Digital droplet PCR für das DNA-basierte Monitoring bei

Chronisch Myeloischer Leukämie

der medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Christian Stephan Albert
Als Dissertation genehmigt
von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 06. September 2022

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Markus F. Neurath

Gutachter/in: Prof. Dr. Markus Metzler

Prof. Dr. Thomas Gramberg
Diese Promotionsarbeit ist meinen Eltern Birgit und Georg Albert gewidmet. Für die bedingungslose
und stets liebevolle Unterstützung.
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung und Abstract ....................................................................................... 1
1.1. Zusammenfassung ..................................................................................................... 1
1.1.1 Hintergrund und Ziele ............................................................................................ 1
1.1.2 Material und Methoden .......................................................................................... 1
1.1.3 Ergebnisse ............................................................................................................ 2
1.1.4 Schlussfolgerungen und Diskussion ...................................................................... 2
1.2. Abstract ...................................................................................................................... 3
1.2.1 Background and goals ........................................................................................... 3
1.2.2 Material and methods ............................................................................................ 3
1.2.3 Results .................................................................................................................. 3
1.2.4 Conclusions and discussion .................................................................................. 4
2. Einleitung .......................................................................................................................... 5
2.1 Myeloproliferative Neoplasien ...................................................................................... 5
2.2 Chronisch myeloische Leukämie.................................................................................. 5
2.3 Chronisch myeloische Leukämie des Kindesalters....................................................... 6
2.3.1 Pathogenese ......................................................................................................... 6
2.3.2 Klinik und Symptome ............................................................................................. 8
2.3.3 Diagnostik.............................................................................................................. 8
2.3.4 Therapie ................................................................................................................ 9
2.3.5 Prognose ..............................................................................................................11
2.3.6 Monitoring.............................................................................................................11
2.4 Ziel der Doktorarbeit ...................................................................................................13
3. Material und Methoden .....................................................................................................15
3.1. Material ......................................................................................................................15
3.1.1 Patienten und Proben ...........................................................................................15
3.1.2 Primer und Sonden...............................................................................................15
3.1.3 Chemikalien und Reagenzien ...............................................................................17
3.2 Methoden ....................................................................................................................17
3.2.1 DNA-Isolation aus Blut- und Knochenmarkproben ................................................17
3.2.2 Realtime-PCR ......................................................................................................18
3.2.3 Digitale droplet PCR (ddPCR) ..............................................................................19
3.3 Statistische Auswertung ..............................................................................................21
4. Ergebnisse .......................................................................................................................22
4.1 Auswertung der individuellen Messungen ...................................................................22
4.2. Einfluss und Auftreten bruchpunktnaher repeat-Sequenzen.......................................24
4.3 Optimierung durch Einsatz von double-quenched Sonden ..........................................26
 4.4 Entwicklung der large amplicon ddPCR ......................................................................27
4.5 Vergleich von RQ- und large amplicon ddPCR............................................................29
5. Diskussion ........................................................................................................................33
Anhang .................................................................................................................................41
Literaturverzeichnis ..............................................................................................................41
Abkürzungsverzeichnis.........................................................................................................47
Abbildungsverzeichnis ..........................................................................................................48
Tabelle Repeat-Sequenzen ..................................................................................................49
Danksagung .........................................................................................................................51
1. Zusammenfassung und Abstract

1.1. Zusammenfassung
1.1.1 Hintergrund und Ziele
Die chronisch myeloische Leukämie (CML) des Kindesalter hat den selben
Pathomechanismus wie die des Erwachsenenalters, die Neubildung des BCR-ABL1
Fusionsgens, das auf dem sogenannten Philadelphia-Chromosom t(9;22)(q34;q11) liegt. Das
BCR-ABL1 Fusionsgen kodiert eine Tyrosinkinase, die zur unkontrollierten Zellproliferation
führt und gleichzeitig den Ansatz der targeted therapy mit Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI)
darstellt. Allerdings sind die klinischen Herausforderungen andere. Zum einen zeigen sich
aufgrund des medianen Erkrankungsalters von 11,6 Jahren spezifische Nebenwirkungen der
TKI-Therapie, zum anderen wird insgesamt ein aggressiverer Verlauf beobachtet. Zudem
fehlen Langzeitstudien in der Behandlung mit TKIs die über 15 Jahre hinausreichen. Die
Expression des BCR-ABL1 Fusionsgens, also das BCR-ABL1 Transkript, wird routinemäßig
im Monitoring der minimal residual disease (MRD) verwendet. Nach langanhaltender tiefer
molekularer Remission wurden bei der CML des Erwachsenen bei Auslassversuchen der TKI-
Dauertherapie Erfolgsraten von bis zu 50% erreicht. Retrospektive Quantifizierungen der DNA
des Fusionsgens in Patienten mit CML-Rezidiv unter TKI-Auslass wiesen dabei BCR-ABL1
DNA positive Zellen nach, obwohl die mRNA nicht nachgewiesen werden konnte. Eine
standardmäßige Quantifizierung der DNA wurde bis jetzt aufgrund des höheren technischen
Aufwands nicht durchgeführt. Eine hohe Dichte an repeat-Sequenzen im oder in der Nähe des
Bruchpunkts erschwert Umsetzung dieser Monitoringmethode im Hinblick auf die Spezifität
des PCR-Assays. Im Rahmen dieser Dissertationsarbeit soll gezeigt werden, dass die large
amplicon ddPCR ein zuverlässiges, hoch-sensitives DNA-basiertes MRD-Monitoring der
pädiatrischen CML ermöglicht.

1.1.2 Material und Methoden

Es wurden insgesamt 260 Blut- und Knochenmarkproben von 15 Patienten untersucht und die
MRD der CML mittels DNA-Quantifikation bestimmt. Im Mittel wurden pro Patient 17
Zeitpunkte über einen Zeitraum von 75 Monaten gemessen. Die Testung der Spezifität der
eingesetzten Primer wurde mit quantitativer real-time PCR durchgeführt. Die Quantifizierung
des BCR-ABL1 Fusionsgens erfolgt mittels digital droplet PCR. Bei 12 der 15 gemessenen
MRD-Verläufe wurden dabei double-quenchend Sonden eingesetzt. Die gemessenen Kopien
des BCR-ABL1 Fusionsgens wurde im zeitlichen Verlauf graphisch mit den Werten des
standardmäßig eingesetzten Verfahrens zur Bestimmung der MRD, der mRNA-basierten
Quantifizierung mittels quantitativer Reverse-Transkriptase PCR (RQ-PCR) aufgetragen und
verglichen. Zum statistischen Vergleich beider Parameter wurde sich der Korrelation nach
Spearman benutzt.
1
1.1.3 Ergebnisse
Durch die durchgeführten Optimierungen der ddPCR konnten alle untersuchten
Patientenverläufe und 253 der 260 Proben erfolgreich quantifiziert werden. Die wenigen
Ausfälle sind auf den Einfluss von Heparin zurückzuführen. Der Einsatz von double-
quenchend Sonden erwies sich als deutlich vorteilhaft gegenüber single-quenched Sonden.
Vor allem die deutliche Reduktion falsch positiver droplets durch die eingesetzten Sonden
erhöhte die Spezifität der Assays. Die ddPCR wurde zu einer large amplicon ddPCR
weiterentwickelt, um den negativen Einfluss der bruchpunktnahen repeat-Sequenzen auf die
Spezifität zu umgehen. Das PCR-Amplifikat betrug bei 7 der 15 Patienten eine Länge von über
200 bp. Das längste Amplifikat bestand aus 401 bp. Die Amplitudendifferenzen zwischen
negativen und positiven droplets korrelierten nicht mit der Amplifikatslänge. Im Vergleich mit
dem mRNA-basierten Monitorings zeigte sich mit zunehmender Amplifikatslänge keine
Einschränkung der Sensitivität, während sich die Ergebnisse der Quantifikationen gut deckten.
Bei 31 Messungen wies die ddPCR ein signifikant höheres Vorkommen der BCR-ABL1 DNA
auf als die Analyse der Transkripte im niedrig positiven Bereich (<10-4) erwarten ließ. Die RQ-
PCR fand an 11 Zeitpunkten höhere Messwerte. Im direkten Vergleich der Quantifikationen
der mRNA und der DNA betrug die Korrelation nach Spearman 0,47.

1.1.4 Schlussfolgerungen und Diskussion

Ein kombiniertes molekulares Monitoring von DNA und mRNA erwies sich als sehr viel
aussagekräftiger, wenn es darum geht Patienten für eine Therapiepause auszuwählen und
deren Wahrscheinlichkeit für eine anhaltende therapiefreie Remission abzuschätzen. Das
macht eine funktionierende DNA-Quantifikation umso wichtiger. Im Vergleich der Transkript-
Quantifikation mittels real-time qPCR und digital PCR zeigte sich die letztere wiederholt als
sensitiver und robuster gegenüber Inhibitoren. Die spezifischen Vorteile eines DNA-basierten
Monitorings der CML-MRD sind die Detektion transkriptionsinaktiver Leukämiezellen und
höhere zeitliche Stabilität der DNA als verwendeter Biomarker. Diese Probleme in der
technischen Umsetzung einer Fusionsgenquantifikation konnten mithilfe der
Weiterentwicklung der ddPCR zu einer large amplicon ddPCR (laddPCR) und dem Einsatz
von double-quenched Sonden erfolgreich gelöst werden. Mit Vergrößerung des Amplifikats
war hier keine Verminderung der Sensitivität festzustellen und es konnte in der vorliegenden
Arbeit für alle eingeschlossenen CML Patienten ein hoch-sensitives DNA-basiertes MRD-
Assay etabliert werden. Somit konnten die Vorteile eines DNA-basierten Monitoring mit denen
einer digital droplet PCR kombiniert werden. Ein standardmäßiger Einsatz eines DNA-
basierten MRD-Monitorings bei chronisch myeloischer Leukämie ist man damit einen Schritt
nähergekommen.

2
1.2. Abstract
1.2.1 Background and goals
Pediatric chronic myeloid leukemia (CML) shares the same pathomechanism as adult CML,
the formation of the BCR-ABL1 fusion gene located on the so-called Philadelphia chromosome
t(9;22)(q34;q11). The BCR-ABL1 fusion gene encodes a tyrosine kinase that leads to
uncontrolled cell proliferation and is also the approach of targeted therapy with tyrosine kinase
inhibitors (TKIs). However, the clinical challenges are different. On the one hand, specific side
effects of TKI therapy are apparent due to the median disease age of 11.6 years, and on the
other hand, a more aggressive progress is observed overall. In addition, long-term studies in
treatment with TKIs extending beyond 15 years are lacking. The expression of the BCR-ABL1
fusion gene, i.e., the BCR-ABL1 transcript, is routinely used in minimal residual disease (MRD)
monitoring. After prolonged deep molecular remission, discontinuation of TKI therapy has
shown relapse free survival up to 50% in adult patients. Retrospective quantification of fusion
gene DNA in patients with CML relapse under TKI discontinuation thereby detected BCR-ABL1
DNA positive cells, allthough mRNA was not detected. Standard quantification of DNA has not
been performed so far due to the higher technical effort. A high density of repeat sequences
in or near the breakpoint complicates the implementation of this monitoring method with regard
to the specificity of the PCR assay. In this dissertation, we will demonstrate that large amplicon
ddPCR enables reliable, highly sensitive DNA-based MRD monitoring of pediatric CML.

1.2.2 Material and methods

A total of 260 blood and bone marrow samples from 15 patients were examined and the MRD
of CML was determined by quantification of DNA. On average, 17 time points were measured
per patient over a period of 75 months. Testing of the specificity of the primers used was
performed with quantitative real-time PCR. Quantification of the BCR-ABL1 fusion gene was
performed by digital droplet PCR. Double-quenched probes were used in 12 of the 15 MRD
courses measured. The measured copies of BCR-ABL1 fusion gene were graphically plotted
over time and compared with the values of the standard method used to determine MRD,
mRNA-based quantification by quantitative reverse transcriptase PCR (RQ-PCR). Spearman's
correlation was used for statistical comparison of both parameters.

1.2.3 Results
Due to the performed optimizations of the ddPCR, all examined patient courses and 253 of the
260 samples could be successfully quantified. The few failures were due to the influence of
heparin. The use of double-quenched probes proved to be clearly advantageous over single-
quenched probes. In particular, the significant reduction of false positive droplets by the probes
used increased the specificity of the assays. The ddPCR was further developed to a large
amplicon ddPCR to avoid the negative influence of near breakpoint repeat sequences on

3
specificity. The PCR amplicon was longer than 200 bp in 7 of the 15 patients. The longest
amplicon consisted of 401 bp. Measured amplitude distinction between negative and positive
droplets did not correlate with amplicon length. Compared with mRNA-based monitoring, there
was no reduction in sensitivity with increasing amplicon length, while the quantification results
were in good agreement. In 31 measurements, ddPCR showed a significantly higher
occurrence of BCR-ABL1 DNA than expected from the analysis of transcripts in the low-
positive range (<10-4). RQ-PCR found higher readings at 11 time points. In a direct
comparison of the quantifications of mRNA and DNA, the Spearman's correlation was 0.47.

