AMOBILISASI ENZIM UREASE DARI KACANG MERAH MENGGUNAKAN

KITOSAN-BENTONIT
Dini Ika Lasniati Age − K1A015041
Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jenderal Soedirman
Email: diniikala@gmail.com
Abstrak
Urease merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis urea menjadi amonia dan karbon
dioksida. Enzim urease yang digunakan dalam penelitian ini diekstraksi dari biji kacang merah.
Efisiensi enzim urease dapat ditingkatkan dengan amobilisasi enzim menggunakan matriks kitosan-
bentonit. Tujuan dari penelitian ini adalah ekstraksi enzim, amobilisasi enzim, dan karakterisasi
enzim urease amobil. Penelitian ini diawali dengan ekstraksi enzim urease pada variasi waktu
germinasi biji kacang merah. Aktivitas urease ditentukan menggunakan reagen Nessler dan diukur
dengan spektrofotometer. Enzim urease dengan aktivitas optimum ditunjukan oleh biji dengan waktu
germinasi 8 hari. Amobilisasi enzim urease menunjukkan kondisi optimum pada konsentrasi bentonit
3% (b/v) dari total volume beads; TPP 3% (b/v); dan waktu perendaman 60 menit. Hasil karakterisasi
enzim urease bebas memiliki kondisi optimum pH 7, suhu 35 ºC, nilai KM 4,46 mM, dan Vmaks 25,25
mM/menit. Enzim urease amobil memiliki kondisi optimum pH 7, suhu 40 ºC, nilai KM 5,80 mM,
dan Vmaks 9,50 mM/menit. Kestabilan enzim urease amobil menunjukkan bahwa enzim urease amobil
dapat digunakan hingga 4 kali pemakaian.
Kata kunci : Amobilisasi, urease, kacang merah, kitosan, bentonit
ABSTRACT
Urease is an enzyme catalyzes the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide. Urease
enzyme extracted from the seeds of red beans. The urease enzyme efficiency can be improved by
immobilization using matrix of chitosan-bentonite. The purpose of this study were the extraction,
immobilization, and characterization of urease enzyme. The reserch was started by the extraction of
urease enzyme on a variety of red bean seed germination time. The urease activity was determined
using a Nessler reagent and measured by a spectrophotometer. Urease enzyme with optimum activity
shown by the seeds with germination time of 8 days. The Immobilization of urease showed optimum
conditions at bentonite concentrations of 3% (b/v); TPP 3% (b/v); and 60 minutes soaking time. Free
urease enzyme showed optimum conditions of pH 7, temperature 35 ºC, KM value of 4.46 mM, and
Vmax 25.25 mM/min. The immobilized urease enzyme has the optimum condition pH 7, temperature
40 ºC, KM value of 5.80 mM, and Vmax 9.50 mM/min. The immobilized urease enzyme in chitosan-
bentonite can be used up to 4 reaction.
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Nitrogen merupakan unsur penting bagi tanaman untuk pertumbuhan. Urea merupakan sumber
nitrogen yang penting bagi tanaman dan nutrisi yang satu ini dapat diperoleh dari tanah (Cantarella
et al., 2018). Urea juga diperoleh tanaman dari katabolisme arginin. Urea merupakan sumber nitrogen
utama untuk tanaman, akan tetapi nitrogen pada urea tidak dapat dimanfaatkan secara langsung oleh
tanaman. Nitrogen pada urea dapat diakses setelah urea dihidrolisis menjadi amonia dan karbon
dioksida. Enzim yang berperan dalam hidrolisis urea menjadi amonia dan karbon dioksida adalah
urease (Witte, 2011). Urease merupakan suatu enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis urea dengan
laju 1014 kali lebih cepat dibandingkan dengan reaksi yang berjalan tanpa adanya bantuan enzim
(Krishna et al., 2011).
Enzim urease dapat ditemukan pada mikroorganisme, tanaman, dan juga hewan (Cantarella et al.,
2018). Aktivitas urease ditemukan pada semua jaringan tanaman (Witte, 2011). Selama masa
perkecambahan biji, urease akan menghidrolisis urea yang terbentuk akibat adanya aktivitas dari
enzim arginase pada siklus urea. Hasil hidrolisis urea tersebut akan membentuk karbamoil fosfat yang
akan masuk kembali ke dalam siklus urea (Zonia et al., 1995).
Enzim urease telah berhasil diisolasi dari berbagai biji-bijian seperti pada biji buncis (Pervin et
al., 2013), biji nangka (Chouhan et al., 2018), biji kacang panjang (Zusfahair et al., 2018), kacang
tolo (Zusfahair et al., 2018), dan biji pare (Krishna et al., 2011). El-Hefnawi et al. (2014) telah
berhasil mengisolasi enzim urease pada kacang polong (Pisum sativum L.) yang terlebih dahulu
dilakukan germinasi (perkecambahan). Zusfahair et al., (2018) juga telah berhasil mengisolasi enzim
urease dari biji kacang panjang (Vigna unguiculata subsp sesquipedalis L.) yang terlebih dahulu
dibuat kecambah. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa waktu germinasi berpengaruh pada
aktivitas enzim urease.
Salah satu biji-bijian yang berpotensi menghasilkan enzim urease adalah kacang merah. Kacang
merah dimanfaatkan sebagai sumber makanan serta dijadikan sebagai sumber protein dan
karbohidrat. Kacang merah diketahui mengandung protein 20-27% (Pitura & Arntfield, 2018).
Kandungan protein yang tinggi pada kacang merah memungkinkan tingginya kandungan enzim
urease di dalam kacang merah. Nilai ekonomis kacang merah dapat ditingkatkan dengan
memanfaatkan kacang merah sebagai sumber enzim urease.
Enzim umumnya dimanfaatkan dengan cara mereaksikan substrat dan enzim yang telah
dilarutkan dalam air. Hal ini membuat enzim bercampur dengan produk dan sulit untuk dipisahkan di
akhir reaksi, akibatnya kemampuan penggunaan enzim menjadi terbatas (Krajewska, 2004).
Kelemahan menggunakan cara ini adalah enzim hanya dapat digunakan sekali. Harga enzim yang
mahal membuat proses enzimatis ini menjadi tidak ekonomis saat diaplikasikan pada skala besar (Tan
et al., 2010). Cara yang dapat dilakukan untuk mengatasi kelemahan tersebut adalah dengan
amobilisasi enzim. Amobilisasi merupakan teknik pengikatan enzim pada padatan pendukung yang
tidak larut dalam air. Hal ini memungkinkan diperoleh enzim dalam keadaan aktif di akhir reaksi
(Krajewska, 2004).
Amobilisasi dapat dilakukan melalui beberapa metode seperti melalui pembentukan ikatan silang
