen laufen mit Wasser ab.

Es ist eine diskontinuierliche Reaktion, es wird incubiert. Läuft bei 30 °C.

Man misst die Extinktion bei 420 nm. Es wird nicht aufgenommen. Eines der Produkte oNP wird
gemessen und gefärbt.

oNPG-Lösung 2,00 ml
Phosphatpuffer 0,50 ml
mischen und auf 30°C temperieren
Enzymlösung 0,10 ml ---
Anastasija Jankovic BICB
mischen und genau 10min bei 30°C inkubieren
Na2CO3-Lösung 0,50
Enzymlösung --- 0,10 ml
mischen, 15min bei 25°C stehen lassen (Farbentwicklung);
bei 420nm Extinktion gegen Blindwert messen