1.2.4 Conclusions and discussion

Combined molecular monitoring of DNA and mRNA proved to be superior when it comes to
selecting patients for a therapy cessation and assessing their probability of sustained therapy-
free remission. This makes a functional DNA quantification all the more important. When
comparing transcript quantification by real-time qPCR and digital PCR, the latter was
repeatedly shown to be more sensitive and robust to inhibitors. The specific advantages of
DNA-based monitoring of CML-MRD are the detection of transcriptionally inactive leukemia
cells and higher temporal stability of DNA as the used biomarker. The problems in the technical
implementation of a fusion gene quantification were successfully solved with the help of the
further development of ddPCR to a large amplicon ddPCR (laddPCR) and the use of double-
quenched probes. With enlargement of the amplicon, no decrease in sensitivity was observed
and a highly sensitive DNA-based MRD assay could be established for all included CML
patients in the present study. Thus, the advantages of DNA-based monitoring could be
combined with those of digital droplet PCR. A standard application of DNA-based MRD
monitoring in chronic myeloid leukemia is thus one step closer

4
2. Einleitung

2.1 Myeloproliferative Neoplasien

Die Gruppe der Myoproliferativen Neoplasien beschreibt Erkrankungen der blutbildenden
Stammzellen des Knochenmarks. Verschiedene Mutationen führen zu einer stark erhöhten
Proliferationsrate und damit zu erhöhten Zellzahlen der verschiedenen Zellreihen im
peripheren Blut [1, 2]. Die genetischen Unterschiede der betroffenen Stammzellen sind nicht
nur kausal für die Erkrankungen, sondern dienen auch deren Einteilung in verschiedene
Gruppen und ermöglichen spezifische Therapieansätze [3]. Grundsätzlich unterscheidet man
Philadelphia-Chromosom positive (Ph+) von Philadelphia-Chromosom negativen (Ph-)
Myeloproliferativen Neoplasien, obwohl in seltenen Fällen beide Mutationen auftreten können
[1, 4]. Zu den Ph- Neoplasien zählen die Polycythämia vera (PV), bei der eine hohe Zahl an
Erythrozyten im Vordergrund steht, die essentielle Thrombozythämie (ET) mit erhöhten
Thrombozytenzahlen und die primäre Myelofibrose (PMF), die durch einen bindegewebigen
Umbau des Knochenmarks eine insuffiziente Blutbildung aufweist. Die häufigsten Mutationen
dieser Erkrankungsgruppe liegen in absteigender Häufigkeit auf den Allelen der Janus Kinase
2 (JAK2), des Calreticulingens (CALR) oder des Thrombopoetinrezeptors (MLP) [2].

Die führende Erkrankung der Ph+ Neoplasien ist die chronisch-myeloische Leukämie (CML),
bei der Stammzellen der Granulozyten die namensgebende chromosomale Translokation
t(9;22)(q34;q11) aufweisen, das sogenannte Philadelphia-Chromosom. Das Philadelphia-
Chromosom war die erste genetische Veränderung, deren Kausalität erfolgreich mit einer
Erkrankung assoziiert wurde. Neben der CML kann diese Mutation aber auch in Patienten mit
akuter lymphatischer Leukämie (ALL) gefunden werden [4, 5].

2.2 Chronisch myeloische Leukämie

Die CML ist eine Erkrankung, die mit einem Altersgipfel von 55-60 Jahren, typischerweise den
Erwachsenen des fortgeschrittenen Alters betrifft. Die Inzidenz beträgt 1,2 bis 1,5/100 000
Einwohner in Deutschland [6, 7]. Bereits 1973 wurde zytogenetisch das Philadelphia-
Chromosom entdeckt, was die Grundlage zur Identifizierung des BCR-ABL1 Fusionsgens
darstellte. Damit wurde die CML die erste Erkrankung bei der die Theorie, dass eine
zytogenetische Veränderung die Entstehung von Leukämien verursacht, bestätigt werden
konnte [5].

Natürlicherweise wird ein dreiphasiger Krankheitsverlauf beobachtet, solange man nicht

therapeutisch eingreift. Die erste Phase ist die chronische Phase, bei der Patienten mit immens
hohen Leukozytenzahlen im peripheren Blut auffallen. Diese dauert im Median circa 3-4 Jahre

5
an [8]. In der akzelerierten Phase kann eine zunehmende Linksverschiebung der Leukozyten
mit Vorkommen von Blasten, evtl. eine Veränderung der Thrombozytenzahlen und eine
zunehmende Basophilie beobachtet werden. Die Blastenkrise stellt die dritte Phase dar und
entspricht im Prinzip der Transformation zur akuten Leukämie [9-11].

Mit der Entdeckung der Tyrosinkinaseaktivität von ABL1 bzw. des Fusionsproteins wurde die
Entwicklung der Pathogenese der CML weiter vorangetrieben. Daraufhin konnte in den späten
1990er Jahren die spezifische Therapie mit dem Wirkstoff Imatinib eingeführt werden. Imatinib
ist der erste Vertreter der sogenannten Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI), die gezielt die Aktivität
des entstandenen Onkoproteins hemmt. Diese Therapie verlängerte das mediane Überleben
der Erkrankten maßgeblich [5, 12, 13]. Auch ein Ansprechen auf TKI in weiter fortgeschrittenen
Phasen der Erkrankung kann beobachtet werden, wobei dieses Ansprechen von kürzerer
Dauer ist als das in der chronischen Phase [14].

2.3 Chronisch myeloische Leukämie des Kindesalters

Die CML macht 2% aller Leukämien bei Kindern unter 15 Jahren und 9% aller Leukämien bei
Jugendlichen zwischen 15 und 19 Jahren aus. Die jährliche Neuerkrankungsrate beträgt 1
bzw. 2,2 Fälle pro 1 Million in diesen beiden Altersgruppen [15]. Viele Aspekte, wie zum
Beispiel Therapie und die Mechanismen der Krankheitsentstehung werden von erwachsenen
CML Patienten übernommen. Die CML des Kindesalters stellt allerdings nicht nur
epidemiologisch eine andere Erkrankung als die des Erwachsenenalters dar. Studien zeigten,
dass sich die CML des Kindes und Jugendlichen bei Diagnose klinisch und im Progress
aggressiver präsentiert [16, 17]. Auch molekulargenetisch zeigt sich zwar die typische
chromosomale Translokation, allerdings stellte sich heraus, dass die Bruchpunkte des
Fusionsgens anders konfiguriert sind [18, 19]. Eine Langzeittherapie mit TKIs muss bei
Kindern und Jugendlichen aufgrund der möglicherweise fast lebenslangen Therapiedauer
nochmals unter anderen Aspekten betrachtet werden [20-22].

2.3.1 Pathogenese
Entscheidend für die Entstehung der CML ist die reziproke Translokation zwischen dem ABL1-
Protoonkogen auf Chromosom 9 und dem BCR-Gen auf Chromosom 22. Dadurch entsteht ein
neues BCR-ABL1 Fusionsgen, das auf dem sogenannten Philadelphia-Chromosom
t(9;22)(q34;q11) liegt [8]. ABL1 ist eine Tyrosinkinase, die durch Einfluss von
Wachstumsfaktoren und Adhäsionsrezeptoren die Organisation des Zytoskeletts direkt und
indirekt beeinflussen kann, während BCR ein Signalprotein kodiert [23]. Im Mausmodell konnte
nachgewiesen werden, dass die Expression von BCR-ABL1 in CD34+ Zellen eine gesteigerte
Proliferation in Abhängigkeit von Wachstumsfaktoren, aber auch ein erhöhtes

6
wachstumsfaktorunabhängiges Überleben zeigt [24]. CD34 ist ein membranständiger Marker
von diversen, unter anderem hämatopoetischen, Progenitorzellen [25]. In Einzelfällen sind
schon pränatale Gendefekte beschrieben, die einer leukämischen Erkrankung auslösen
können [26]. Die Aktivität der Tyrosinkinasefunktion ist essenziell für die Leukogenese von
BCR-ABL1. Wird die Kinasedomäne inaktiviert zeigt sich im Zellmodell keine
Leukämieentwicklung [8]. Allerdings reicht eine reine Aktivierung von ABL1, zum Beispiel
durch Deletion der SH3 Domäne, nicht aus, um CML-ähnliche Entwicklungen auszulösen. Die
Mutation der SH3 Domäne erhöht zwar die Aktivität der Tyrosinkinaseaktivität und führt in vitro
zur Transformation von Fibroblasten und hämatopoetischen Stammzellen. Im Mausmodell
entsteht dadurch aber keine CML, sondern lymphoide Leukämien oder Lymphome [8, 27, 28].

Eine weitere essenzielle Domäne BCRs für dessen myeloproliferativen Effekt ist die amino-
terminale coiled coil Oligomerisation [29, 30]. Es stellte sich heraus, dass die Induktion einer
myeloproliferativen Erkrankung im Mausmodell nur dann folgt, wenn entweder die amino-
terminale coiled coil Oligomerisation oder eine Punktmutation der SH3-Domäne vorhanden
war [31].

Die Analyse der DNA-Sequenz der rekombinanten Stellen in von sowohl benignen als auch
malignen Zellreihen der Blutbildung hat maßgeblich dazu beigetragen die zugrundeliegenden
zellulären Mechanismen zu der Blutbildung und den Vorgang der Rekombination selbst zu
verstehen [18]. Die Bruchpunkte chromosomaler Translokationen leukämischer Zellen, welche
von unreiferen Vorläuferzellen ausgehen, erweisen sich als größtenteils sequenzunabhängig.
Die Ausnahme bilden die in therapie-assoziierter akuter lymphatischer Leukämie und akuter
myeloischer Leukämie vorkommenden Topoisomerase II-assoziierten MLL Translokationen
[18, 32]. Repeat-Sequenzen, insbesondere Alu-repeat, scheinen einen Einfluss auf die Bildung
chromosomaler Translokationen zu haben, da ein gleichzeitigkeites Auftreten von breakpoint
clustern und repeat-Regionen beobachtet wurde [26].

Die Sequenzierung und der Vergleich zwischen Bruchpunkten von pädiatrischen und
erwachsenen CML-Patienten wies deutliche Unterschiede in der Verteilung der Bruchpunkte
auf. Die Bruchpunkte verteilten sich in ABL1 uniform in Intron 1, während sie sich in BCR
bimodal zwischen Exon 13 oder 14 und Intron 14 verteilen. Die in Fällen der pädiatrischen
CML gefundenen Bruchpunkte ähnelten damit eher denen von ALL-Patienten im
Erwachsenenalter [33].

Sowohl in BCR (39%) als auch in ABL1 (68%) fand sich eine hohe Zahl der Bruchpunkte in
der unmittelbaren Nähe oder in repeat-Regionen. Allerdings war die Frequenz der Nähe zu
repeats nur in BCR signifikant höher als erwartet, was auch auf die sehr hohe repeat-Dichte
von ABL1 zurückgeführt werden könnte. Die Bruchpunktanalyse fand keine weiteren DNA-
Motive, die mit Rekombination assoziiert werden, wie zum Beispiel Topoisomerase II-
7
Bindungsstellen oder Chi-like Sequenzen. Bei den repeat-Regionen handelt es sich
größtenteils um Alu-repeat Sequenzen. Zusammenfassend konnten Unterschiede in der
Verteilung der Bruchpunkte in erwachsenen und pädiatrischen Patienten gezeigt werden [18].

2.3.2 Klinik und Symptome

Charakteristischerweise präsentieren sich betroffene Patienten bei Diagnose mit
Splenomegalie und deutlich erhöhten Werten von Leukozyten. Außerdem werden Anämien
und das Auftreten von vereinzelten Leukoblasten im peripheren Blut beobachtet [16, 20].
Selten treten Symptome einer Leukostase auf. Diese wird durch extrem hohe
Leukozytenzahlen bedingt und führt zu Gefäßverschlüssen mit den, das betroffene Organ
entsprechenden, Funktionsausfällen, wie zum Beispiel Sehstörungen oder Priapismus. Die
Höhe des Leukozytenanstiegs korreliert ebenfalls mit dem Ausmaß der Splenomegalie [34,
35]. Im Allgemeinen wird der Verlauf der Erkrankung in drei Phasen unterteilt, die chronische
Phase, die akzelerierte Phase und die Blastenphase oder -krise.

Die zuvor beschriebenen Symptome beziehen sich vor allem auf die chronische Phase. Die
akzelerierte Phase wird z.B. durch ein vermindertes Ansprechen auf TKIs oder eine stärkere
Linksverschiebung der Leukozyten im Blutbild mit höherem Vorkommen an Vorläuferzellen im
peripheren Blut gekennzeichnet. Neben zusätzlichen genetischen Veränderungen kann eine
deutliche Basophilie oder stark ausgeprägte Thrombozytose bzw. eine Thrombopenie
beobachtet werden.

Die Blastenkrise ist durch eine stark erhöhte Blastenzahl im peripheren Blut (oder
extramedullären Blastenproliferation) gekennzeichnet und gleicht damit im klinischen
Erscheinungsbild und Aggressivität dem einer akuten myeloischen Leukämie [36].

2.3.3 Diagnostik
Um die Erstdiagnose einer pädiatrischen CML zu stellen, wird nach Anamnese und
körperlicher Untersuchung (Milz- und Lebergröße) ein Differentialblutbild angefertigt. Aus dem
peripheren Blut wird eine Multiplex-PCR auf BCR-ABL1 Transkripte durchgeführt. Darüber
hinaus ist eine Knochenmarkaspiration und -biopsie notwendig. Das Knochenmarkaspirat wird
sowohl zytologisch als auch zytogenetisch untersucht. Zur Komplettierung der Diagnostik ist
eine Feststellung extramedullärer Manifestationen nötig, so wie der Nachweis des
Fusionsgens und eventueller weiterer chromosomaler Veränderungen [37, 38].

2.3.3.1 Zytogenetik
Mittels zytogenetischer Untersuchungen können schon seit Langem spezifische
Veränderungen des menschlichen Genoms dargestellt werden. Der Vorteil zytogenetischer
Diagnostik besteht darin, dass der Erfahrungsschatz mit den entsprechenden Methoden sehr
hoch ist. Allerdings können dabei nur strukturelle und numerische Chromosomenaberrationen
8
detektiert werden. Im Falle der CML wird eine Metaphasen-Analyse auf Ph+-Zellen
durchgeführt, mit der im Verlauf das zytologische Ansprechen gemonitort werden kann. Die
Interphasen-FISH sollte nur zur initialen Diagnosestellung verwendet werden [37, 39].

Bei der FISH werden mit den gesuchten Genomabschnitten komplementäre

Nukleinsäurestränge, meist DNA, mit verschiedenfarbigen Sonden markiert. Unter einem
Mikroskop kann dann das Vorkommen und die Anordnung der gesuchten Abschnitte leicht
detektiert und ausgewertet werden. Am Beispiel des Philadelphia-Chromosoms wird bei den
durch die Translokation betroffenen Stellen eine benachbarte Lage angefärbter Abschnitte von
BCR und ABL1 nachgewiesen, die im Gesunden auf verschiedenen Chromosomen liegen [20,
36, 37, 40].