(cross linking), pembentukan ikatan kovalen, adsorpsi dan penjebakan (entrapment) (Prasetyawan,
2017). Setiap metode memiliki ciri khas dan kelebihannya masing-masing. Metode yang digunakan
dalam penelitian ini adalah metode penjebakan (entrapment). Amobilisasi enzim menggunakan
metode penjebakan lebih banyak digunakan dibandingkan dengan metode amobilisasi lainnya.
Alasan yang membuat metode ini banyak digunakan karena pada metode ini enzim berada dalam
kondisi bebas tanpa terikat pada matriks pendukung sehingga fungsi katalitik dan struktur alami dari
enzim tidak terganggu. Keunggulan lain dari metode penjebakan adalah waktu persiapan yang singkat
dan biaya yang murah (Zusfahair et al., 2017).
Padatan pendukung yang digunakan dalam metode amobilisasi penjebakan salah satunya adalah
kitosan. Kitosan merupakan polisakarida nontoksik yang dibentuk dari N-deasetilasi kitin (Hristodor
et al., 2012). Kitosan banyak digunakan sebagai padatan pendukung dalam amobilisasi karena
bentuknya yang dapat dimodifikasi sesuai dengan kebutuhan (bentuk gel, serbuk, beads, serat, dan
membran), bersifat biodegradabel, tidak beracun, dan memiliki afinitas yang baik terhadap protein
(Mahargyani et al., 2017). Penggunaan kitosan pada amobilisasi umumnya menggunakan bentuk
beads. Beads yang terbentuk pada kitosan tersebut memiliki stablilitas pH dan suhu yang tinggi.
Namun, kerapatan yang terlalu dekat dengan air membuat kitosan mengapung. Selain itu, kitosan
memiliki struktur yang lunak sehingga mudah hancur. Masalah pada beads kitosan ini dapat diatasi
dengan menambah bubuk padat seperti bentonit untuk meningkatkan kekuatan mekanis dan densitas
beads (Chang & Juang, 2007).
Penelitian ini dilakukan dengan ektraksi urease dari kecambah kacang merah dan amobilisasi
enzim urease dari kacang merah. Kacang merah digerminasi pada waktu tertentu dan kemudian
dilakukan ekstraksi. Ekstrak kasar yang diperoleh diamobilisasi dengan menggunakan padatan
pendukung kitosan-bentonit. Optimasi pembuatan beads kitosan-bentonit dilakukan dengan variasi
berat bentonit, konsentrasi TPP yang digunakan dan waktu kontak dengan TPP. Beads optimum
dikarakteristik suhu dan pH.
Rumusan Masalah
1. Bagaimana aktivitas enzim urease yang dihasilkan dari biji kacang merah?
2. Bagaimana kondisi optimum amobilisasi enzim urease dari kacang merah dengan kitosan
bentonit beads?
3. Bagaimana karakteristik enzim urease amobil dari kacang merah dengan kitosan bentonit?
Tujuan Penelitian
1. Mengetahui aktivitas enzim urease yang dihasilkan dari biji kacang merah.
2. Mengetahui kondisi optimum amobilisasi enzim urease dari kacang merah dengan kitosan
bentonit beads.
3. Mengetahui karakteristik enzim urease amobil dari kacang merah dengan kitosan bentonit
Manfaat Penelitian
Meningkatkan nilai ekonomis dari kacang merah melalui penggunaanya sebagai sumber
enzim urease dan meningkatkan penggunaan berulang enzim urease dari kacang merah dengah cara
amobil pada matriks kitosan bentonit.
METODOLOGI PENELITIAN
Alat Dan Bahan
Alat yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah tabung reaksi (IWAKI Pyrex), gelas
ukur (IWAKI Pyrex), labu ukur (IWAKI Pyrex), gelas piala (IWAKI Pyrex), pipet ukur, pipet tetes,
mikropipet, tip, mortar dan pastle, magentic stirrer, stirrer, alat sentrifus (Ohaus), spektrofotometer
UV-Vis (Shimadzu UV-1800), SEM (Hitachi TM 3000), kuvet, lemari pendingin (LG), pH meter
(Hanna Instrument), inkubator, dan neraca analitik (Ohaus).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kacang merah basah yang diperoleh dari
penjual sayur di Pasar Wage Purwokerto, urea (Merck), kitosan komersial, bentonit putih komersial,
amonium sulfat, Na2HPO4 (Merck), NaH2PO4 (Merck), H2SO4 (Merck), Na-wolframat, pereaksi
Nessler (Merck), TPP (Merck), asam asetat (Merck), tris base, HCl (Merck), asam sitrat (Merck), dan
natrium sitrat (Merck).
Prosedur Penelitian
Penentuan kurva standar amonium sulfat
Larutan standar amonium sulfat dibuat dengan menggunakan konsentrasi 20, 30, 40, 50, dan
60 ppm. Sebanyak 1,5 mL larutan standar ditambah dengan 0,25 mL reagen Nessler dan diukur
absorbansinya degan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 500 nm. Blanko
dibuat dengan menggunakan 1,5 mL akuades ditambah dan 0,25 mL reagen Nessler. Kurva standar
dibuat berdasarkan respon linier, dimana kenaikan absorbansi akan berbanding lurus dengan
konsentrasi larutan (Skoog, 1994).
Isolasi enzim urease dari kacang merah
Perkecambahan kacang merah
Kacang merah yang digunakan dideterminasi di Fakultas Biologi Universitas Jenderal
Soedirman untuk mengetahui klasifikasinya. Kacang merah yang digunakan merupakan kacang
merah basah yang telah direndam dengan air. Wadah plastik diisi dengan kapas dan kemudian kapas
dibasahi dengan air. Kacang merah diletakan di atas kapas tersebut, lalu ditutup dengan menggunakan
plastik. Wadah disimpan di tempat yang gelap dan dilakukan pengamatan dan ekstraksi enzim setiap
0, 2, 4, 6, 8, dan 10 hari. Ekstrak enzim urease pada kacembah kacang merah dilakukan uji aktivitas
setelah ekstraksi (El-hefnawy et al., 2014).
Ekstraksi enzim urease dari kacang merah
Sebanyak 20 g kecambah kacang merah hari ke 0, 2, 4, 6, 8, dan 10 diambil, kemudian
dihaluskan dengan menggunakan mortar dan alu yang telah didinginkan, lalu ditambah dengan 80
mL buffer fosfat pH 7 (suhu 4 ºC). Larutan dihomogenkan dengan menggunakan stirrer selama 3 jam
(dalam kondisi dingin) sampai terbentuk 2 lapisan berupa filtrat dan endapan. Filtrat dan endapan
yang diperoleh dipisahkan dengan menggunakan kain muslin. Filtrat kemudian disentrifugasi pada
suhu 4 ºC dengan kecepatan 12000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh digunakan
sebagai ekstrak kasar urease (Zusfahair et al., 2018).
Amobilisasi urease pada matriks kitosan bentonit
Aktivasi bentonit
Sebanyak 10 gram bentonit ditambah dengan 50 mL H2SO4 2 M dan diaduk dengan magnetic
stirrer selama 24 jam. Bentonit kemudian disaring dan dicuci dengan menggunakan air panas sampai