2.3.4 Therapie
2.3.4.1 Zytoreduktion und kurativer Ansatz
Vor der Ära der targeted therapy mit TKIs wurden vor allem klassische Chemotherapeutika,
also zytotoxische Substanzen wie Cyclophosphamid oder Hydroxyurea, genutzt, um der
massiven Leukozytose entgegenzuwirken. Diese Substanzen sind stark
nebenwirkungsbehaftet und werden heute nicht mehr als Erstlinientherapie bei CML Patienten
eingesetzt.

Einen kurativen Ansatz bietet bis jetzt nur die allogene Stammzelltransplantation, die aufgrund
des hohen Therapierisikos nur bei Fällen von Therapieresistenz unter TKI oder einem
genetischem Hochrisikoprofil bevorzugt wird. Kommt es zu einer Blastenkrise muss ebenfalls
der Schritt einer allogenen Stammzelltransplantation erwogen werden [20, 41]. Zwar
verbesserte sich das 5-jahres Überleben von allogen Stammzelltransplantierten Patienten in
den letzten Jahrzehnten deutlich auf durchschnittlich ca. 90%, allerdings wurde wiederholt
gezeigt, dass im Vergleich mit gleichaltrigen die Morbidität und Mortalität auf längere Sicht
deutlich höher ist. Ursachen dafür sind z.B. Einschränkungen des Immunsystems und der
endokrinen Funktion sowie chronische graft-versus-host Reaktion mit dessen Folgen [42-44].
Somit handelt es sich hierbei heute um eine third-line Therapie.

2.3.4.2 Tyrosinkinaseinhibitoren
Die Einführung von Imatinib als TKI hat die Therapie der chronisch myeloischen Leukämie
revolutioniert. Die Gruppe der TKIs zielt spezifisch darauf ab die Tyrosinkinaseaktivität des
BCR-ABL1 Fusionsproteins zu verringern und damit die von der Chromosomenaberration
betroffen Zellen in ihrer Proliferationsrate zu verlangsamen oder sogar in einen Ruhezustand
zu versetzen. Imatinib war der erste Vertreter dieser Gruppe und ist auch heute immer noch
Mittel der ersten Wahl als Dauertherapie [45-47]. Selbst in fortgeschrittenen Phasen sprechen
Patienten meist zunächst gut auf TKIs an. Neuere Vertreter sind Nilotinib und Dasatinib, deren

9
Einsatz bei Erwachsenen schon längere Zeit dem von Imatinib gleichgestellt wurde. Bei
pädiatrischen Patienten folgte nun eine Zulassung. Allerdings verfolgt diese Therapie
grundsätzlich keinen kurativen Ansatz, was bei Kindern und Jugendlichen aufgrund des jungen
Erkrankungsalters zu einer langen Therapiedauer führen kann. Insgesamt ist das Ansprechen
auf die TKIs bei Kindern und Jugendlichen etwas geringer als das der erwachsenen CML-
Patienten [36, 48]. Es wird diskutiert, dass vor allem zusätzliche Mutationen die Wirkung von
Imatinib einschränken können [49]. Diese beobachteten Resistenzen bedeuten nicht nur eine
nicht mehr wirksame Therapie, sondern bedeuten auch eine höheren Wahrscheinlichkeit für
eine Akzeleration bzw. Blasenkrise [50].

Diese Probleme waren die ausschlaggebenden Gründe zur Entwicklung der bereits genannten
TKIs der zweiten Generation und mittlerweile auch dritten Generation, das sogenannte
Ponatinib. Die Weiterentwicklungen zeigen eine biochemisch deutliche stärkere Bindung an
das Fusionsprotein von BCR-ABL1 [47]. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass bekannte
Mutationen, die mit einer Imatinib-Resistenz einhergehen, weniger nachteilige Auswirkung auf
die Wirksamkeit der jüngeren Substanzen hat [47, 51].

Allerdings zeigen sich gerade in Kindern auch deutliche Nebenwirkungen und Risiken der
Therapie mit TKIs. Zunächst ergibt sich durch das junge Diagnosealter der Patienten eine
potenziell jahrzehntelange Therapie. Vor allem konnte in mehrfachen Studien aber eine
signifikante Verzögerung des Längenwachstums belegt werden. Das schränkt nicht nur die
Lebensqualität der Patienten erheblich ein, sondern kann die Compliance senken [52-55].
Zusätzlich sind spezifische Nebenwirkungen in heranwachsenden Patienten zu beachten wie
eine mögliche Teratogenität oder anhaltende negative Auswirkung auf die Fertilität [20, 56-
58]. Außerdem ist eine zunehmende Resistenz und Intoleranzbildung mit zunehmender
Einnahmedauer zu erwarten. [59, 60]. Immer noch fehlen Daten über eine Therapie mit
Imatinib über 15 Jahre hinausgehend, so dass die Aussage über weitere Langzeitfolgen nicht
zu treffen ist [20].

2.3.4.3 Therapieauslass
Bereits mehrere Studien belegten bei Erwachsenen, dass bei anhaltender tiefer molekularer
Remission, welche als Nachweis von BCRL-ABL1 < 0,1% über die letzten 2 Jahre definiert ist,
der Auslass der TKI eine mögliche Therapieoption darstellt. Vor allem dann, wenn gleichzeitig
unerwünschte Arzneimittelwirkungen oder eine hohe finanzielle Belastung bestehen.
Tatsächlich zeichnet sich ab, dass bei dieser Patientenselektion im Erwachsenenalter circa
50% nach einem Jahr noch in molekularer Remission verbleiben. Dies gilt sowohl für Imatinib
als mittlerweile auch für Substanzen der zweiten TKI-Generation. Außerdem konnte gezeigt
werden, dass die Wiedereinnahme der pausierten Substanzen bei Verlust der tiefen
molekularen Remission die gleichen Wirkungsraten aufweist wie bei Therapiebeginn [61, 62].
10
Bei der deutlich kleineren Kohorte der Patienten mit CML des Kindesalters ist die Studienlage
entsprechend schwieriger. Zwar ist aufgrund der bereits genannten Nebenwirkungen und
teilweise unklaren Langzeitfolgen eine Therapieunterbrechung der TKIs von großem
Interesse. Allerdings wurden bisher nur wenige Studien zu diesem Thema durchgeführt. Diese
Studien wurden bei einzelnen Patienten mit persistierender vollständiger molekularer
Remission und, nach der Risikostratifizierung der adulten CML, niedrigem Risikoprofil
durchgeführt [63, 64]. Es zeigte sich allerdings, dass nur ein kleiner Teil der Patienten weiterhin
keinen Anstieg der minimal residual diesase (MRD) hatte. De Bruijn et al. zeigte, dass 4 von
14 Patienten über einen Überwachungszeitrum von 24 bis 66 Monaten ohne molekulares
Rezidiv blieben [65]. Die Rezidive zeigten sich bei allen Kindern, ähnlich den Erwachsenen, in
den ersten sechs Monaten nach Therapieunterbrechung. Suttorp et al.. berichtete ebenfalls
von sieben Kindern, von denen nur zwei nach Unterbrechung von Imatinib jeweils 42 und 62
Monate in kompletter molekularer Remission blieben. Die restlichen fünf Kinder zeigten
frühzeitige Rezidive nach 3, 4, 7, 12 und 26 Monaten [66].

2.3.5 Prognose
Dass es sich bei der pädiatrischen CML um eine oftmals aggressivere Erkrankung, also mit
mehr Potential für eine Akzelleration und Blastenkrisen, handelt, konnte bereits mehrfach
gezeigt werden [20, 36, 48]. Umso wichtiger ist damit eine Einschätzung des Risikoprofils der
einzelnen Patienten. Bei einem ungünstigen Risikoprofil könnte zum Beispiel eine frühzeitige
allogene Stammzelltransplantation in Erwägung gezogen werden [20, 41]. Ein frühes
zytogenetisches und molekulares Therapieansprechen korreliert bei Erwachsenen stark mit
dem Langzeitüberleben. Dies konnte bei der pädiatrischen CML in Bezug auf ein molekulares
Ansprechen nach drei Monaten ebenfalls belegt werden [67]. Bereits vor der Therapieära mit
Imatinib wurden mehrere Prognosescores etabliert, wie zum Beispiel der Sokal oder EUTOS-
Score. Die bereits bestehenden Scores erwiesen sich aber als nicht ausreichend bei Kindern,
obwohl sie durchaus Zusatzinformationen zu Prognosestellung geben können [20, 68, 69].

2.3.6 Monitoring
Routinemäßiges Monitoring ist essenziell, um den Krankheitsverlauf unter Therapie und damit
den Therapieerfolg zu bestätigen und eine Progredienz der Erkrankung frühzeitig zu erkennen.
Ein initial gutes Ansprechen auf die TKI-Therapie kann nur bedingt eine dauerhafte Wirkung
voraussagen [20, 36, 40, 70]. Zusätzlich zur Aufklärung der Pathomechanismen der
rekombinanten Genome können die einzigartigen Bruchpunkte der betroffenen Klone als
patientenspezifische Marker und zur Quantifikation der minimal residual disease (MRD)
verwendet werden. Die Standardmethode ist dabei die quantitative reverse Transkription PCR
(RQ-PCR) des Transkripts des Philadelphia-Chromosoms [40, 71].

11
2.3.6.1 mRNA basiertes Monitoring
Die Verwendung der quantitativen Reverse-Transkription PCR (RQ-PCR) als verlässliches
Monitoring des Krankheitsverlaufs unter TKI-Therapie ist die etablierte Methode in der
Routinediagnostik. Die qPCR misst die Kopienzahl der mRNA, also der Transkripte, des BCR-
ABL1 Fusionsgens. Um eine vergleichbare Aussage zu ermöglichen, wird diese Kopienzahl
dann als Quotient in Bezug auf ein ausgewähltes Kontrollgen ausgedrückt [37, 40]. Dies erklärt
die Wichtigkeit der Identifizierung des Fusionstranskripts und nicht nur die des Philadelphia-
Chromosoms selbst. In Abhängigkeit des Abfalls der BCR-ABL1 Transkripte und dessen
Verlauf wird ein adäquates Ansprechen der Therapie mitdefiniert. Ein großer Vorteil des
mRNA-basierten Monitoring ist die Standardisierbarkeit über viele Laboratorien. Da diese
Methode des Monitorings am weltweit am weitesten verbreitet ist, wurde zur internationalen
Vergleichbarkeit eine Standardisierung durch die Einführung der sogenannten international
scale angestrebt. Man vereinheitlichte die PCR-Protokolle und einigte sich auf ABL1 als
internes Kontrollgen [72, 73]. So konnten festgesetzte Primer und Sondensets etabliert werden
[74, 75]. Standardmäßig wird bei Konstruktion der PCR-Assays einer RQ-PCR eine
Produktlänge von 70-150 bp angestrebt, da das Fluoreszenzsignal mit der Länge des
Amplicons abnimmt. Vor allem wenn ein Protokoll ohne Sonde eingesetzt wird. Allerdings
zeigte sich im Zusammenhang mit oben genannten Auslassversuchen, dass die Aussagekraft
der Realtime-PCR begrenzt ist. Eine mögliche Erklärung dieser Diskrepanz ist, dass die
Philadelphia-Chromosom positiven Zellen durch die lange und wirksame Therapie mit TKIs die
Transkription von BCR-ABL1 und die damit einhergehende Proliferation der betroffenen Zellen
einstellten. Damit erscheinen solche Zellen als falsch negativ in der Messung der residual
disease, solange nur die Genexpression gemessen wird.

2.3.6.2 DNA basiertes Monitoring

Erste Studien bei sowohl erwachsenen als auch pädiatrischen Patienten setzten zusätzlich ein
DNA-basiertes MRD Monitoring ein [64, 66, 76, 77], da die Quantifikation der DNA sich zum
einen auf den zeitstabileren Biomarker bezieht und zum anderen eine Abschätzung der BCR-
ABL1 positiven Zellen ermöglicht, die unabhängig von der mRNA Expression ist [75, 78]. Als
vorteilhafte Methode der DNA-Quantifikation stellte sich die digital droplet PCR heraus. Bei
dieser Methode wird die PCR in tausende von Lipidmembranen umgebene Tröpfchen
unterteilt, wodurch einzelne kleineste Reaktionsräume entstehen, die dann einzeln auf ein
positives Fluoreszenzsignal ausgewertet werden [79-81]. Standardmäßig werden bei
Entwicklung der Primer eine Amplifikatlänge von 60-200 bp empfohlen. Damit konnten zum
Beispiel selbst bei erfolgreichen TKI-Stopps niedrige Zellzahlen mit Nachweis des
Fusionsgens mittels quantitativer PCR nachgewiesen werden, wo keinerlei mRNA positiv
quantifiziert wurde. Somit konnten noch DNA-positive Zellen nachgewiesen werden, die
nachweislich keine Transkription mehr durchführten, weshalb eine Messung der mRNA
12
negativ blieb. Damit kann die DNA-basierte quantitative PCR eine Ergänzung in der
Entscheidung eines möglichen TKI-Auslasses darstellen [74, 76, 77, 82-85]. Der größte
Unterschied zwischen den o.g. PCR-Methoden ist die Kinetik der Messmethoden. Die RQ-
PCR weist eine hohe Dynamik auf, da die Fluoreszenz in Echtzeit gemessen wird und damit
ein breites Messspektrum des untersuchten Biomarkers erfassen kann. Die ddPCR
unterscheidet die einzelnen droplets qualitativ, während sich die Quantität rechnerisch
erschließen lässt. Dadurch wird die Sensibilität zwar erhöht. Der zeitliche Aspekt geht dabei
aber verloren.

Allerdings gibt es im Einsatz des Fusionsgens als Biomarker auch Nachteile. Da anders als
beim Transkript die Fusionsgene einen einzigartigen genomischen Bruchpunkt aufweist, muss
für jeden einzelnen Patienten ein komplettes Assay der breakpoint cluster region etabliert
werden, um eine spezifische PCR durchführen zu können [76]. Im Fall der CML des
Kindesalters kommt noch erschwerend hinzu, dass um die Bruchpunkte von BCR-ABL1
vermehrt repeat-Regionen vorkommen. Diese liegen zu 39% in BCR und zu 68% in ABL1 [33].
Diese hohe Frequenz und Nähe zum charakteristischen Bruchpunkt erschwert die
Identifizierung eines hochspezifischen PCR-Assays und damit die Quantifizierung der DNA-
Proben deutlich, da diese unspezifische Basenfolgen aufweisen. Setzt man die Primer in diese
Regionen, sind unspezifische PCR-Produkte das Ergebnis, die keine verlässliche Aussage
über die Quantität des eigentlichen Zielgens, bzw. Genabschnitts, erlauben [33, 86]. Dieses
Problem der Umsetzbarkeit soll in dieser Arbeit weiter untersucht werden.