terbebas dari ion sulfat. Bentonit dioven pada suhu 110-120 ºC sampai diperoleh berat konstan
(Sahara, 2011).
Proses amobilisasi
Larutan kitosan 2% (b/v) dibuat dengan melarutkan serbuk kitosan ke dalam asam asetat 1% (v/v).
Serbuk bentonit dilarutkan ke dalam 0,25 mL enzim urease dari kacang merah. Variasi konsentrasi
bentonit yang digunakan adalah 1; 2; 3; 4; dan 5% (b/v) total larutan beads. Sebanyak 4,75 mL larutan
kitosan 2% ditambah ke dalam larutan bentonit. Kemudian larutan diaduk hingga homogen. Larutan
yang telah homogen diambil dengan mikropipet dan dimasukan tetes demi tetes ke dalam larutan Na-
TPP 2% (b/v). Beads yang terbentuk dibiarkan selama 60 menit di dalam larutan TPP. Beads kitosan
bentonit diukur aktivitasnya dengan menggunakan reagen Nessler. Beads yang memiliki aktivitas
optimum kemudian digunakan untuk preparasi beads dengan variasi konsentrasi Na-TPP.
Penentuan konsentrasi Na-TPP optimum dilakukan dengan membuat beads pada bentonit
optimum. Variasi konsentrasi Na-TPP yang digunakan adalah 1; 1,5; 2; 2,5; 3; dan 3,5%. Beads
kitosan bentonit yang memiliki aktivitas paling optimum kemudian digunakan untuk preparasi beads
dengan variasi waktu kontak.
Penentuan waktu kontak optimum antara beads dengan Na-TPP dilakukan dengan membuat
beads pada konsentrasi bentonit dan Na-TPP optimum. Larutan dihomogenkan, kemudian diteteskan
ke dalam Na-TPP dengan konsentrasi optimum dan didiamkan selama 30, 45, 60, 75, dan 90 menit.
Beads kitosan-bentonit yang memiliki aktivitas paling optimum kemudian dilakukan karakterisasi
enzim. Beads dengan aktivitas optimum dilihat morfologi permukaannya dengan menggunakan SEM.
Uji aktivitas urease bebas dan urease amobil
Uji aktivitas enzim urease bebas dilakukan dengan memasukan 1 mL larutan urea 1000 ppm
ke dalam tabung reaksi sampel kemudian ditambah dengan 1,95 mL buffer fosfat pH 7. Sebanyak
0,05 mL enzim urease ekstrak kasar kacang merah ditambahkan ke dalam tabung reaksi sampel.
Tabung reaksi diinkubasi selama 15 menit pada suhu 35 ºC. Tabung sampel setelah dingin ditambah
dengan 1 mL H2SO4 2/3 N dan 1 mL Na-wolframat.
Tabung reaksi kontrol diisi dengan 2 mL buffer fosfat dan 1 mL larutan urea 1000 ppm.
Larutan diinkubasi selama 15 menit. Tabung reaksi kontrol setelah dingin ditambah dengan 1 mL
H2SO4 2/3 N dan 1 mL Na-wolframat. Larutan pada tabung reaksi sampel dan kontrol disentrifugasi
selama 15 menit dan diambil bagian supernatannya. Masing-masing larutan kontrol dan sampel
diambil sebanyak 1,5 mL dan ditambah dengan 250 L reagen Nessler.
Uji aktivitas enzim amobil dilakukan dengan memisahkan beads dengan larutan TPP. Beads
dibuat dengan menggunakan perbandingan paling optimum yaitu 4,75 mL kitosan 2% (b/v); 0,25 mL
ekstrak kasar urease kacang merah; bentonit 3% (b/v) total larutan beads; TPP 2% (b/v); dan waktu
perendaman 60 menit. Beads yang terbentuk ditambah dengan 2,5 mL larutan urea 1000 ppm pada
pH 7. Beads diinkubasi selama 15 menit pada suhu 35 ºC. Beads dipisahkan dari larutan dan kemudian
larutan dilakukan pengukuran aktivitas dengan menggunakan reagen Nessler.
Larutan diukur dengan menggunakan spektrofotometer visibel dengan panjang gelombang
500 nm. Estimasi enzim urease dari biji kacang merah dilakukan dengan menggunakan kurva standar
ammonium sulfat (Zusfahair et al., 2018). Satu unit aktivitas adalah banyaknya amonia yang
terbentuk (dalam mol) per mL per menit dari hidrolisis urea oleh enzim urease pada sampel.
[S]-[K]
Vol. yang diukur x Vol. enzim x Waktu inkubasi
dimana,
[S] = konsentrasi amonia pada sampel
[K] = konsentrasi amonia pada kontrol
Vol. yang diukur = larutan yang diukur absorbansinya (1,5 mL)
Karakterisasi enzim amobil
Pengaruh variasi pH dan suhu pada aktivitas urease
Karakterisasi pH optimum pada aktivitas enzim urease bebas dan enzim urease amobil dari
kacang merah dilakukan dengan melarutkan substrat urea pada buffer dengan variasi pH dari 5 sampai
9. Pengaruh suhu pada enzim bebas dan amobil dilakukan dari suhu 30 ºC sampai 50 ºC dengan
interval 5 ºC. Larutan diuji aktivitasnya dan ditentukan pH dan suhu optimum.
Penentuan Laju Maksimum (Vmaks) dan Konstanta Michaelis-Menten (KM)
Parameter kinetik dilakukan dengan variasi konsentrasi substrat urea pada rentang 250-1250
ppm dalam kondisi optimum. Parameter kinetik ditentukan dari grafik lineweaver-burk. Larutan diuji
aktivitasnya dan ditentukan KM dan Vmaks.
Pengaruh penggunaan berulang dan penyimpanan enzim amobil
Pengaruh penggunaan berulang enzim amobil dilakukan dengan pemakaian berulang pada
enzim amobil sampai terlihat penurunan aktivitas urease. Setelah reaksi dilakukan, beads digunakan
kembali untuk hidrolisis urea. Pengaruh penyimpanan enzim amobil dilakukan setiap hari sampai
diperoleh penurunan aktivitas urease.
Analisis data
Data yang diperoleh akan dianalisis dengan menggunakan ANOVA oneway dengan uji Tukey
sebagai uji lanjutan untuk melihat hasil pengulangan serta perbedaan perlakuan antar variabel.
Variabel tetap dalam penelitian ini adalah suhu, pH, dan substrat. Variabel bebas dalam penelitian ini
adalah aktivitas urease.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembuatan Kurva Standar
Kurva standar dibuat berdasarkan Hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa absorbansi
berbanding lurus dengan konsentrasi (Zygmunt & Balcerzak, 2000). Respon linier yang dihasilkan
dari kenaikan absorbansi dengan konsentrasi ditampilkan dalam persamaan garis yang dapat
digunakan untuk menentukan aktivitas enzim. Kurva standar dibuat dengan mengukur absorbansi
larutan menggunakan spektrofotometer. Absorbansi yang dihasilkan digunakan sebagai sumbu Y dan
konsentrasi larutan sebagai sumbu X pada kurva standar.
Standar yang digunakan adalah larutan amonium sulfat. Konsentrasi amonium sulfat yang
digunakan dalam penelitian ini adalah 20, 30, 40, 50, dan 60 ppm. Berdasarkan pengukuran dengan
spektrofotometer, nilai absorbansi larutan meningkat seiring dengan bertambahnya konsentrasi
amonium sulfat sehingga diperoleh persamaan garis pada Gambar 4.1.

1,00
Absorbansi500nm

0,80 y = 0,0125x + 0,0212

0,60 R² = 0,9947
0,40
0,20
0,00
0 20 40 60 80
Konsentrasi (ppm)
 Gambar 4.1 Kurva standar amonium sulfat
Kurva standar pada Gambar 4.1 memberikan infromasi mengenai persamaan garis dengan
nilai R2 (koefisien determinasi) sebesar 0,9947. Hubungan linier dari kurva standar dinyatakan dalam
bentuk r (koefisien korelasi) yang merupakan hasil akar dari R2. Koefisien korelasi memiliki nilai
pada rentang -1 ≤ r ≤ 1. Nilai r yang dihasilkan dari kurva standar pada Gambar 4.1 sebesar 0,9973.
Nilai tersebut menunjukan bahwa hubungan antara konsentrasi amonium sulfat dengan absorbansinya
99,73% berbanding lurus. Hubungan linier antar variabel semakin kuat apabila nilai r semakin
mendekati 1 (Nawari, 2010). Berdasarkan nilai r yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa kurva
standar amonium sulfat memiliki respon linier yang kuat.
Pengaruh Waktu Perkecambahan Kacang Merah terhadap Aktivitas Enzim Urease
Pertumbuhan tanaman biji-bijian diawali dengan proses perkecambahan. Proses ini
membutuhkan peran enzim sebagai katalis berbagai reaksi biokimia pada biji tersebut (Darmayanti
et al., 2013). Enzim urease memiliki peran penting dalam hidrolisis urea. Hasil hidrolisis urea berupa
ion amonium dapat digunakan sebagai sumber nitrogen tanaman untuk sintesis senyawa yang
mengandung nitrogen. Siklus urea pada tanaman terjadi karena adanya amonia yang bersifat toksik
dari hasil degradasi asam amino (Witte, 2011).
Sumber enzim urease yang digunakan dalam penelitian ini adalah kacang merah. Sampel
kacang merah dilakukan determinasi untuk memastikan kebenaran spesiesnya. Hasil determinasi
menunjukan bahwa kacang yang digunakan masuk ke dalam famili Fabaceae dan genus Phaseolus.
Nama spesies dari kacang yang digunakan dalam penelitian ini adalah Phaseolus vulgaris L. (kacang
merah). Fabaceae atau suku polong-polongan merupakan salah satu tumbuhan dikotil. Tumbuhan
dari Fabaceae memiliki kesamaan yaitu buah yang berbentuk polong. Fabaceae dikenal sebagai suku
tumbuhan yang memiliki peran dalam fiksasi nitrogen dari udara karena memiliki akar yang dapat
bersimbiosis dengan bakteri tertentu (Heyne, 1987).
Perkecambahan kacang merah dilakukan selama 10 hari dengan menggunakan kapas basah
sebagai media tumbuh. Proses kecambah kacang merah dilakukan dalam kondisi gelap dengan tujuan
untuk mengoptimalkan proses perkecambahan. Kecambah kacang merah diamati dan dilakukan
ekstraksi setiap 2 hari sekali. Ekstrak yang diperoleh dilakukan pengukuran aktivitas urease untuk
mengetahui pengaruh waktu perkecambah kacang merah terhadap aktivitas enzim. Hasil pengukuran
aktivitas urease setiap ekstrak kecambah dapat dilihat pada Gambar 4.2.
14,0
Aktivitas Urease (U/mL)

12,0
10,0
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0
0 5 10 15
Waktu Perkecambahan (Hari)

Gambar 4.2 Kurva pengaruh waktu perkecambahan kacang merah terhadap aktivitas urease
Hasil pada ekstrak kacang merah menunjukkan bahwa aktivitas urease meningkat seiring
bertambahnya waktu perkecambahan. Aktivitas urease menurun setelah waktu kecambah 8 hari
(Gambar 4.2). Energi yang dibutuhkan pada awal perkecambahan cukup besar sehingga karbohidrat
sebagai sumber energi utama akan dirombak terlebih dahulu oleh enzim amilase. Pada saat cadangan
karbohidrat habis, lemak akan menjadi sumber energi untuk perkecambahan kacang merah (Bahri et
al., 2012). Proses penguraian karbohidrat dan lemak tidak membutuhkan bantuan enzim urease
sehingga aktivitas enzim urease pada awal perkecambahan kecil. Protein selanjutnya akan dirombak
menjadi asam amino untuk dijadikan sumber energi saat karbohidrat dan lemak sudah habis. Asam
amino akan diurai dengan menghasilkan amonia yang akan mengaktifkan siklus urea. Enzim urease
akan diproduksi untuk menghidrolisis urea yang dihasilkan dari siklus tersebut. Hal ini menyebabkan
aktivitas enzim urease terus mengalami kenaikan sampai hari ke-8. Aktivitas enzim urease mengalami
penurunan setelah hari ke-8. Aktivitas enzim urease menurun disebabkan oleh cadangan makanan
yang terdapat pada kotiledon mulai habis. Kotiledon merupakan cadangan makanan pada biji saat
berkecambah (Wardhani, 2019). Hal ini ditunjukan dengan kotiledon yang layu sebelum akhirnya
rontok.
Analisis data dilakukan dengan menggunakan oneway ANOVA diperoleh p <0,05. Hasil
tersebut menunjukkan bahwa waktu perkecambahan kacang merah memiliki pengaruh terhadap
aktivitas enzim urease. Analisis lanjut dilakukan dengan menggunakan uji Tukey dan menunjukkan
bahwa urease pada hari ke-8 memiliki nilai aktivitas yang berbeda nyata dengan enzim pada hari
lainnya. Berdasarkan analisis data yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa enzim urease optimum
pada perkecambahan hari ke-8 dengan nilai aktivitas sebesar 11,84 U/mL.
Amobilisasi Urease dengan Kitosan Bentonit
Amobilisasi merupakan proses yang digunakan untuk meningkatkan penggunaan berulang
enzim. Amobilisasi enzim urease pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode
penjebakan. Enzim pada metode penjebakan ditempatkan pada suatu matriks (Tanjung et al., 2013).
Matriks atau padatan pendukung yang digunakan dalam penelitian ini adalah kitosan bentonit.
Bentonit digunakan untuk memperbaiki struktur kitosan yang mudah mengapung dan hancur (Chang
& Juang, 2007).
Amobilisasi urease dengan padatan pendukung kitosan bentonit diawali dengan melarutkan
kitosan ke dalam asam asetat 1%. Kitosan akan terprotonasi pada gugus amina menjadi ion –NH3+
saat dilarutkan dalam asam asetat (Tanowidjojo et al., 2013).
Larutan kitosan dibuat dengan konsentrasi 2% (b/v) kemudian ditambah dengan bentonit 3%
(b/v) dari total volume beads dan 0,25 mL ekstrak kasar urease kacang merah. Larutan kemudian
diambil dengan mikropipet dan diteteskan pada larutan Na-TPP 2%. Larutan Na-TPP atau natrium
tripolifosfat sebelumnya dilarutkan dalam akuades akan menghasilkan ion hidroksil (-OH-) dan ion
tripolifosfat (P3O105-, P3O104-, dan H3P3O102-) (Alauhdin & Widiarti, 2014).
Ikatan silang akan terbentuk antara kitosan (-NH3+) dengan natrium tripolifosfat (H3P3O102-).
Bentonit yang bermuatan negatif akan melapisi pada bagian luar dengan berikatan pada sisi –NH3+.
Optimasi urease amobil dengan variasi berat bentonit
Variasi konsentrasi bentonit yang digunakan adalah 1; 2; 3; 4; dan 5% (b/v) dalam 5 mL total
larutan beads. Optimasi dilakukan dengan menggunakan 0,25 mL ekstrak kasar urease kacang merah,
4,75 mL kitosan 2% (b/v), TPP 2% (b/v), dan waktu perendaman selama 60 menit. Beads yang telah
terbentuk diukur aktivitasnya pada pH 7 dan suhu 35 ºC. Data hubungan antara berat bentonit dengan
aktivitas enzim urease amobil dapat dilihat pada Gambar 4.5.