2.4 Ziel der Doktorarbeit

Die DNA-basierte Quantifikation mittels digitaler droplet PCR (ddPCR) konnte bis jetzt nicht
standardmäßig eingesetzt werden, sondern wurde nur in Einzelfällen erfolgreich durchgeführt.
In diesen Fällen zeigte sich dabei eine hohe Sensitivität. So konnte das Vorkommen des
Fusionsgens wiederholt bei Patienten mit nicht mehr nachweisbarer mRNA bewiesen werden.
Falls diese Methode standardmäßig eingesetzt werden kann, würde diese die Grundlage zur
Entscheidungsfindung über einen möglichen Therapieauslass von TKIs ergänzen.

Grund für den fehlenden routinemäßigen Einsatz DNA-basierten Monitorings ist der damit
verbundene technischen Aufwand, da für jeden einzelnen Patienten ein individuelles PCR-
Assay notwendig ist. Zusätzlich erschwert die hohe Anzahl an unspezifischen repeat-
Regionen, die im und um den Bruchpunkt des Fusionsgens der CML Patienten vorkommen,
die Umsetzung dieser Monitoringmethode zusätzlich.

Das DNA-basierte Monitoring wurde insofern optimiert, dass die ddPCR zu einer large
amplicon ddPCR weiterentwickelt wurde und somit die Primer und ggf. die Sonden des PCR-
13
Assays für spezifische genomische Abschnitte außerhalb der repeats entwerfen zu können.
Hierfür wurde das BCR-ABL1 Fusionsgen in insgesamt 260 Blut- und Knochenmarksproben
mit zunehmend größer werdenden PCR-Amplifikaten quantifiziert. Die gemessene DNA wurde
als auf ein Kontrollgen bezogener Quotient mit der standardmäßig durchgeführten
Bestimmung der mRNA verglichen. Es soll im Rahmen dieser Dissertationsarbeit gezeigt
werden, dass die large amplicon ddPCR die Umsetzung des DNA-basierten Monitorings der
minimal residual disease der CML ermöglicht.

14
3. Material und Methoden

3.1. Material
3.1.1 Patienten und Proben
Tabelle 1 Die untersuchten Patienten und Länge des PCR-Amplifikats

Länge des
Alter bei CML- Quantifizierte ddPCR-
Diagnose in Quantifizierte Zeitspanne Amplifikats
Patient Geschlecht Jahren Proben pro Patient in Monaten in bp
UPN1 m 10 21 79 136
UPN2 w 15 13 92 99
UPN3 m 15 19 94 104
UPN4 w 7 28 98 126
UPN5 w 6 25 83 115
UPN12 m 17 17 66 98
UPN16 w 12 18 78 202
UPN17 m 14 15 54 127
UPN18 m 18 16 65 179
UPN21 m 5 12 83 338
UPN22 w 13 9 53 263
UPN23 m 8 20 79 401
UPN28 m 13 7 32 341
UPN33 w 13 16 68 329
UPN34 w 16 15 46 239

3.1.2 Primer und Sonden

3.1.2.1 Primer
Nach Sequenzierung des genomischen Bruchpunkts wurde dieser auf das Vorkommen von
repeat-Regionen untersucht und die Primer entsprechend so gewählt, das diese an
spezifische Sequenzen außerhalb der repeats binden.
Tabelle 2 verwendete Primer

Primername Basensequenz
UPN17_rv CAGCCAAGAATTTCAAAGATTAGC
UPN2_fw/UPN17_fw GCATCGCATGAGGTGCTG
UPN2_rv GGCTCTCTTACCCCAGACTGAC
UPN4_fw TGGTTGATGCCTTCTGGGTG
UPN4_rv CAAACTTCCGGAAACATGACC
UPN21_fw/UPN22_fw TGGTAACACATGAGTTGCACTG
UPN21_rv GTGCTGAGAAAGAGAAGCAATC
UPN16_fw CTGCATCCCTGCATCTCC
UPN16_rv TTAGACTATTGGAAACAACTGAATGC
UPN12_fw CGACTTCTCCAGCACTGAGC

15
 UPN12_rv CCCCCAAAACAATAAAATCAC
UPN1_fw GTCACCTGCCTCCCTTTCC
UPN1_rv TCTGTTACCCAGGCTGAAATCC
UPN3_fw TGGGGAAACAGGGAGGTTG
UPN3_rv CTTGGAGTTCCTTGAAATTCTTGG
UPN18_rv TGACACATTAGCAGTGGGAAGC
UPN18_fw GCTAGGCAGTGGGCACCTG
UPN5_fw CTGTGACCTTCTCCATGTCCAC
UPN5_rv AGTCAACCTTCAGGAACTGTTTCTC
UPN22_rv CTACAGTGTTGATTTATCAAGGGTTC
UPN28_fw TGGAGCTGTCAGAACAGTGAAG
UPN28_rv ACCACTCTCTTTGCCTTTCTTATCC
UPN23_fw TCCCAGGAGTGGACAAGGTG
UPN23_rv TCAATTAAAAACATACAAGTGACCCATAC
UPN33_fw AGTTGCACTGTGTAAGTTTCTCG
UPN33_rv GTTCACCACGCCATTCTCC

3.1.2.2 Sonden
Bei single quenched-Sonden, befindet sich nur an einem Ende des eingesetzten
Oligonukleotids ein Silencer, der die fluoreszierende Wirkung des Singalpartikels unterdrückt,
solange die Sonde noch vollständig intakt ist. Im Unterschied dazu liegt bei double-quenched
Sonden zusätzlich ein weiterer Silencer direkt neben dem Signalpartikel (Abbildung 7).

Abbildung 1 single quenched und double quenched Sonden Schematische Darstellung der als Sonden verwendeten
Oligonukleotide und Vergleich der Funktion und des Aufbaus von single und double quenched Sonden; rechts: Einsatz eines
zweiten, internen Silencers näher am Fluoreszenspartikel positioniert und damit vermindertes Ruhesignal

Die Kombination beider Silencer bewirkt eine höhere Signaldifferenz der eingesetzten Sonde
im aktiven bzw. nicht aktiven Zustand. Tabelle 2 zeigt die Basensequenz der eingesetzten
Sonden und welcher Typ von Sonden verwendet wurde. Die Sondendesign wurde so

16
gewählt, dass sie, idealerweise, direkt den genomischen Bruchpunkt „überspannt“, also
anteilig sowohl komplementär mit ABL1 und BCR bindet.

Tabelle 3 verwendete Sonden: sq= single quenched, dq= double quenched

Sondenname Basensequenz Sondentyp

UPN17_probe TCACGCCAGACCACAATTAGGTGTTTAATTATTTT dq
UPN2_probe TCACGCCAGACCGCATTGAACAAGTACTA sq
UPN4_probe2 AATTGTTTTTCCCCCATGGTTTATGTTCTGTTG dq
UPN21_probe TAAGTTTCTCGAGGCCGGGCGC dq
UPN16_probe TCCTGTCTGTGATGGAGTGTAGTGGCACA dq
UPN12_probe CCCACAGTGGCCTGAAACACTAACTATTGA dq
UPN1_probe AAGCTGACCTCTTTGGTCTCTTGCGCA sq
UPN3_probe ATGACCACGGGACACCTTTAATTTCCAAGTG dq
UPN18_probe ACTCGACGTGTAGTCGCCCAGGCTG dq
UPN5_probe TCCCCACAGCCATTCAGAAAAATTACCAA dq
UPN22_probe TAAGTTTCTCGAGGCCGGGCGC dq
UPN28_probe CCTACTGTCTCCTTTGCACAAGCTCGGC dq
UPN33_probe TTTTTGTATTTTTAGTCTCCTGGGTTCAAGCGAT dq
UPN23_probe TAGGAGCAGTTTCTCCCCAAACTCCATTTCA dq
UPN34_probe TCCATGAATAATAGGTTTGGTTTGGGGATG dq

3.1.3 Chemikalien und Reagenzien

Tabelle 4 verwendete Chemikalien und Reagenzien

Verwendete Materialien Hersteller

QIAmp DNA Blood Mini Kit Qiagen GmbH Germany

Oligonukleotide Sigma-Aldrich
EvaGreen Supermix Bio-Rad Laboratories GmbH
2x ddPCR supermix Bio-Rad Laboratories GmbH
Cartridges für dropletGenerator Bio-Rad Laboratories GmbH
droplet generation oil Bio-Rad Laboratories GmbH
Human Genomic DNA Roche Diagnostics GmbH

3.2 Methoden
3.2.1 DNA-Isolation aus Blut- und Knochenmarkproben
Um die DNA aus Patientenproben zu isolieren, wurde das QIAmp Blood Mini Kit von Qiagen
eingesetzt. Zuerst wurden 40 µl Protease und 400 µl Patientenmaterial in ein 1,5 ml Eppendorf-
17
Gefäß pipettiert. Nach der Zugabe von 400 µl AL Puffer wurde die Lösung 15 Sekunden lang
pulsierend gevortext und danach bei 56°C inkubiert, um die Zellen und deren Organellen zu
denaturieren und somit die DNA freizusetzen. Um die lysierten Bestandteile ausreichend zu
lösen, wurde das Gefäß als nächstes kurz abzentrifugiert und anschließend weitere 400 µl
96%iges Ethanol dazu gegeben und wiederum für 15 Sekunden gevortext. Diese Lösung
wurde in zwei Schritten auf eine QIAmp Mini spin Säule gegeben und je eine Minute bei 6000
g abzentrifugiert, wobei sich die DNA an die einliegende Membran adsorbiert. Um die Reinheit
der isolierten DNA zu erhöhen, folgt nun der Einsatz der Waschpuffer. Dafür wird die Säule in
eine neue Collection Tube gegeben und 500 µl AW1 Puffer auf die Säule pipettiert. Nun folgte
ein Zentrifugationsschritt mit 6000 g für eine Minute, wonach die Säule wieder auf ein neues
Gefäß gesetzt wurde. Im Anschluss werden 500 µl AW2 Puffer auf die Säule pipettiert, die als
nächstes 3 Minuten lang bei 20000 g zentrifugiert wird. Zur vollständigen Entfernung des
kompletten AW2 Puffers wird eine weitere Zentrifugation, über einer neuem Collection Tube,
mit 6000 g für eine Minute angeschlossen. Um nun die gereinigte DNA wieder aus der
Membran zu lösen, wurde dann 50 µl AE Puffer auf die Säule pipettiert und für 10 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert, bevor die Säule ein letztes Mal bei 6000 g für eine Minute
zentrifugiert wurde. Auch vor diesem Schritt wurde die Säule auf ein neues Eppendorf-Gefäß
gesetzt. Das dadurch gewonnene DNA-Konzentrat wurde bei -20°C gelagert.

3.2.2 Realtime-PCR
Bevor eine patientenspezifische Sonde im Zusammenspiel mit den jeweiligen Primerpaaren
getestet werden konnte, wurde die ausreichende Spezifität der für die bereits sequenzierte
BCR-ABL1 Fusionssequenzen generierten Primer mittels der Realtime-PCR geprüft.

Die Realtime-PCR gehört zur Gruppe der quantitativen PCR. Sie beruht auf der Grundlage,
dass bei der Amplifikation ein Fluoreszenzsignal frei wird und in Echtzeit gemessen werden
kann. Grundsätzlich gibt es zwei Möglichkeiten wie dieses Signal entstehen kann.

Zum einen kann eine sequenzspezifische Sonde generiert werden. Diese besteht aus einem
zur Ziel-DNA komplementären Oligonukleotid, an das ein Fluoreszenz-gekoppeltes Protein,
der sogenannte Reporter, gebunden ist. Zusätzlich befindet sich am Oligonukleotid ein
Quencher-Molekül, das so lange das Fluoreszenz-Signal unterdrückt, bis es hydrolytisch
abgespalten wird. Diese Spaltung findet durch die 5`-Exonukleaseaktivität der DNA-
Polymerase während der Elongation statt.

Alternativ kann dem PCR-Ansatz ein in die DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff

hinzugefügt werden. Dieser bindet allerdings nicht sequenzspezifisch, sondern nach der
Denaturierung in die kleine Furche der Doppelstrang-DNA. Dies bringt den Nachteil mit, dass
sich dieser Farbstoff unerwünschter Weise in unspezifische PCR-Produkte einlagern kann.

18
Je mehr von der Ziel-DNA sich im Ansatz befindet desto weniger Amplifikationszyklen werden
benötigt, bis das Farbsignal über einem gesetzten Schwellenwert detektiert werden kann. Es
wurde eine Negativprobe mit jeweils Kontroll-DNA und mit HPLC-gereinigtem Wasser
mitgeführt.

Da in diesem ersten Schritt allein die Spezifität der Primer geprüft werden sollte, wurde sich
für die Methode EvaGreen entschieden, was einem interkalierenden Farbstoff entspricht.
Anhand des Vergleichs der Signalkurven der Patienten-DNA mit der Kontroll-DNA und des
Wassers kann gezeigt werden, welches Primerassay den spezifischen Bruchpunkt amplifiziert.
Zusätzlich wurde die Spezifität anhand der Analyse der Schmelzkurve beurteilt. Durch die
Schmelzkurve lassen sich Anzahl und ungefähre Größe der entstandenen Produkte
beurteilen. Ein hochspezifisches Assay zeigt typischerweise einen einzigen Schmelzpeak bei
einer relativ hohen Temperatur. Bilden sich unspezifische Produkte können diese zusätzliche
Schmelzpeaks verursachen.