5
Aktivitas urease (U/mL)

4
3
2
1
0
0 2 4 6
Konsentrasi bentonit (%, b/v)

Gambar 4.5 Kurva hubungan variasi berat bentonit dengan aktivitas enzim urease amobil
Kurva yang terdapat pada Gambar 4.5 menunjukkan bahwa aktivitas enzim urease amobil
mengalami kenaikan pada konsentrasi bentonit 1% sampai 3%. Enzim urease amobil mencapai
aktivitas maksimum sebesar 3,82 U/mL pada konsentrasi bentonit 3%. Aktivitas urease amobil
mengalami penurunan pada konsentrasi bentonit 4% hingga 5%. Penurunan aktivitas urease amobil
ini dapat disebabkan adanya peningkatan padatan pendukung yang mengakibatkan meningkatnya
halangan sterik dan resistensi difusi enzim (Cao et al., 2016).
Hasil analisis data menggunakan ANOVA oneway diperoleh nilai p-value <0,05 (Lampiran
7). Hal ini menunjukkan bahwa variasi berat bentonit memiliki pengaruh pada aktivitas urease
amobil. Uji lanjut dilakukan dengan menggunakan uji Tukey yang menunjukkan bahwa enzim amobil
dengan variasi konsentrasi bentonit 3% memiliki nilai aktivitas yang berbeda nyata dengan variasi
lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi bentonit 3% merupakan variasi optimum dalam
pembuatan enzim urease amobil dengan kitosan bentonit.
Optimasi urease amobil dengan variasi konsentrasi TPP
Variasi konsentrasi TPP yang digunakan adalah 1; 1,5; 2; 2,5; 3; dan 3,5% (b/v). Optimasi
dilakukan dengan menggunakan 4,75 mL kitosan 2% (b/v), 0,25 mL ekstrak kasar urease kacang
merah, bentonit 3% (b/v) total larutan beads, dan waktu perendaman selama 60 menit. Beads yang
telah terbentuk diukur aktivitasnya pada pH 7 dan suhu 35 ºC. Data hubungan antara variasi
konsentrasi TPP dengan aktivitas enzim urease amobil dapat dilihat pada Gambar 4.6.

8,0
Aktivitas urease (U/mL)

7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0 1 2 3 4
Konsentrasi TPP (%, b/v)

Gambar 4.6 Kurva hubungan variasi konsentrasi TPP dengan aktivitas enzim urease amobil
Kurva yang terdapat pada Gambar 4.6 menunjukkan bahwa aktivitas enzim urease amobil
mengalami kenaikan pada konsentrasi TPP 1% hingga 3%. Enzim urease amobil mencapai aktivitas
maksimum sebesar 6,76 U/mL pada konsentrasi TPP 3%. Aktivitas urease amobil mengalami
penurunan pada konsentrasi TPP 3,5%. Penurunan aktivitas enzim urease amobil ini dapat disebabkan
oleh beads yang terlalu keras sehingga pori-pori beads yang terbentuk semakin kecil. Pori beads yang
terlalu kecil dapat menganggu interaksi antara substrat urea dengan enzim urease (Zusfahair et al.,
2014).
Hasil analisis data menggunakan ANOVA oneway diperoleh nilai p-value <0,05 (Lampiran
7). Hal ini menunjukkan bahwa variasi konsentrasi Na-TPP memiliki pengaruh pada aktivitas urease
amobil. Uji lanjut dilakukan dengan menggunakan uji Tukey yang menunjukkan bahwa aktivitas
urease pada Na-TPP 3% berbeda nyata dengan variasi konsentrasi Na-TPP lainnya. Hal ini
menunjukkan bahwa konsentrasi Na-TPP 3% merupakan variasi optimum dalam pembuatan enzim
urease amobil dengan kitosan bentonit.
Optimasi urease amobil dengan variasi waktu perendaman
Variasi waktu kontak perendaman yang digunakan adalah 30, 45, 60, 75, dan 90 menit.
Optimasi dilakukan dengan menggunakan 4,75 mL kitosan 2% (b/v), 0,25 mL ekstrak kasar urease
kacang merah, bentonit 1% (b/v) total larutan beads, dan konsentrasi TPP 3% (b/v). Beads yang telah
terbentuk diukur aktivitasnya pada pH 7 dan suhu 35ºC. Data hubungan antara variasi waktu
perendaman dengan aktivitas enzim urease amobil dapat dilihat pada Gambar 4.7.
 7,0

Aktivitas urease (U/mL)

6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
0 15 30 45 60 75 90 105
Waktu perendaman (menit)

Gambar 4.7 Kurva hubungan variasi waktu perendaman dengan aktivitas enzim urease amobil
Kurva yang terdapat pada Gambar 4.7 menunjukkan bahwa aktivitas enzim urease amobil
pada awalnya rendah. Hal tersebut dapat disebabkan oleh ikatan silang antara kitosan dengan Na-TPP
masih sedikit sehingga enzim dapat dengan mudah keluar dari beads (Zusfahair et al., 2014).
Aktivitas enzim urease amobil mengalami kenaikan seiring lamanya waktu perendaman hingga
mencapai maksimum pada waktu perendaman 60 menit dengan nilai yang diperoleh 6,76 U/mL.
Aktivitas urease amobil mengalami penurunan pada waktu perendaman 75 menit hingga 90 menit.
Penurunan tersebut dapat disebabkan oleh beads yang semakin rapat sehingga substrat urea semakin
sulit untuk berinteraksi dengan enzim (Zusfahair et al., 2014).
Hasil analisis data menggunakan ANOVA oneway diperoleh nilai p-value <0,05 (Lampiran
7). Hal ini menunjukkan bahwa variasi waktu perendaman memiliki pengaruh pada aktivitas urease
amobil. Uji lanjut dilakukan dengan menggunakan uji Tukey yang menunjukkan bahwa aktivitas
enzim pada waktu perendaman 60 menit berbeda nyata dengan variasi waktu perendaman lainnya.
Hal ini menunjukkan bahwa waktu perendaman 60 menit merupakan variasi optimum dalam
pembuatan enzim urease amobil dengan kitosan bentonit.
Beads kitosan bentonit diamati pada setiap variasi yang dilakukan. Pengamatan dilakukan dari
segi bentuk, tekstur, dan ketahanan beads. Bentuk beads kitosan bentonit dapat dilihat pada Gambar
4.8.

(a)

(b)

Gambar 4.8 (a) Bentuk beads kitosan bentonit dengan formulasi bentonit 1%; TPP 2%; dan waktu
perendaman 60 menit (b) Bentuk beads kitosan bentonit dengan formulasi bentonit
3%; TPP 3%; dan waktu perendaman 60 menit
Beads kitosan bentonit dengan formulasi optimum memiliki bentuk yang bulat dan tidak mudah
hancur. Beads yang terbentuk tidak mudah menempel satu sama lain. Bentuk beads dengan formulasi
yang belum optimum memiliki bentuk yang tidak beraturan, mudah hancur dan mudah menempel
satu sama lain sehingga sulit untuk dipisahkan.
Morfologi permukan beads kitosan bentonit dapat diamati dengan menggunakan Scanning
Electron Microscope (SEM). Hasil pengamatan morfologi permukaan beads kitosan bentonit dapat
dilihat pada Gambar 4.9.

(a)

(b)

(c)
Gambar 4.9 SEM beads kitosan bentonit tanpa enzim (a), dengan enzim (b), dan setalah digunakan
4x (c)
Berdasarkan pada Gambar 4.15, permukaan beads kitosan bentonit tanpa enzim terdapat rongga yang
memungkinkan sebagai tempat untuk enzim. Permukaan beads kitosan bentonit setelah dilakukan
penambahan enzim menunjukkan permukaan yang lebih padat dengan rongga yang telah tertutup.
Penggunaan beads kitosan bentonit sebanyak 4x, membuat rongga yang tadinya telah tertutup
kembali terbuka. Hal ini menyebabkan enzim keluar dari beads sehingga aktivitas enzim urease
mengalami penurunan.
Karakterisasi Enzim Urease Bebas dan Amobil
Pengaruh pH terhadap aktivitas urease bebas dan amobil
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, salah satunya adalah pH. Enzim bekerja
dengan maksimal pada pH optimum. Lingkungan yang memiliki pH terlalu asam atau basa dapat
menyebabkan enzim mengalami denaturasi sehingga akan menurunkan aktivitas enzim (Yuliana,
2018). Penentuan pH optimum pada penelitian ini dilakukan pada enzim urease bebas dan amobil.
Enzim urease amobil dibuat dengan menggunakan formulasi pada kondisi optimum. Pengukuran
aktivitas dilakukan pada urease bebas dan amobil dengan berbagai variasi pH. Variasi pH yang
digunakan pada penelitian ini adalah pH 5, 6, 7, 8, dan 9. Hasil pengukuran aktivitas urease pada
pengaruh pH terhadap aktivitas enzim urease bebas dan enzim urease amobil dapat dilihat pada
Gambar 4.10.

20

Aktivitas Enzim (U.mL)

15

10
Enzim
5 bebas
Enzim
0 amobil
4 5 6 7 8 9 10
pH

Gambar 4.10 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim urease bebas dan amobil
Kurva pada Gambar 4.10 menunjukkan bahwa aktivitas tertinggi enzim urease bebas dan
amobil terdapat pada pH 7 dengan nilai yang diperoleh adalah 15,46 U/mL dan 7,30 U/mL. Aktivitas
enzim berhubungan erat dengan struktur enzim. Perubahan pada struktur enzim dapat mempengaruhi
aktivitas enzim. Enzim memiliki konformasi ideal pada pH optimum. Saat enzim berada di luar pH
optimum, maka enzim dapat mengalami penurunan aktivitas dengan cepat atau bahkan dapat
kehilangan aktivitas katalitiknya. Hal tersebut disebabkan oleh perubahan pada struktur tiga dimenasi
enzim. Perubahan yang terjadi membuat substrat tidak dapat berikatan dengan sempurna pada sisi
aktif enzim. Akibatnya, proses katalisis tidak berjalan dengan maksimal (Nurkhotimah et al., 2017).
Nilai aktivitas enzim urease dari kecambah kacang merah mengalami penurunan setelah dilakukan
amobilisasi enzim. Penurunan aktivitas ini dapat disebabkan oleh adanya padatan pendukung yang
menghalangi substrat urea untuk berikatan dengan enzim urease (Kusumaningtias et al., 2016).
Hasil analisis data menggunakan ANOVA oneway diperoleh nilai p-value <0,05 (Lampiran 8
dan 9). Hal ini menunjukkan bahwa variasi pH memiliki pengaruh pada aktivitas urease bebas dan
amobil. Uji lanjut dilakukan dengan menggunakan uji Tukey yang menunjukkan bahwa aktivitas
enzim urease bebas dan amobil pada pH 7 berbeda nyata dengan pH lain (Lampiran 8 dan 9). Hal ini
menunjukkan bahwa ekstrak kasar urease kacang merah bebas dan amobil memiliki pH optimum 7.
Enzim urease bebas dari biji nangka memiliki aktivitas optimum pada pH 6,9 (Chouhan et al., 2018).
Enzim urease bebas dari kacang panjang (Zusfahair, Riana, et al., 2018), kacang tolo (Zusfahair,
Ningsih, et al., 2018), dan kedelai (Kumar et al., 2009) memiliki aktivitas optimum pada pH 7.
Pengaruh suhu terhadap aktivitas urease bebas dan amobil
Suhu menjadi faktor lain yang mempengaruhi aktivitas enzim. Suhu yang terlalu rendah dapat
menghentikan kerja enzim. Kenaikan suhu lingkungan akan meningkatkan energi aktivitas sehingga
tumbukan antara enzim dan substrat meningkat. Hal tersebut terus berlangsung sampai suhu
optimum. Aktivitas enzim akan menurun di atas suhu optimum karena terjadinya denaturasi pada
enzim (Sumardjo, 2009). Penentuan suhu optimum pada penelitian ini dilakukan pada enzim urease
bebas dan enzim urease amobildengan variasi suhu 30, 35, 40, 45, dan 50 ºC. Hasil pengukuran
aktivitas urease pada pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim urease bebas dan enzim urease amobil
dapat dilihat pada Gambar 4.11.
 20

Aktivitas Enzim
15

(U.mL)
10 Enzim bebas
5
Enzim
0 amobil
25 30 35 40 45 50 55

Suhu ºC
Gambar 4.11 Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim urease bebas dan enzim urease amobil
Berdasarkan kurva pada Gambar 4.11 menunjukkan bahwa aktivitas tertinggi enzim urease bebas dan
amobil berturut-turut terdapat pada suhu 35 ºC dan 40 ºC dengan nilai yang diperoleh adalah 17,18
U/mL dan 7,25 U/mL. Sebelum mencapai suhu optimum, aktivitas enzim urease rendah dikarenakan
energi kinetik enzim rendah sehingga tumbukan antara enzim dan substrat sedikit. Kenaikan suhu
meningkatkan aktivitas enzim urease yang disebabkan oleh kenaikan energi kinetik molekul enzim.
Jika suhu terus dinaikan, maka energi kinetik yang tinggi dapat memutus ikatan-ikatan sekunder,
akibatnya struktur sekunder dan tersier enzim akan berubah. Perubahan yang terjadi membuat enzim
tidak dapat mengikat substrat dengan maksimal sehingga aktivitas enzim urease menurun
(Kusumaningtias et al., 2016).
Hasil analisis data menggunakan ANOVA oneway diperoleh nilai p-value < 0,05 (Lampiran
8 dan 9). Hal ini menunjukkan bahwa variasi suhu mempengaruhi aktivitas enzim urease bebas dan
amobil. Uji Tukey menunjukkan bahwa aktivitas enzim urease bebas pada suhu 35 ºC dan amobil
pada suhu 40 ºC berbeda nyata dengan aktivitas pada suhu lain. Hal ini menegaskan bahwa suhu
optimum enzim urease bebas yaitu 35 ºC dan enzim urease amobil yaitu 40 ºC.
Suhu optimum enzim urease bebas dari kacang merah mengalami kenaikan setelah
diamobilisasi dengan menggunakan kitosan bentonit. Suhu optimum untuk enzim urease bebas pada
penelitian ini adalah 35 ºC. Suhu optimum enzim urease yang diamobilisasi dengan menggunakan
kitosan bentonit adalah 40 ºC. Hal ini menunjukkan bahwa padatan pendukung kitosan bentonit
mampu melindungi enzim urease terhadap peningkatan suhu.
Enzim yang tersusun dari ribuan asam amino dapat mengalami denaturasi pada suhu tinggi
(Kusumaningtias et al., 2016). Peningkatan suhu optimum pada enzim urease amobil dapat
disebabkan oleh adanya padatan pendukung kitosan bentonit yang akan menyerap sejumlah panas
dan melindungi enzim dari denaturasi (Kumar et al., 2009). Peningkatan suhu optimum setelah
diamobilisasi juga terjadi pada enzim amilase dengan padatan pendukung kitosan (Laila et al., 2007),
enzim maltose dengan padatan pendukung alginat (Nawaz et al., 2015), serta enzim urease dengan
padatan pendukung kitosan dan alginat (Kumar et al., 2009).
Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas urease bebas dan amobil
Konsentrasi substrat menjadi faktor selanjutunya yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim
urease. Enzim bekerja secara spesifik pada substrat tertentu. Substrat yang digunakan dalam
penelitian ini adalah urea dengan konsentrasi 4,167; 8,33; 12,5; 16,67; dan 20,83 mM. Pengukuran
aktivitas urease bebas dan amobil dengan variasi konsentrasi substrat dapat dilihat pada Gambar 4.12.