Für einen Ansatz zu 20 µl wurden 10 µl EvaGreen Supermix mit je 0,8 µl des forward- und
reverse-Primers vermischt und 7,4 µl HPLC-gereinigtes Wasser hinzupipettiert bevor 1 µl der
Patienten-DNA folgte. Das Thermocycling-Protokoll beginnt mit der Denaturierung bei 98°C
für 2 Minuten, worauf 50 Zyklen mit 5 Sekunden bei 98°C und 10 Sekunden bei 60°C folgen.
Anschließend folgt eine Schmelzkurve von 65 bis 95°C mit je 15 Sekunden pro 0,5 °C
Temperaturerhöhung, um die Spezifität des Produkts zu überprüfen. Das Cycling Protokoll
wurde bei Primerpaarungen, die sehr lange Produkte bilden (>250 bp), auf 50 Zyklen mit 5
Sekunden bei 98 °C und 20 Sekunden bei 60°C modifizert.

3.2.3 Digitale droplet PCR (ddPCR)

Erwiesen sich die getesteten Primerpaare als spezifisch genug, wurden anschließend
fusionssequenzspezifische Sonden zum Assay hinzugefügt. Diese Sonden wurden vor dem
Einsatz zur Quantifizierung mehrerer Therapiezeitpunkte mit einem Temperaturgradienten
getestet, um das Temperaturoptimum der Reaktion zu bestätigen. Beim überwiegenden
Großteil der Patienten wurde auf doppelt gequenchte Sonden zurückgegriffen.

Grundsätzlich bestehen oben beschriebene Sonden aus einem Oligonukleotid an dessen

einem Ende ein fluoreszierendes Partikel befestigt ist. Am anderen Ende befindet sich ein das
Leuchtsignal unterdrückender Teil, der sogenannte Quencher. Im Zuge der Multiplikation des
Amplifikats wird die Sonde von der Polymerase zerteilt. Der nun freigewordene
Fluoreszenzpartikel befindet sich nicht mehr in räumlicher Nähe zu dem Quencher. Dadurch
entsteht ein detektierbares Leuchtsignal. Im Gegensatz zu den bisherigen Sonden vom Typ
FAM-TAMRA wurde bei den double quenched Sonden ein zusätzlicher Silencer nahe dem

19
Ende mit dem Floureszenzstoff eingebracht. Dadurch wird das Grundsignal der Sonden weiter
reduziert.

Die Temperaturoptimierung sowie alle weiteren Messungen der Patientenproben wurden

mittels ddPCR durchgeführt. Das Prinzip der Quantifizierung von Nukleinsäuren mittels ddPCR
unterscheidet sich grundlegend von dem der Realtime-PCR. Die PCR-Reaktion wird hierbei in
bis zu 20.000 kleine Tröpfchen aufgeteilt, deren Volumen sich im Nanoliterbereich befindet.
Diese Tröpfchen entsprechen damit voneinander getrennten kleinen Reaktionsräumen. Durch
die Amplifikation werden nun die Quencher der Sonde hydrolytisch abgespalten, was zu einem
positiven Floureszenzsignal führt. Über die Summe der positiven droplets im Verhältnis zu den
negativen kann nun über die Poisson-Verteilung auf die Konzentration der Ziel-DNA
geschlossen werden.

Für einen 20 µl Ansatz wurden 11,2 µl 2x ddPCR Supermix for probes mit 0,2 µl fw-Primer
(100 µM), 0,2 µl rv-Primer (100 µM) und 0,6 µl (10 µM) spezifischer Sonde gemischt. Dazu
wurden 6,0 µl Patienten-DNA als spezifisches Template gegeben und die Mischung mit HPLC-
gereinigtem Wasser aufgefüllt. Die BCR-ABL1 Quantifizierungen erfolgten in
Doppelbestimmungen. Neben der BCR-ABL1 Translokation wurde die Konzentration des
single copy Gens Albumin in den Patientenproben bestimmt. Hierbei wurden lediglich 0,5 µl
Template eingesetzt und die Menge an HPLC-gereinigtem Wasser entsprechend angepasst.
Als Negativ (BCR-ABL1)- bzw. auch Positivprobe (Albumin) diente human genomic DNA
(Roche GmbH). Die bei den Messungen eingesetzte genomische DNA wurde vor Zugabe zur
PCR-Reaktion 10 Minuten bei 95°C thermisch denaturiert und einheitlich auf eine
Konzentration von 100 ng/µl eingestellt. Aus jeweils 20 µl PCR-Proben und 70 µl droplet
generator Öl werden anschließend im droplet Generator die Tröpfchen generiert. Die Proben
wurden dann auf eine Platte überführt, die mit einer Metallfolie hitzeversiegelt wurde. Initial
wurden die Proben im Thermocycler 10 Minuten bei 95°C denaturiert, worauf 40 Zyklen bei
94°C für 30 Sekunden und 1 Minute bei 60°C folgten. Zuletzt erfolgte ein Zyklus bei 98°C für
10 Minuten. Auch hier wurde das Thermocycling-Protokoll bei Primerpaarungen mit sehr
großen Amplifikationsprodukten (> 250 bp) angepasst. Es erfolgten 40 Zyklen bei 94°C für 30
Sekunden, 60°C für eine Minute und zusätzlich 2 Minuten bei 72°C. Nach Beendigung der
PCR folgt die Messung positiver und negativer droplets im droplet Reader, wodurch die Ziel-
DNA quantifiziert werden konnte.

Vor Einsatz der oben genannten Thermocyclingprotokolle wurde der Einfluss der Annealing-
Temperatur auf das Primer-Sonden-Assay durch den Einsatz eines Temperaturgradienten von
56°C bis 62°C für eine Minute als Schritt 2 geprüft.

20
3.3 Statistische Auswertung
Um die Vergleichbarkeit der gemessenen Fusionsgen-DNA mit dem für die Routinediagnostik
etablierten RNA-Monitoring zu zeigen, wurde die Korrelation nach Spearman angewendet.
Diese misst, wie gut die gewählte Funktion den Zusammenhang zwischen zwei Variablen
beschreibt. In diesem Fall wird damit geprüft, inwiefern die gemessene DNA, bzw. dessen
Quotient in Bezug auf das Kontrollgen und die mRNA korrelieren.

21
4. Ergebnisse

4.1 Auswertung der individuellen Messungen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die DNA-Kopien pro Zelle der spezifischen Bruchpunkte des
Philadelphia-Chromosoms von 15 Patienten an insgesamt 260 Zeitpunkten bestimmt. Im Mittel
wurden pro Patient 17 Zeitpunkte über einen Zeitraum von 75 Monaten gemessen. Das
verwendete DNA-Material wurde aus Knochenmark- und Blutproben gewonnen. Die 260
verwendeten Proben setzten sich dabei aus 141 EDTA-Proben, 17 Heparinproben und 102
Proben mit nicht dokumentiertem Reagenz zusammen. Die Primer und Sonden wurden an der
isolierten DNA des Zeitpunkts der Erstdiagnose getestet, da diese eine gesichert hohe
Konzentration des Fusionsgens aufweist. Die ddPCR erwies sich als robust in Bezug auf
mögliche Inhibitoren durch EDTA oder Heparin. Während EDTA keine Störungen verursachte,
fielen einzelne Messungen mit Heparin auf. Abbildung 1 zeigt einen solchen Ausfall von
Heparinproben. Der rot markierte Zeitpunkt in Abbildung 1A zeigt keinen Nachweis positiver
droplets an einem Zeitpunkt, an dem dies weder im Krankheitsverlauf noch durch die
gemessene mRNA-Kopienzahl zu erwarten ist (Abbildung 1B). Abbildung 1A zeigt ebenfalls
die identische Messung als Säulendiagramm von positiven und negativen droplets. Die
deutlich positive Messung des Albumin-Gens zu diesem Zeitpunkt und damit desselben
eingesetzten DNA-Isolats, weist die Gegenwart von DNA in der verwendeten Probe nach. In
Abbildung 1B zeigt sich dann eine signifikante Abweichung im Krankheitsverlauf und im
direkten Vergleich mit der Transkriptkopienzahl und damit ein falsch negatives Ergebnis an
dieser Stelle. Gleichzeitig zeigen sich positive Nachweise des Fusionsgens an zwei
Zeitpunkten, an denen das Transkript nicht detektiert wurde.

22
Abbildung 2 Auswirkung der Asservierungsmethode auf die BCR-ABL1 Quantifizierung A Auswertung der ddPCR mit
beschriebenem Ausfall einer Heparinprobe. Links: Auswertung als einzelne droplets nach Festsetzung des thresholds anhand
der Kontrolle; rote Markierung: ausgefallene Probe; Rechts: Auswertung derselben Messung als Säulendiagramme pro Zeitpunkt
von Albumin und des patientenspezifischen Amplifikats 1B MRD Verlauf BCR-ABL1 Transkript und DNA im Vergleich mit
Auswirkung des Heparinausfalls in der Auswertung, 1C Verwendete Asservierungsmedien der Blut- und Knochenmarkproben
und deren Anteil an ausgefallenen Proben

Abbildung 1C zeigt die Gesamtheit der verwendeten Proben in Bezug ihrer

Asservierungsmethode. Keine der EDTA-Proben zeigte die beschriebene Inhibition.
Insgesamt konnten 253 von 260 Proben ohne Probleme quantifiziert werden. In den Verläufen
von nur drei der Patienten wiederholten sich Ausfälle. Die 7 Ausfälle setzen sich aus 3 der 17
Heparinproben und 4 der 102 nicht spezifizierten Proben zusammen. Insgesamt treten diese
Interfenzen also selten (2,7%) auf, müssen dann aber im Vergleich der MRD-Verläufe
einbezogen werden.

23
4.2. Einfluss und Auftreten bruchpunktnaher repeat-Sequenzen
Zur Quantifikation des Fusionsgens an den gemessenen Zeitpunkten im Krankheitsverlauf
wurde der Bruchpunkt des Fusionsgens der Patienten sequenziert. Die Sequenzen wurden
dann auf unspezifische repeat-Regionen bzw. repeats untersucht. Diese kamen in hoher
Anzahl vor. Als häufigstes fand sich ein Alu/SINE-Repeat. Eine solche repeat-sequenz wurde
bei acht der 15 untersuchten Fusionsgene gefunden. Darauffolgend zeigten sich LINE-repeats
bei 4 Patienen und kleinere repeats wie simple und hAT/Charlie bei ebenfalls 4 Patienten. Bei
6 Patienten traten gleichzeitig mehrere repeats von gleichen oder unterschiedlichen Typen
auf. Die Bruchpunkte der spezifischen Fusionsgene wurden im Mittel über eine Länge von 776
bp sequenziert. Die Alu-repeats wiesen durchschnittlich eine Länge von 207 bp auf, die LINE-
repeats eine von 310 bp. Die simple- und hAT-Charlie-repeats waren kürzer mit
durchschnittlich 28 und 107 bp. In der folgenden Tabelle sind die repeat-Regionen mit ihrer
Position auf dem Fusionsgen und in Relation zum Bruchpunkt aufgeführt

24
Tabelle 5 Aufstellung der Verteilung und der Art der repeat-Sequenzen der quantifizierten Fusionsgene rote Färbung: auf BCR liegenden repeats und repeat-Abschnitte grün: auf ABL1 liegenden
repeats und repeat-Abschnitte; (=): repeats überspannen den Bruchpunkt, Anteile separat eingefärbt (vollständige Tabelle in Anhang)

Sequenzierter Abstand zu
Abschnitt des Anteil Länge Anteil Länge Beginn repeat Ende repeat in Länge repeat Bruchpunkt in
Patient Repeat-Typ
Fusionsgens BCR ABL1 in bp bp in bp bp
in bp
UPN1 961 203 659 SINE/Alu 292 358 66 89
DNA/hAT-Charlie 465 615 150 262
DNA/hAT-Charlie 359 424 65 156
UPN3 1469 300 1170 LINE/L1 16 726 710 =(-285/+427)
SINE/Alu 728 839 111 428
LINE/L1 841 1160 319 541
SINE/Alu 1177 1462 285 877
UPN5 682 276 406 Simple repeat 267 289 23 =(-10/+13)
UPN16 753 347 406 SINE/Alu 348 486 139 1
UPN17 567 71 496 Simple repeat 62 93 32 =(-10/+22)
SINE/Alu 139 382 244 68
UPN18 644 259 385 SINE/Alu 1 260 260 =(-259/+1)
UPN21 617 278 339 SINE/Alu 6 280 275 =(-273/+2)
UPN22 773 536 237 SINE/Alu 332 538 207 =(-205/+2)
SINE/Alu 558 773 216 22
UPN23 752 206 546 LINE/L1 239 547 309 33
UPN28 635 214 421 SINE/Alu 1 215 215 =(-214/+1)
LINE/L1 237 518 282 23
UPN33 782 587 195 SINE/Alu 376 776 401 =(-212/+189)
UPN34 842 419 423 SINE/Alu 457 557 101 38
LINE/L1 592 735 144 173
LINE/L1 744 1061 318 325

25
4.3 Optimierung durch Einsatz von double-quenched Sonden
Aufgrund von häufig auftretenden unspezifischen repeat-Sequenzen um und auf den
Bruchpunkt erwies sich das Primer-Sonden-Design als die zentrale Herausforderung dieser
Arbeit. Die Verwendung von double-quenched Sonden zeigte sich dabei als deutlich
vorteilhaft. Im direkten Vergleich der beiden Sondentypen trennte die double-quenched Sonde
negative und posititve droplets deutlicher auf, wobei die Streuung der Signalamplitude
zusätzlich kleiner war. Entscheidender jedoch war die Differenz an falsch positiven droplets.
Beim Design der Primer-Sonden-Paarung von UPN3 erwiesen sich die Sondentestungen trotz
einer Standardrange und spezifischer Primer als nicht zufriedenstellend (Abbildung 2). Es
wurden daraufhin double-quenched Sonden eingesetzt.

Abbildung 3 Sondentestung von single- wie auch double-quenched Sonden im Vergleich (UPN3) A graphische Auswertung
der droplets einer ddPCR zur Testung von Sonden der beiden Typen unter Einsatz eines Temperaturgradienten B Vorteile der
double quenched Sonden bei der Amplitudendifferenz positiver zu negativen droplets und Anzahl an falsch positiven droplets

In Abbildung 2A sind die Sondentestungen von UPN3 sowohl mit single als auch mit double
quench dargestellt. Abbildung 2B verdeutlicht die genannten Vorteile der double-quenched
Sonden, was insgesamt die Spezifität der Primer-Sonden-Paarung steigerte. Die
Sondentestungen wurden mit einem Cyclingprotokoll mit Temperaturgradienten durchgeführt.
Da die Annealing-Temperatur keinen signifikanten Einfluss auf die Quantifizierung hatte,
wurde das Annealing bei 60°C für 1 Minute beibehalten. Der Einsatz der double-quenched
Sonden ermöglichte somit die spezifische Quantifizierung des individuellen Bruchpunkts des
Fusionsgens maßgeblich.

26
4.4 Entwicklung der large amplicon ddPCR
Die langen repeat-Regionen am Bruchpunkt des Fusionsgens verhinderten bei den
betroffenen Patientengenen die Positionierung von Primern für die Bildung kleiner
Amplifikationsprodukte (80-150bp), welche üblicherweise für die real-time PCR notwendig
sind. Das bei der PCR multiplizierte Amplifikat musste teilweise deutlich über eine Länge von
150 bp und sogar bis zu über 300 bp hinausgehen. Von den 15 untersuchten Philadelphia-
Chromosomen konnte bei nur sieben eine PCR einer normalen Range durchgeführt werden
(99 bis 127bp). Bei acht Patienten wurde eine sogenannte large amplicon PCR durchgeführt
mit dem längsten Amplifikat von 401 bp. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte die Länge der
gemessen Amplifikate erfolgreich von 179 bp bis zu dem genannten Maximum vergrößert
werden.

Abbildung 4 Schematische Darstellung eines breakpoints von BCR-ABL1 sowie der Notwendigkeit und des Effekts eines
größeren Amplifikats A Verschieben des forward Primers ans Ende von BCR um den großen repeat zu umgehen B kleinerer
repeat auf ABL1 mit entsprechendem Setzen des backward Primers weiter entfernt zum Bruchpunkt auf ABL1; beide
Primerdesigns führen zu einem größeren PCR-Produkt

In Abbildung 3 wird die Notwendigkeit einer Verschiebung der Primer zu einer large amplicon
PCR anhand zweier Beispiele schematisch dargestellt. Durch die large amplicon PCR können
die Primer, oder einer der Primer, aus dem Gebiet, das durch die repeat-Region betroffen ist,
hinausgeschoben werden. Damit liegen beide Primer wieder auf einem für den Patienten

27
spezifischen DNA-Abschnitt des Fusionsgens. Dadurch kann eine Primer-Sonden-Paarung
gefunden werden, die trotz der unspezifischen repeats am Bruchpunkt eine Messung eines
spezifischen Amplifikats ermöglicht. Es war möglich, die Primer schrittweiße weiter
auseinander auf das Fusionsgen zu setzen und durchgehend sehr gut verwertbare
Messungen der ddPCR zu erhalten. Eine Verlängerung des Amplifikats zeigte keinen Nachteil
bei der Sensibilität der ddPCR, was bei vor allem bei Verwendung interkalierender
Fluoreszenzstoffe beobachtet werden kann.

Tabelle 6 Länge des für den jeweiligen Patienten verwendete PCR-Amplifikats

Patient Länge des Amplifikats Patient Länge des Amplifikats

UPN12 98 bp UPN18 179 bp
UPN2 99 bp UPN16 202bp
UPN3 104 bp UPN34 239 bp
UPN5 115 bp UPN22 263bp
UPN4 126 bp UPN33 329bp
UPN17 127 bp UPN21 338bp
UPN1 136 bp UPN28 341bp
UPN23 401bp

Abbildung 5 Auswertung der Signalamplitudendifferenz (Singalstärke positives droplet und Singalstärke negativer droplets
jeweils im Mittel) in Abhängigkeit der Größe des PCR-Amplifikats

Die Amplitude der positiven droplets zeigte sich, je nach Amplifikatlänge, als sehr heterogen
(Abbildung 4). Die Stärke des vom droplet Reader gemessenen Fluoreszenzsignal wird als
Amplitude beschrieben. Je stärker also die „Leuchtkraft“ eines einzelnen droplets, desto höher
ist die gemessene Amplitude. Die Amplitudendifferenz (negative droplets zu positive droplets)
reicht von 3000 bis 28000. Absolut entsprach dies einer Amplitude von jeweils 3200 und
45000. Die Verlängerung des PCR-Produkts hatte damit keinen beobachtbaren Einfluss auf
die Auftrennung positiver und negativer droplets.

28
4.5 Vergleich von RQ- und large amplicon ddPCR
Um auf die Anzahl der von der CML betroffenen Zellen zu schließen, wurde die bei der ddPCR
gemessene Konzentration der DNA des spezifischen Fusionsgens durch die Konzentration
eines Kontrollgens geteilt. Da in dieser Arbeit die DNA als molekularer Marker verwendet
wurde, kann davon ausgegangen werden, dass pro Zelle nur eine Kopie des
patientenspezifischen BCRL-ABL1 Fusionsgens und zwei Kopien des verwendeten
Kontrollgens Albumin vorliegen. Somit wurde bei der Darstellung der Patientenverläufe nicht
die Konzentration dargestellt, sondern die Anzahl der monoklonalen Ph+-Zellen. Diese wurden
im zeitlichen Verlauf der Erkrankten aufgetragen. Zusätzlich wurden die im Rahmen der
Routinediagnostik durch eine Realtime-PCR bestimmten Kopienzahlen der mRNA des
Fusionsgens eingetragen. Da es sich bei der mRNA, als Transkript der DNA, um einen
Biomarker handelt, der theoretisch von einer einzigen Zelle in großer Zahl produziert werden
kann, lässt sich dadurch nicht auf eine Zellzahl schließen. Das Aufkommen der Transkripte ist
daher als Quotient der mRNA von BCR-ABL1 zu ABL1 dargestellt.

29
30
Abbildung 5 MRD-Verläufe der mRNA- und DNA-basierten Quantifizierungsverfahren im Vergleich UPN2 mit deutlichen
molekularen Rezidiv nach Imatinib-Stop; UPN 22, 28, 33,34 mit dauerhaft deutlich positiver residual disease; ddPCR zeigt sich
vorteilhaft bei UPN 1, 2, 5, 12, 17 und 21 im Sinne Nachweis von Ph+-Zellen mit nicht nachweisbarem Transkript; insgesamt
miteinander korrelierende Verläufe

Die in Abbildung 5 gezeigten Patientenverläufe zeigen die miteinander aufgetragen Verläufe

der RQ- und ddPCR. Alle Ergebnisse unter 10-5 wurden als nicht quantifizierbar, nq,
bezeichnet, da der gemessene Biomarkernachweis als nicht aussagekräftig genug interpretiert

31
wurde. Konnten keine positiven droplets gefunden werden, wurde dies als nicht detektierbar,
nd, bezeichnet.

Die Quantifikationen zeigen sich gut deckend und vereinbar mit denen der RQ-PCR. Der nach
Spearman errechnete Korrelationskoeffizient aller Messungen der 15 eingeschlossenen
Patienten beträgt 0,47 (Abbildung 6).

Abbildung 6 Korrelation des BCR-ABL1 Fusionsgens und der mRNA Ergebnisse der Quantifikationen aller Zeitpunkte bzw.
Proben des BCR-ABL1 Transkripts und der BCR-ABL1 DNA

Im Hinblick auf einen möglichen Therapiestopp mit TKIs ist vor allem der Bereich der nicht
quantifizierbaren und nicht detektierbaren Messungen von besonderem Interesse. Am Beispiel
von UPN2 zeigen sich trotz nicht detektierbarem Transkript positive, wenn auch nicht
quantifizierbare BCR-ABL1 positive Zellen in der ddPCR.

Bei insgesamt 31 Messungen zeigte sich bei der ddPCR ein signifikant höheres Vorkommen
an Fusionsgen, als die Analyse der Transkripte vermuten ließ. Währenddessen ergab die RQ-
PCR an 11 Zeitpunkten höhere Messwerte. Diese Aussagen beziehen sich vor allem auf den
niedrig positiven Bereich ab kleiner 10-4, wie zum Beispiel bei UPN12 oder UPN5
nachvollziehbar. Der sich ergänzende Mehrwert der beiden Bestimmungen wird z.B. auch bei
UPN21 deutlich, da sowohl die Transkripte und die DNA an Zeitpunkten nicht detektiert werden
konnten, an denen jeweils die zweite Messmethode einen deutlich positiven Nachweis
erbrachte.

32
5. Diskussion
Ziel dieser Dissertationsarbeit war zu zeigen, dass ein DNA-basiertes Monitorings der MRD
der CML mithilfe einer large amplicon ddPCR erfolgreich umgesetzt werden kann.

Die Analyse von tumorspezifischen Sequenzen erlaubt seit Längerem Einsicht in die
genetische Beschaffenheit von Tumor-DNA. Die tumoreigenen genetischen Sequenzen
dienen dann dazu die Therapie sinnvoll zu erweitern, der Früherkennung oder den
Krankheitsverlauf zu prüfen [87-89]. Die patientenspezifische Sequenz des Bruchpunkts des
BCR-ABL1 Fusionsgens als Biomarker stellte sich als aussagekräftige Verlaufsparameter in
der chronisch myeloischen Leukämie heraus [82, 90-92].

Bekanntermaßen zeigte sich in der verwendeten PCR-Methodik eine PCR-Inhibition von

Heparin in der Quantifizierung der BCR-ABL1 Fusionsgene [93, 94]. Dies wiederholte sich
allerdings nur in 7 der 119 nicht-EDTA Proben. Zhao et al. verglich die beiden hier eingesetzten
PCR-Typen auf den Einfluss solcher Inhibitoren, wobei sich die ddPCR im Vergleich zur RQ-
PCR in Bezug auf hemmende Substanzen wie Zitrusextrakt und CuSO4 als weniger stark
beeinflusst herausstellte [81]. Auch Dingle et al. wiederholte einen ähnlichen Vergleich und
konnte zeigen, dass die ddPCR weniger anfällig für Störungen durch übliche PCR-Inhibitoren
wie Heparin und Tenside, vertreten durch Natriumlaurylsulfat, als die RQ-PCR ist. Tatsächlich
ergab der Vergleich unter Einfluss von EDTA keinen signifikanten Unterschied in der PCR-
Inhibition. Dingle führt dies auf die Aufteilung der PCR-Reaktion in droplets zurück. Dadurch
können Inhibitoren nur ein kleines Teilvolumen des PCR-Ansatzes negativ beeinflussen [95].
Da die mit EDTA versetzen Proben aber bei dieser Arbeit keinen Hinweis auf eine Inhibition
der ddPCR zeigte, ist somit für weitere Messungen mit der hier verwendeten Methodik zu
empfehlen, die entnommenen Proben nur noch in EDTA-Monovetten abzufüllen. Grund für die
hier nicht mehr festgestellte Inhibition könnte die Prozessierung der Blut- und
Knochenmarkproben zur Isolation der DNA sein. Zur Lösung des durch Protease
entstandenen Lysats wird die Probe mit Ethanol versetzt. Da EDTA bei Raumtemperatur gut
in Ethanol löslich ist, kann vermutet werden, dass dadurch der Großteil von EDTA entfernt
wurde, wodurch die PCR-Inhibition vermieden wird. Dahingegen löst sich das als
Polysaccharid hydrophile Heparin nur schlecht in Ethanol. Hugget et al. untersuche ebenfalls
den Einfluss bekannter PCR-Inhibitoren auf die Qualität der real-time PCR und stellte dabei
fest, dass EDTA einen deutlichen Effekt auf den Ct-Wert der untersuchten DNA-Proben hat.
In diesem Fall wurde EDTA aber direkt zum vollständigen PCR-Ansatz hinzugefügt [96].
Entfernt man diese wenigen falsch negativen Messungen aus dem Vergleich zwischen den
Biomarkern (DNA vs. mRNA), ergeben sich nur einzelne Zeitpunkte, bei denen die mRNA
einen Nachweis erbringt, wo die Messung der DNA negativ bleibt, z.B. bei UPN16, Monat 52.

33
Ein entscheidender Schritt war der Einsatz eines sondenbasierten Assays und der Einsatz von
double-quenched Sonden. Durch diesen Schritt konnte die Spezifität der eingesetzten Assays
deutlich erhöht werden, indem die Auftrennung positiver und negativer droplets deutlicher
wurde und falsch negative droplets nicht mehr detektiert wurden. Der Einsatz von
Oligonukleiden, die an Fluoreszenzpartikel und Quencher gekoppelt sind, ist bereits lange der
Standard in der Detektion und Quantifikation von Nukleinsäuren [97, 98]. Die am häufigsten
eingesetzten Fluoreszenzen sind die Fluoreszinamide, kurz FAM. Brylev et al. untersuchte den
Einfluss zusätzlicher Fluoreszenzpartikel oder Quencher als Weiterentwicklung der
klassischen Sonden. Dabei wurde der Abstand zwischen den Partikeln durch einen Linker
erhöht oder zwei Fluoreszenzpartikel über ein branching-Molekül am 5‘-Ende eingefügt.
Außerdem wurden entweder ein oder zwei Quencher am 3‘-Ende verwendet. Die höchste
Sensitivität des in einer RQ-PCR getesteten Assays zeigten dabei entweder Sonden mit
doppeltem Quencher oder doppeltem Fluoreszenzpartikel. Außerdem konnte beobachtet
werden, dass das Ruhesignal bei den double-quenched Sonden deutlich reduziert wurde,
während das Signal mit der räumlichen Nähe der beiden Nukleidenden zunahm [99].
Allerdings wurde bei der Entwicklung der laddPCR ein weiteres Design von double-quenched
Sonden verwendet. Die eingesetzten Sonden wurden mit internem zweiten Quencher
versehen. Diese Art von Sonde wurde auch in klinischer Anwendung erfolgreich eingesetzt.
Die Vorteile des reduzierten Hintergrundsignals und der dadurch erhöhten Sensitivität wurden
durch Hirotsu et al. bestätigt. Es wurden dabei RQ-Assays zur Quantifizierung von SARS-CoV-
2 RNA mit jeweils FAM/TAMRA (single-quench) mit FAM/ZEN/IBFQ (double-quench mit
zusätzlich internem Quencher) verglichen. Zusätzlich konnte beobachtet werden, dass kürzere
Sonden ein geringeres Hintergrundsignal produzierten [100]. Die Anwendung von intern
double-quenchend Sonden wurde bereits auch auf die ddPCR ausgeweitet. Sowohl in der
Quantifikation von HIV, Parechovirus und des Simian immundeficiency Virus (SIV) als auch
bei der Genotypisierung von EGFR (Epidermal Growht Factor Receptor) wurden double-
quenched Sonden erfolgreich eingesetzt [101-105]. Vergleichbar war ein erfolgreiches
Assaydesign im Falle des SIV auch nur unter Einsatz von double-quenched Sonden möglich,
da die single-quenched Sonden keine gute Performanz zeigten [102]. Interessanterweise
wurden im Falle der beiden weiteren Retroviren einschrittige und zweischrittige Protokolle
miteinander verglichen. Dabei zeigte sich in der Arbeit von Aizawa et al., dass entgegen der
Erwartung das zweischrittige PCR-Protokoll besser abschnitt, wobei nur dieses Protokoll mit
double-quenched Sonden durchgeführt wurde. Daraufhin wurde diskutiert, ob die bessere
Performanz nur auf die Auswahl der Sonden zurückzuführen ist [101, 104]. Insgesamt lässt
sich also nachvollziehen, dass sich der Einsatz von intern double-quenched Sonden vor allem
beim Erstellen technisch schwieriger PCR-Assays als vorteilhaft bewiesen hat.