25,0
Aktivitas urease (U/mL)

20,0
15,0
Enzim bebas
10,0
5,0 Enzim
amobil
0,0
0 10 20 30
Konsentrasi urea (mM)
Gambar 4.12 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim urease bebas dan enzim urease
amobil
Berdasarkan kurva pada Gambar 4.12 menunjukkan bahwa aktivitas enzim urease bebas dan
amobil mengalami kenaikan seiring dengan meningkatknya konsentrasi substrat urea. Aktivitas
enzim urease bebas dan amobil cenderung konstan setelah mencapai konsentrasi urea optimum. Hal
ini disebabkan oleh enzim yang seluruhnya sudah berikatan dengan substrat atau jenuh. Penambahan
konsentrasi substrat lebih lanjut tidak menyebabkan kenaikan aktivitas enzim (Sarni et al., 2015).
Aktivitas enzim urease bebas mengalami penurunan setelah dilakukan amobilisasi. Hal ini
disebabkan oleh adanya padatan pendukung kitosan bentonit yang menghalangi interaksi antara
substrat dan enzim (Kusumaningtias et al., 2016).
Hasil analisis data menggunakan ANOVA oneway menunjukkan bahwa aktivitas enzim
urease bebas dan amobil diperoleh nilai p-value <0,05 (Lampiran 8 dan 9). Hal ini menunjukkan
bahwa konsentrasi substrat urea mempengaruhi aktivitas enzim urease bebas dan amobil. Uji Tukey
yang dilakukan menunjukkan bahwa aktivitas enzim urease bebas dan amobil tidak berbeda nyata
pada konsentrasi 1000-1250 ppm.
Penentuan Laju Maksimum (Vmaks) dan Konstanta Michaelis-Menten (KM)
Enzim merupakan protein yang berperan sebagai katalis dalam berbagai reaksi biokimia. Laju
awal pada reaksi enzimatis meningkat seiring bertambahnya konsentrasi substrat hingga mencapai
kondisi konstan dimana penambahan konsentrasi substrat tidak lagi meningkatkan aktivitas enzim.
Saat semua enzim dalam keadaan jenuh dengan substrat, maka nilai laju reaksi enzimatis mencapai
maksimum (Vmaks). Semua sisi aktif enzim pada laju maksimum (Vmaks) akan berikatan dengan
substrat sehingga jumlah kompleks enzim-substrat sama dengan jumlah total enzim yang terdapat
dalam sistem. Jumlah substrat yang dibutuhkan untuk mencapai laju enzim juga memiliki peran yang
penting dalam kinetika enzim. Hal ini dituangkan dalam bentuk konstanta Michaelis-Menten (KM).
KM merupakan konsentrasi substrat yang dibutuhkan oleh enzim untuk mencapai setengah laju
maksimum. Nilai KM pada setiap enzim berbeda bergantung pada substrat dan enzim (Saropah et al.,
2012).
1 1
Vmaks dan KM dapat dihitung dengan membuat grafik hubungan V dan [S] sehingga akan
diperoleh persamian linier y = bx + a. Intersep (a) pada persamaan linier tersebut merupakan nilai
1 KM 1 1
dari Vmaks dan slope (b) merupakan nilai dari Vmaks. Data hubungan V dan [S] yang diperoleh berdasarkan
pada persaamaan Lineweaver-Burk dan penentuan Vmaks dan KM dapat diamati pada Lampiran 11.
1 1
Data tersebut disajikan dalam bentuk grafik hubungan antara V dan [S] pada Gambar 4.13.

0,3
y = 0,6109x + 0,1053
0,25 R² = 0,9985

0,2
1/V (menit/mM)

0,15
Enzim bebas
0,1
Enzim amobil
0,05 y = 0,1767x + 0,0396
R² = 0,9831
0
-0,25 -0,05 0,15 0,35
-0,05
1/[S] (mM-1)

1 1
Gambar 4.13 Grafik hubungan antara V dan [S] berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk pada enzim
urease bebas dan amobil
 Berdasarkan persamaan yang terdapat pada Gambar 4.13, nilai KM enzim bebas dan enzim
amobil yang diperoleh berturut-turut adalah 4,46 mM dan 5,80 mM. Nilai KM yang diperoleh enzim
bebas lebih kecil dibandingkan dengan enzim amobil. Nilai yang lebih kecil menunjukkan bahwa
enzim bebas memiliki afinitas yang lebih tinggi pada substrat urea dibandingkan dengan enzim
amobil (Kaushal et al., 2018). Urea membutuhkan waktu yang lebih banyak untuk mencapai lokasi
katalisis karena adanya halangan oleh padatan pendukung pada enzim urease amobil. Hal ini
menyebabkan peningkatan nilai KM pada enzim amobil (Mangaldas et al., 2010). Peningkatan nilai
KM enzim urease yang diamobilisasi juga terjadi pada amobilisasi urease menggunakan padatan
pendukung arilamine (Mangaldas et al., 2010), kitosan dan alginat (Kumar et al., 2009).
Proses amobilisasi tidak hanya mengubah nilai KM saja, akan tetapi juga mengubah nilai Vmaks.
Nilai Vmaks yang diperoleh pada penelitian ini untuk enzim bebas dan enzim amobil berturut-turut
adalah 25,25 mM/menit dan 9,50 mM/menit. Penurunan nilai Vmaks yang terjadi dapat disebabkan
oleh adanya hambatan substrat untuk menembus padatan pendukung (Nawaz et al., 2015).
Stabilitas Enzim Urease Amobil
Penggunaan berulang enzim amobil
Stabilitas enzim amobil dilakukan dengan penggunaan berulang enzim amobil untuk
mengetahui berapa kali enzim urease amobil dapat digunakan dalam hidrolisis urea. Proses
amobilisasi enzim memiliki tujuan untuk meningkatkan penggunaan berulang enzim. Hasil
pengukuran penggunaan berulang enzim urease amobil dapat dilihat pada Gambar 4.14.