34
Im Falle der CML des Kindesalters ergibt sich aus den molekularbiologischen Auffälligkeiten
der Bruchpunkte allerdings eine weitere Schwierigkeit hinsichtlich der Etablierung eines DNA-
basierten MRD-Monitorings. Krumbholz et al. untersuchte die Fusionssequenzen von 59
Patienten mit pädiatrischer CML. Auffällig dabei war eine sehr hohe Dichte an repeat-
Sequenzen um den Bruchpunkt, vor allem auf ABL1 liegend [33].

Diese repeat-Sequenzen zeigten sich als zentrale Herausforderung im Design der

spezifischen Primer-Sonden-Paarungen im Rahmen dieser Arbeit. Repeat-Sequenzen sind
Abschnitte von sich wiederholenden Basenfolgen, die nicht spezifisch für den Bruchpunkt oder
die beteiligten Gene sind. Diese Sequenzen sind als Produkt fehlerhafter
Reperaturmechanismen zu verstehen, welche bekanntermaßen zu weiterer DNA-Instabilität
führen und damit krankheitsauslösenden Translokationen bedingen können [106]. Die typische
Verteilung dieser willkürlichen Basenabfolgen um den Bruchpunkt erschwert das Design eines
spezifischen PCR-Assays, da nun in dem DNA-Abschnitt, der für jeden Patienten einzigartig
ist, plötzlich Abfolgen nicht zuweisbarer DNA liegen. Um ein spezifisches PCR-Produkt zu
generieren, sollten aber beide Primer und die Sonde nicht auf solchen Abschnitten liegen. Da
diese Basenfolgen sich im Genom mehrmals wiederholen, setzen sich die Primer als eine
beliebige Kopie des repeats zusammen, was zu unterschiedlich langen und unspezifischen
Amplifikaten führt.

Um die unspezifischen repeat-Regionen beim Primerdesign zu umgehen, wurde die ddPCR

erfolgreich zu einer large amplicon ddPCR weiterentwickelt und das Amplifikat Schritt für
Schritt vergrößert. Die Verlängerung des Amplifikats erlaubte es, die Primer außerhalb der
repeats zu setzen und damit eine spezifische Quantifizierung des Fusionsgens durchzuführen.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Amplifikat erfolgreich bis zu einer Länge von 401 bp
vergrößert werden.

Miotto et al. verglich die Sensitivität von sowohl interkalierenden als auch sondenbasierten
PCR-Assays in ddPCRs bei der Quantifikation von miRNAs und stelle dabei fest, dass die
beiden Systeme eine sehr hohe Korrelation nach Pearson von 0.986 bzw 0.92 aufwiesen,
wobei in Abhängigkeit der Ziel-miRNA aber eine bis zu zweifach höhere Kopienzahl
quantifiziert wurde, wenn ein interkalierender Farbstoff eingesetzt wurde. Somit konnte
argumentiert werden, dass beide Verfahren mit leichtem Vorteil für interkalierende
Fluoresezenz, gut geeignet für den Einsatz in der ddPCR sind [107]. Im Falle einer large
amplicon PCR konnte bereits wiederholt dargestellt werden, dass die Fluoreszenzamplitude
bekannterweise zunächst proportional zur Länge des Amplicons zunimmt [83, 108-111].
Allerdings zeigte sich die Signalamplitude wider Erwarten ab einer Amplikonlänge von ca. 300
bp verringert mit gleichzeitiger Abnahme der Sensitivität unter Verwendung interkalierender
Singalpartikel, was von mehreren Autoren auf eine möglicherweise unvollständige

35
Amplifikation zurückgeführt wird [83, 84, 86]. In Bezug auf sondenbasierte PCR-Assays konnte
dieses spezifische Verhalten des Fluoreszenzsignals im Rahmen einer large amplicon PCR
nicht reproduziert werden. Laurie et al. nutzte single-quenched Sonden erfolgreich in ddPCRs
mit großen Amplifikaten bis 850 bp. Dabei stellte sich eine abnehmende Signalampltitude
positiver droplets mit längerem Produkt dar. Dies begründeten die Autoren mit einer
Begrenzung der Reaktionskapazität in den droplets, die a.e. abhängig von den
Polymerasesubstraten wie Pyrophosphat und Nukleosidtriphosphaten sind, vor allem wenn
man das kleine Reaktionsvolumen betrachtet. Dadurch kann weniger Amplifikat polymerisiert
werden und weniger Sonden werden aktiviert [112]. Auch eine weiterführende Arbeit von
Krumbholz et al. stellte fest, dass mit zunehmender Länge der Amplikons die Amplitude der
positiven droplets abnahm [86]. Dieser Einfluss auf die Amplitudenhöhe der positiven droplets
durch die wachsende Länge des Amplifikats konnte in dieser Arbeit nicht festgestellt werden.
Ein entsprechender Abwärtstrend der Amplitudenhöhe konnte nur unter Ausklammerung des
Amplifikats mit der Länge von 341 bp (UPN28) dargestellt werden. Die in der genannten Arbeit
verglichenen Amplituden beziehen sich alle auf den gleichen, für diesen Patient individuellen
Bruchpunkt. Somit wurde anhand der gleichen Fusionssequenz und unter Verwendung der
exakt gleichen Sonde gezeigt, dass die Länge einen mindernden Effekt auf die Amplitude der
droplets hat. Der Einfluss der spezifischen Primer-Sonden-Paarung auf die Gesamtamplitude
des verwendeten Systems scheint hierbei den größeren Einfluss zu haben.

Eine Verlängerung des Amplifikats zeigte keinen Nachteil bei der Sensibilität der ddPCR.
Vergleicht man die gemessene DNA mit der Quantifikation der standardmäßig gemessen
mRNA zeigt sich eine gute Korrelation beider Biomarker und die gut erhaltene Sensitivität der
größer werdenden Amplifikate. Der errechnete Korrelationsquotient nach Spearman von 0,47
zeigt auch statistisch eine ausreichende Korrelation beider Biomarker. Insgesamt war die
Weiterentwicklung der large amplicon ddPCR erfolgreich und konnte ohne Einschränkungen
bis zu einer Amplifikatslänge von 401bp eingesetzt werden. Es gibt keinen Hinweis, dass ein
Maximum der Amplifikatslänge erreicht ist oder existiert, bzw. eine Rolle in der Quantifizierung
des BCR-ABL1 Fusionsgens spielt. Aufbauend auf den hier ermittelten Daten wurden
inzwischen in weiterführenden Arbeiten Amplifikate bis zu einer Länge von >1000 bp
untersucht und verlässlich quantifiziert. Auch in diesen untersuchten Fällen blieb im Vergleich
von mRNA und DNA die Sensitivität der large amplicon ddPCR erhalten [86].

Die variable Transkriptonsrate der Ph+-Zellen kann zu sehr hohen Mengen an mRNA je
einzelner Zelle führen. Währenddessen vermehrt sich die DNA des Fusionsgens nur mit
durchgeführter Zellteilung. Dies kann erklären, warum die Korrelation nicht enger aufgezeigt
werden kann. Vergleicht man die Messungen der MRD beider Methoden über den zeitlichen
Verlauf, decken sich diese sehr gut miteinander. Das weist weiter darauf hin, dass eine

36
ausreichende Sensibilität trotz Verlängerung des Amplifikats beim DNA-basierten Monitoring
erhalten bleibt.

Es konnte wiederholt bewiesen werden, dass eine digitale PCR mitunter eine höhere
Sensibilität aufweist als die in der Routine verwendete RQ-PCR. Allerdings wurde zum
Großteil die mRNA, also das Transkript des Fusionsgens, quantifiziert [40, 75, 113]. Nahm
man die klinischen Voraussetzungen und wendete zum Vergleich ebenfalls die digitale PCR
als molekulares Monitoring an, um Kandidaten für Therapiepausen zu evaluieren und darunter
zu überwachen, konnte eine längere therapiefreie Remission und eine frühere Entdeckung
eines molekularen Rezidivs festgestellt werden [114-117]. So untersuchte Bernardi et al. 142
CML-Patienten mit tiefer molekular Remission (deep molecular remission, DMR) über 2 Jahre.
Diese wurden alle 3-4 Monate mittels RQ-PCR und dPCR gemonitort. Insgesamt wurden 556
Proben analysiert. Im Beobachtungszeitraum setzten 111 Patienten die TKI-Therapie aus.
Während die Einteilung mittels RQ-PCR in Risikogruppen nach molecular response keinen
hochsignifikanten Unterschied im treatment free survival aufwies, wurde ein beim Monitoring
mittels dPCR ein cut-off 0.468 Kopien/µl festgestellt. Patienten mit Kopienzahlen unterhalb
dieses cut-offs vor Therapiepause zeigten eine signifikant häufigere Remission ohne Therapie
nach 12 und 24 Monaten von 85% und 83% [115]. Dies verdeutlich erneut den Einfluss eines
hochsensitiven Monitorings. Wiederum wurde ebenfalls gezeigt, dass sich eine Quantifizierung
des BCR-ABL1 Fusionsgens selbst in Fällen erfolgreicher TKI-Stopps als positiv erweisen
kann [77, 118]. Dies deutet darauf hin, dass die Abhängigkeit von der momentanen
Transkriptionsrate der betroffenen Zellen ein Problem der mRNA-basierten Quantifizierung ist.
Begibt sich eine Ph+-Zelle in einen Ruhezustand, produziert diese keine BCR-ABL1
Transkripte mehr. Exprimieren die betroffenen Zellen kein BCR-ABL1 Transkript (mRNA),
kann die BCR-ABL1 Kopienzahl unter der Nachweisgrenze liegen, obwohl sich am
eigentlichen Bestand der CML-Zellen nichts geändert hat. Tatsächlich wurde der CML-Zellklon
also nicht vollständig eradiziert. Im Gegenteil, sobald kein TKI mehr anwesend ist, könnten
sich die verbliebenen CML-Zellen wieder mit einer hohen Zellproliferation und BCR-ABL1
Expression zeigen. Bei dieser Problematik kann sich die zusätzliche Quantifizierung der DNA
des BCR-ABL1 Fusionsgens als sehr wertvoll erweisen, da auf diese Weise auch
transkriptnegative CML-Zellen detektiert werden können.

Darüber hinaus gibt das Monitoring der DNA und der mRNA in Kombination weitere
Zusatzinformationen über die Wirkung und das Ansprechen der eingesetzten Therapie.
Betrachtet man das Verhältnis der beiden Biomarker im Krankheitsverlauf ergeben sich
Einblicke in die Zellbiologie der Ph+-Zellen in Bezug auf Transkriptionsrate und deren mittleres
Überleben [90, 119].

37
Aufgrund der TKI-Therapie mit dessen spezifischen Nebenwirkungen in pädiatrischen
Patienten, wie z.B. der nachweislich hemmende Effekt auf das Längenwachstum oder der
verminderten Fertilität, stellt der Therapiestopp eine wichtige Therapieoption dar [54, 61, 120].

Alle Patienten in Studien zur TKI-Pausierung (sowohl adult als auch pädiatrisch) zeigten bei
engmaschigem molekularem Monitoring kein klinisches Rezidiv [22, 64, 65, 121, 122]. Bei
Feststellung des molekularen Rezidivs wurde die TKI-Therapie wieder begonnen. So zeigte
Ross et al. bei erwachsenen CML-Patienten nach 24 Monaten eine Rezidivfreiheit von 47,1%
ohne Imatinib mit gleichzeitigem Nachweis pateintenspezifischer BCR-ABL1 DNA in allen
eingeschlossenen Patienten [123]. Das Ansprechen auf die medikamentöse Therapie
entspricht dem der therapienaiven Patienten und zeigte keine Benachteiligung in der Wirkung
durch die Therapieunterbrechung [22, 65, 124, 125]. Nun stellt sich die Frage, ob die
Optimierung oder Ergänzung der MRD-Messung durch das DNA-basierte Monitoring die
Prognose und die Sicherheit eines Auslassversuchs verbessern kann. Damit ergibt sich die
Notwendigkeit das MRD-Monitoring zu erweitern bzw. zu optimieren, um damit ein DNA-
basiertes Monitoring für alle Patienten verfügbar zu machen.

Dass die Verwendung der Fusionsgen-DNA noch keine Standardmethode zum Monitoring der
MRD ist, liegt vor allem am technischen Aufwand, den dies mit sich bringt. Anders als beim
Transkript, muss bei der DNA die Fusionssequenz jedes einzelnen Patienten vollständig
sequenziert bzw. analysiert werden. Darauffolgend müssen spezifische Primer und Sonden
für jedes Assay gefunden werden [40, 76, 82]. Allerdings steht dieser Aufwand einer immens
langen Krankheits- und Therapiedauer über viele Jahrzehnte gegenüber. Zusätzlich handelt
es sich bei der pädiatrischen CML um eine Krankheit mit sehr geringer Inzidenz von ca. 1-2,2
Neuerkrankungen pro 1 Millionen unter 19-Jährigen jährlich [20, 37]. Sind einmal alle
Fusionssequenzen der momentan diagnostizierten pädiatrischen CML-Patienten
aufgearbeitet, müssen also ca. 10 neue patientenspezifische Assays pro Jahr gefunden
werden. Der Aufwand, für jeden betroffenen Patienten einen Assay zu entwickeln, ist also in
Bezug auf die Prävalenz der Erkrankung abschätzbar und umsetzbar.

Tatsächlich ergibt die ddPCR vor allem im Bereich der grenzwertigen Nachweisbarkeit (<10-4)
deutlich häufiger ein positives Messergebnis bei der Quantifizierung der DNA. Zhao et al.
verglich den Einfluss von Störfaktoren und die Sensibilität von ddPCR und quantitativer PCR
und kommt ebenfalls zum Ergebnis, dass vor allem im Bereich der grenzwertigen
Nachweisbarkeit die ddPCR eine höhere Sensitivität aufweist und eine geringere inter-assay
Variabilität, was auch Hindson et al. in Bezug auf miRNA zeigen konnte [80]. Allerdings wurde
in den genannten Arbeiten bakterielle, also als Plasmid vorliegende, DNA und RNA eingesetzt
[81]. Della Starza et al. bestätigten diese erhöhte Sensitivität im Falle des MRD-Monitorings
von pädiatrischer B-ALL unter Einsatz humaner DNA. Konkret konnten 14 von 78 Messungen

38
quantifiziert werden, die in der RQ-PCR als nicht quantifizierbar (aber positiv) gemessen
wurden. Des Weiteren wurden 13,4% zusätzlich positive ddPCR-Ergebnisse detektiert, welche
in der RQ-PCR negativ quantifiziert wurden [79]. Zum einen könnte dies auf das zellbiologische
Modell der, in Bezug auf die Proliferation, ruhenden Leukämie-Zelle zurückgeführt werden
[126]. So untersuchten Su Chu et al. die Persistenz von BCR-ABL1 in Progenitorzellen nach
Imatinibtherapie über mindestens 4 Jahre, indem sie mitthilfe von Flowzytometrie und
immunmagnetischer Selektion die im Knochenmark befindlichen CD34+ Zellen isolierten.
Anschließend wurden diese Zellen in immundefiziente Mäuse transplantiert. Die Quantifikation
des BCR-ABL1 Transkripts erfolgte 11-12 Wochen nach Transplantation. Dabei wurde in allen
transplantierten Mäusen Fusionstranskript nachgewiesen, was auf eine lange Persistenz von
Ph+ Stammzellen hinweist [127]. Zum anderen könnte die im Vergleich zur DNA deutlich
kürzere Halbwertszeit von mRNA im peripheren Blut eine Rolle spielen. Insgesamt zeigen die
gegeneinander aufgetragenen Verläufe des Transkripts und des Fusionsgens aber
nachvollziehbare Differenzen mit parallelen Schwankungen. Genau diese positiven
Nachweise der MRD an der Grenze der Nachweisbarkeit können bei der Entscheidung über
eine Therapiepause der TKIs eine entscheidende Rolle spielen. Eine länger anhaltende
Abwesenheit der BRC-ABL1 Fusionsgene könnte laut Mattarucchi et al. mögliche Kandidaten
für einen Auslass mit einer höheren Erfolgsrate identifizieren als die Evaluation allein auf Basis
des mRNA-basierten Monitorings [77].

Der Einfluss eines kombinierten molekularen Montorings von Transkript und Fusionsgen auf
die Wahrscheinlichkeit eines anhaltenden therapiefreien Überlebens wurde von Machova
Polakova et al. weiter untersucht. Dabei zeigte sich, dass das DNA-basierte Monitoring, hier
sowohl mit RQ-PCR und sondenbasierter ddPCR durchgeführt, vor allem im Zeitraum der
tiefen molekluaren Remission (DMR) ein Nachweis des BCR-ABL1 Fusionsgens die
Wahrscheinlichkeit der therapiefreien Remission (TFR) beeinflusst. Durch ein mathematisches
Modell wurde festgestellt, ob die RNA oder DNA während der DMR in Bezug auf die
Sensitivität der Probe als positiv oder negativ bewertet wurde. Abhängig davon wurde ein
Ampelsystem zur Risikostratifizierung vorgeschlagen. Grün beschreibt die Gruppe mit
negativem Transkript und Fusionsgen, gelb positives Transkript und negatives Fusionsgen
und rot Positivität beider Marker. Interessanterweise gab es keinen Verlauf mit positiver mRNA
und negativer DNA. Dabei ergaben sich signifikante Unterschiede im Überleben ohne
molekulares Rezidiv (MRFS). Nach 18 Monaten ohne Therapie wurde ein MRFS von 100% in
der grünen Gruppe beobachtet, während in der gelben 67% und 20% in der roten Gruppe
dieses Kriterium erfüllten. Verglich man die prognostische Aussagekraft der einzelnen
Monitoringmethoden, unterschied sich diese zwischen den beiden kaum. Die Kombination
beider Methoden erhöhte die Aussagekraft aber signifikant [128]. Dies verdeutlicht die
Notwendigkeit eines gut funktionierenden und standardmäßig einsetzbaren Monitorings des

39
BCR-ABL1 Fusionsgens. Dabei zeigt sich die entwickelte large amplicon ddPCR
vielversprechend, um das DNA-basierte Monitoring bei der pädiatrischen CML routinemäßig
zu ermöglichen. Somit stellt die Quantifizierung des BCR-ABL1 Fusionsgens eine wichtige
Ergänzung der MRD-Bestimmung der CML im Kindesalter dar und kann die Prognose der TKI-
Auslassversuche und deren Risikostratifizierung verbessern.

40
Anhang

Literaturverzeichnis
1. Spivak, J.L., Myeloproliferative Neoplasms. New England Journal of Medicine, 2017. 376(22):
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undetectable minimal residual disease: results from the TWISTER study. Blood, 2013. 122(4):
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124. Millot, F., et al., Imatinib cessation in children and adolescents with chronic myeloid leukemia
in chronic phase. Pediatr Blood Cancer, 2014. 61(2): p. 355-7.

46
125. Saussele, S., et al., Discontinuation of tyrosine kinase inhibitor therapy in chronic myeloid
leukaemia (EURO-SKI): a prespecified interim analysis of a prospective, multicentre, non-
randomised, trial. The Lancet Oncology, 2018. 19(6): p. 747-757.
126. Kumari, A., et al., Low BCR-ABL expression levels in hematopoietic precursor cells enable
persistence of chronic myeloid leukemia under imatinib. Blood, 2012. 119(2): p. 530-539.
127. Chu, S., et al., Persistence of leukemia stem cells in chronic myelogenous leukemia patients in
prolonged remission with imatinib treatment. Blood, 2011. 118(20): p. 5565-5572.
128. Machova Polakova, K., et al., Analysis of chronic myeloid leukaemia during deep molecular
response by genomic PCR: a traffic light stratification model with impact on treatment-free
remission. Leukemia, 2020. 34(8): p. 2113-2124.

Abkürzungsverzeichnis
CML chronisch myeloische Leukämie
ALL akute lymphatische Leukämie
Ph+ Philadelphia-Chromosom-positiv
TKI Tyrosinkinaseinhibitor
PCR Polymerasekettenreaktion
RQ-PCR Quantitative reverse-Transkriptase PCR
ddPCR digital droplet PCR
bp Basenpaare
DNA Desoxyribunukleindsäure
RNA Ribonukleinsäure
mRNA Messenger RNA
CMR Complete molecular remission
FISH Fluoreszens-in-situ-Hybridisierung
KM Knochenmark
TFR treatment free remission
MRFS molecular relapse free survival

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Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 single quenched und double quenched Sonden Schematische Darstellung

der als Sonden verwendeten Oligonukleotide und Vergleich der Funktion und des Aufbaus von
single und double quenched Sonden; rechts: Einsatz eines zweiten, internen Silencers näher
am Fluoreszenspartikel positioniert und damit vermindertes Ruhesignal

Abbildung 2 Auswirkung der Asservierungsmethode auf die BCR-ABL1 Quantifizierung

A Auswertung der ddPCR mit beschriebenem Ausfall einer Heparinprobe. Links: Auswertung
als einzelne droplets nach Festsetzung des thresholds anhand der Kontrolle; rote Markierung:
ausgefallene Probe; Rechts: Auswertung derselben Messung als Säulendiagramme pro
Zeitpunkt von Albumin und des patientenspezifischen Amplifikats 1B MRD Verlauf BCR-ABL1
Transkript und DNA im Vergleich mit Auswirkung des Heparinausfalls in der Auswertung, 1C
Verwendete Asservierungsmedien der Blut- und Knochenmarksproben und deren Anteil an
ausgefallenen Proben

Abbildung 3 Sondentestung von single- wie auch double-quenched Sonden im Vergleich (UPN3)
A graphische Auswertung der droplets einer ddPCR zur Testung von Sonden der beiden Typen unter
Einsatz eines Temperaturgradienten B Vorteile der double quenched Sonden bei der
Amplitudendifferenz positiver zu negativen droplets und Anzahl an falsch positiven droplets

Abbildung 4 Schematische Darstellung eines breakpoints von BCR-ABL1 sowie der

Notwendigkeit und des Effekts eines größeren Amplifikats A Verschieben des forward
Primers ans Ende von BCR um den großen repeat zu umgehen B kleinerer repeat auf ABL1
mit entsprechendem Setzen des backward Primers weiter entfernt zum Bruchpunkt auf ABL1;
beide Primerdesigns führen zu einem größeren PCR-Produkt

Abbildung 5 Auswertung der Signalamplitudendifferenz (Singalstärke positives droplet

und Singalstärke negativer droplets jeweils im Mittel) in Abhängigkeit der Größe des PCR-
Amplifikats

Abbildung 6 Korrelation des BCR-ABL1 Fusionsgens und der mRNA Ergebnisse der
Quantifikationen aller Zeitpunkte bzw. Proben des BCR-ABL1 Transkripts und der BCR-ABL1
DNA

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Tabelle Repeat-Sequenzen
Tabelle 7 Aufstellung der Verteilung und der Art der repeat-Sequenzen der quantifizierten Fusionsgene rote Färbung: auf BCR liegenden repeats und repeat-Abschnitte grün: auf ABL1 liegenden
repeats und repeat-Abschnitte; (=): repeats überspannen den Bruchpunkt, Anteile separat eingefärbt

Sequenzierter Abstand zu
Abschnitt des Anteil Länge Anteil Länge Beginn repeat Ende repeat in Länge repeat Bruchpunkt in
Patient Repeat-Typ
Fusionsgens BCR ABL1 in bp bp in bp bp
in bp
UPN1 961 203 659 SINE/Alu 292 358 66 89
DNA/hAT-Charlie 465 615 150 262
DNA/hAT-Charlie 359 424 65 156
SINE/Alu 616 906 290 413
UPN2 545 227 318 /
UPN3 1469 300 1170 LINE/L1 16 726 710 =(-285/+427)
SINE/Alu 728 839 111 428
LINE/L1 841 1160 319 541
SINE/Alu 1177 1462 285 877
UPN4 549 235 315 /
UPN5 682 276 406 Simple repeat 267 289 23 =(-10/+13)
UPN12 791 71 720 /
UPN16 753 347 406 SINE/Alu 348 486 139 1
UPN17 567 71 496 Simple repeat 62 93 32 =(-10/+22)
SINE/Alu 139 382 244 68
UPN18 644 259 385 SINE/Alu 1 260 260 =(-259/+1)
UPN21 617 278 339 SINE/Alu 6 280 275 =(-273/+2)
UPN22 773 536 237 SINE/Alu 332 538 207 =(-205/+2)
SINE/Alu 558 773 216 22
UPN23 752 206 546 LINE/L1 239 547 309 33

49
UPN28 635 214 421 SINE/Alu 1 215 215 =(-214/+1)
LINE/L1 237 518 282 23
SINE/Alu 539 629 91 325
UPN33 782 587 195 SINE/Alu 376 776 401 =(-212/+189)
UPN34 842 419 423 SINE/Alu 457 557 101 38
LINE/L1 592 735 144 173
LINE/L1 744 1061 318 325

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Danksagung

Mein Dank gilt an erster Stelle Prof. Dr. med. M. Metzler für die Überlassung dieses klinisch
relevanten und spannenden Themas und die durchgehend ausgezeichnete Betreeung und
den motivierend hohen inhaltlichen Anspruch.
Besonders danke ich PD Dr. rer. nat. Manuela Krumbholz für die geduldige Betreuung und die
mehr als selbstverständliche Hilfestellung, sowie strukturierte Anleitung sowohl im praktischen
als auch theoretischen Teil der Forschungsarbeit.
Ich danke Ihnen beiden für die vorbildliche Betreuung, die aufgebrachte Geduld und die stets
hilfreiche Kritik, wodurch der Abschluss dieser Arbeit erst ermöglicht wurde.
In diesem Zug möchte ich mich auch bei den Mitarbeitern des Labors, vor allem Frau Ulla
Jacobs und Sabine Semper danken. Vielen Dank für die immer freundliche und sehr
angenehme Unterstützung im Laboralltag sowie die fachlich kompetente Einarbeitung in die
praktische Umsetzung der Versuche.
Ein herzlicher Dank geht an meine Familie, sowohl die angeborene und natürlich auch die
selbst ausgewählte um die Wohngemeinschaft der Lammersstraße. Ich danke euch für die
Wärme, Unterstützung und euren alles prägenden Einfluss, der noch weit über diese Arbeit
hinausreicht.
Insbesondere danke ich dabei meinem Vater Georg Albert für seine genaue und
unwahrscheinlich schnelle Hilfe bei der Korrektur der Rechtsschreibung.

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