120
Aktivitas relatif (%)

100 100,0
80 86,5

60 63,5
50,1
40
20 22,9
0
0 2 4 6
Penggunaan ke-

Gambar 4.14 Kurva penggunaan berulang enzim urease amobil

Berdasarkan kurva pada Gambar 4.14 menunjukkan bahwa enzim urease amobil mengalami
penurunan aktivitas pada penggunaan ke-1 sampai ke-5 dengan aktivitas pada penggunaan ke-5
adalah 22,9 % dari aktivitas awal enzim urease amobil. Aktivitas enzim urease amobil dengan
menggunakan kitosan bentonit efektif pada penggunaan ke-1 sampai penggunaan ke-4 karena
aktivitas relatif enzim urease amobil yang masih di atas 50 % (Lampiran 10). Penurunan aktivitas
pada penggunaan berulang enzim urease amobil dapat disebabkan oleh pelepasan enzim dari matriks
kitosan bentonit sehingga enzim yang terjebak di dalam padatan pendukung lebih sedikit. Pelepasan
enzim dapat disebabkan karena enzim tidak terikat pada padatan pendukung kitosan bentonit
melainkan terjebak di dalam padatan pendukung.
Waktu simpan enzim amobil
Stabilitas enzim amobil juga dilakukan dengan penyimpanan enzim amobil. Enzim amobil
dilakukan penyimpanan selama 10 hari di dalam kulkas untuk melihat pengaruh waktu penyimpanan
enzim amobil terhadap aktivitasnya. Hasil pengukuran aktivitas enzim urease berdasarkan waktu
penyimpanan enzim urease amobil dapat dilihat pada Gambar 4.15.
 120
100,0
100 92,1

Aktivitas relatif (%)

80,0 76,8
80 95,9 75,8
84,6
60 79,4 81,5

40 49,3 45,2
20
0
0 5 10
Waktu simpan (Hari)

Gambar 4.15 Kurva hubungan antara waktu penyimpanan enzim urease amobil dengan aktivitas
urease
Berdasarkan kurva pada Gambar 4.15 menunjukkan bahwa enzim urease amobil mengalami
penurunan aktivitas selama masa penyimpanan enzim. Aktivitas enzim urease amobil terus
mengalami penurunan dari hari ke-0 sampai hari ke-10. Aktivitas reatif enzim urease amobil pada
hari ke-9 memiliki nilai di bawah 50% dari aktivitas enzim urease di hari ke-0. Enzim dikatakan stabil
jika memiliki aktivitas sisa >50% aktivitas awal. Penurunan aktivitas dapat disebabkan oleh adanya
protease pada ekstrak kasar ureae kacang merah dan terjebak saat proses amobilisasi enzim. Preotease
merupakan enzim yang menghidrolisis protein termasuk enzim menjadi bentuk yang lebih sederhana
(Ardian et al., 2014).

Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa:
1. Enzim urease dari ekstrak kasar kecambah kacang merah memiliki aktivitas maksimum
pada kecambah hari ke-8 dengan aktivitas yang diperoleh 11,84 U/mL.
2. Optimasi pembuatan enzim urease amobil dari ekstrak kecambah kacang merah
menggunakan padatan pendukung kitosan bentonit diperoleh pada kitosan 2% (b/v);
bentonit 3% (b/v); konsentrasi TPP 3% (b/v); dan waktu perendaman 60 menit.
3. Enzim urease bebas dan amobil memiliki pH optimum 7 dengan suhu optimum enzim
urease bebas dan amobil berturut-turut adalah 35 ºC dan 40 ºC. Nilai KM untuk enzim
urease bebas dan amobil adalah 4,46 mM dan 5,80 mM, sedangkan untuk nilai Vmaks enzim
bebas dan amobil adalah 25,25 mM/menit dan 9,50 mM/menit.

Saran
Enzim urease dari ekstrak kecambah kacang merah perlu dilakukan pemurnian untuk
memperoleh nilai aktivitas yang lebih tinggi. Perlu dicari metode amobilisasi lain sehingga
penggunaan berulang enzim amobil lebih banyak.
DAFTAR PUSTAKA
Alauhdin, M. & Widiarti, N. 2014. Sintesis dan Modifikasi Lapis Tipis Kitosan-Tripolifosfat.
Jurnal MIPA. 37(1). 46–52.
Ardian, A., Roosdiana, A. & Sutrisno 2014. Pengaruh Suhu dan Lama Penyimpanan terhadap
Kestabilan Aktivitas Xilanase Diamobilisasi dalam Pasir Laut. Kimia Student Journal. 2(1). 386–
392.
Bahri, S., Mirzan, M. & Hasan, M. 2012. Karakterisasi Enzim Amilase dari Kecambah Biji Jagung
Ketan (Zea mays ceratina L.). Jurnal Natural Science. 1(1). 132–143.
Cantarella, H., Otto, R., Soares, J. R., De, A. G. & Silva, B. 2018. Agronomic Efficiency of NBPT
as a Urease Inhibitor: A Review. Journal of Advanced Research. Cairo University. 13. 19–27. doi:
10.1016/j.jare.2018.05.008.
Cao, S., Huang, Y., Li, X., Xu, P., Wu, H., Li, N. & Lou, W. 2016. Preparation and
Characterization of Immobilized Lipase from Pseudomonas Cepacia onto Magnetic Cellulose
Nanocrystals. Nature Reserch Journal. Nature Publishing Group. 6. 1–12.
Chang, M. & Juang, R. 2007. Use of Chitosan-Clay Composite as Immobilization Support for
Improved Activity and Stability of β-Glucosidase. Biochemical Engineering Journal. 35. 93–98.
Chouhan, S., V, P. V. & R, G. 2018. Extraction and Partial Purification of Urease Enzyme from
Jack Fruit. International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences. 9(2). 438–441.
Darmayanti, W., Suntoro, I. & Herpratiwi 2013. Isolasi dan Karakterisasi Aktivitas Enzim α-
amilase pada Kecambah Kedelai Putih (Glycine max (L). Merill) dan Kacang Hijau (Phaseolus
radiatus) di Bawah Pengaruh Medan Magnet. Jurnal Teknologi Informasi Komunikasi Pendidikan.
1(5).
El-hefnawy, M. E., Sakran, M., Ismail, A. I. & Aboelfetoh, E. F. 2014. Extraction, Purification,
Kinetic and Thermodynamic Properties of Urease from Germinating Pisum sativum L. Seeds. BMC
Biochemistry. 15(15). 1–8.
Ferita, I., Akhir, N. & Fauza, H. 2001. Pengaruh Intensitas Cahaya terhadap Pertumbuhan Bibit
Gambir (Uncaria gambir Roxb). Jerami. 2(2). 249–254.
Heyne 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Bogor: Badan Penelitian dan Pengembangan
Kehutanan.
Hristodor, C., Vrinceanu, N., Pui, A., Novac, O., Copcia, V. & Popovici, E. 2012. Textural and
Morphological Characterization of Chitosan/Bentonite Nanocomposite. Environmental Engineering
and Management Journal. 11(3). 573–578.
Kaushal, J., Singh, G. & Arya, S. K. 2018. Immobilization of Catalase Onto Chitosan and Chitosan-
Bentonite Complex: A Comparative Study. Biotechnology Reports. 18. 1–6.
Krajewska, B. 2004. Application of Chitin- and Chitosan-Based Materials for Enzyme
Immobilizations : a Review. Enzyme and Microbial Technology. 35. 126–139.
Krishna, B. L., Singh, A. N., Patra, S. & Dubey, V. K. 2011. Purification, Characterization and
Immobilization of Urease from Momordica charantia Seeds. Process Biochemistry. 46(7). 1486–
1491.
Kumar, S., Dwevedi, A. & Kayastha, A. M. 2009. Immobilization of soybean (Glycine max) urease
on alginate and chitosan beads showing improved stability: Analytical applications. Journal of
Molecular Catalysis B: Enzymatic. 58. 138–145.
Kusumaningtias, N., Mulyani, N. S. & Sarjono, P. R. 2016. Kalsium Alginat sebagai Pendukung
Amobilisasi L-Asparaginase dari Bawang Putih (Allium sativum). Jurnal Kimia dan Pendidikan
Kimia. 1(2). 7–15.
Laila, A., Fetra, A., Hendri, J. & Suka, G. 2007. Peningkatan Stabilitas Enzim Amilase melalui
Amobilisasi pada Polimer Kitosan. Jurnal Sains MIPA. 13(2). 119–126.