Endbericht Fermentation 791.

105 Angewandte Mikrobiologie bungen I

Verfasser: Peter Sucher, Bernd Innthaler 0840060, Roman Rybiczka 0840343, Michaela Haas 0840675

Zeitraum der LV: Betreuer der LV:

Inhaltsverzeichnis
1) EINLEITUNG: BATCH-KULTUR: FED-BATCH: E.COLI ALS EXPRESSIONSSYSTEM ALLGEMEINES ZUR EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE ZIELSETZUNG: MATERIAL UND METHODEN: EXPRESSIONSSYSTEM UND PROTEIN VERWENDETE GERTE: VERWENDETE CHEMIKALIEN: MEDIEN METHODEN: DURCHFHRUNG DES VERSUCHS HERSTELLUNG DER SCHTTELKULTUREN VORBEREITUNG DER BECHERGLSER FR DIE BTS BESTIMMUNG STERILISATION DES BIOFERMENTORS INBETRIEBNAHME DES BIOFERMENTORS: BATCH-PHASE AUFBEREITUNG DER PROBE FR DIE OD-BESTIMMUNG UND BIOMASSENBESTIMMUNG (BTS) ZUR MESSUNG DER OPTISCHEN DICHTE (OD600) PLASMIDSTABILITT AUSWERTUNG BATCH- PHASE FED- BATCH- PHASE: PLASMIDSTABILITT FLUORESZENZANALYSE RESTSUBSTRATANALYSE PROZESSDATEN ERGEBNISTABELLE LITERATURVERZEICHNIS 3 3 4 5 5 6 7 7 8 9 10 12 14 14 14 14 14 16 16 17 17 18 18 20 22 23 23 24 25 26

1) Einleitung:
Als Fermentation bezeichnet man die Kultivierung von Mikroorganismen in einem flssigen Nhrmedium in einem grotechnischen Mastab und unter kontrollierten Bedingungen. Als Mikroorganismen knnen Bakterien und Pilze, aber vor allem in der Herstellung von Medizinprodukten auch Tierzellen eingesetzt werden. Beim Fermentationsbeispiel der Lehrveranstaltung Angewandte Mikrobiologie bungen wird ein Escherichia coli-Stamm als rekombinanter Expressionshost verwendet, um das Protein GFP mglichst effizient zu exprimieren. Dazu wurde eine Kultivierung im Fermenter durchgefhrt. Verschiedene Einflussgren (z.B. pH-Wert, Temperatur, Sauerstoffzufuhr, usw.) auf das Geschehen im Fermenter konnten durch die Anwendung dieser Methode reguliert werden. E. coli zeichnet sich durch eine kurze Generationsdauer sowie eine kostengnstige und unkomplizierte Haltung aus und ist sehr gut erforscht. Das green fluorescent protein (GFP) sendet durch Anregung mit ultraviolettem Licht eine grne Fluoreszenz aus. Dieses Protein wurde erstmals 1961 aus der Qualle Aequorea victoria isoliert. In unserem Beispiel wird mit einer Mutation des GFPProteins, nmlich mit dem Stamm GFP mut3.1 gearbeitet. Dadurch ist es fr die Expression in E. coli optimiert und weist eine hhere Temperaturtoleranz sowie Fluoreszenzausbeute auf. Als Inokulum werden Bakterien verwendet, die bereits Expressionsvektoren (pET11a) mit inserierter GFP-Sequenz enthalten. [1] Bakterienstamm: WCB HMS174(DE3) + pET11a GFP mut 3.1 30.01.06

Batch-Kultur:
Das Inokulum wird dem Nhrmedium, das sich im Bioreaktor befindet zugegeben. Die Batch-Kultur durchluft sechs Wachstumsphasen: 1. Lag-Phase: Die Bakterien passen sich an das zur Verfgung gestellte Nrmedium und an die neuen Milieubedingungen an. 2. Beschleunigungsphase: Das Zellwachstum beginnt und die Zellmasse im Bioreaktor nimmt zu. Diese ersten beiden Phasen knnen vermieden werden, wenn der Mikroorganismus auf dem entsprechenden Medium bereits vorgezchtet und aus der exponentiellen Wachstumsphase berimpft wird. 3. exponentielle Wachstumsphase: Die Zunahme der Biomasse im Reaktor verluft exponentiell, gleichzeitig verringert sich aber auch die Substratkonzentration. 4. Verzgerungsphase: Die Wachstumsrate der Biomasse geht zurck und stoppt auf Grund der Nhrstofflimitierung und der Anreicherung von inhibierenden Stoffwechselendprodukten. 5. stationre Phase: Die Menge an Biomasse stagniert. 6. Absterbephase 3

Bei unlimitierter Nhrstoffversorgung wchst die Kultur mit maximaler Wachstumsrate. Ausgehend von einer bekannten Biomasseausgangskonzentration x0 [g/l] und der Wachstumsrate, in unserem Beispiel wurde zu Beginn mit 0,5 [h -1] angenommen, es kann die Endkonzentration nach einer bestimmten Zeitspanne t berechnet werden:

Bei Limitierung durch einen Faktor ermglicht die Monod-Kinetik, das Wachstum von Zellen in Abhngigkeit von der Konzentration desselben vorherzusagen:

Der Ertragskoeffizient:

Fed-Batch:
Der groe Vorteil des Fed-Batch gegenber dem Batch ist, dass man beim FedBatch die Wachstumsrate beeinflussen kann, das heit, dass sich die Kultur bei unlimitierter Nhrstoffversorgung mit maximaler Wachstumsrate vermehren kann. Aufgrund der Abhngigkeit von der Menge an vorhandenen Nhrstoffen ist der Batchprozess nicht fr die Produktion grerer Produktmengen geeignet. Durch eine exponentielle Zufuhr an Nhrmedium kann die Wachstumsrate der Kultur konstant gehalten werden. Die Berechnungen erfolgen analog zum Batch, jedoch bezogen auf die Masse [g] anstelle der Konzentrationen [gL-1]:

Berechnung der Volumenzunahme:

Umgeformt aus dem Ertragskoeffizienten ergibt sich die zuzufhrende Substratmenge fr den Zeitraum dt:

E.coli als Expressionssystem

Vorteile[1]: E.coli ist sehr gut untersucht. Viele Grundlagenuntersuchungen wurden an E.coli durchgefhrt. E.coli wird hufig zur Expression von Proteinen herangezogen wodurch sich im Laufe der Zeit sehr viel Information ber Nhrstoffansprche und Methoden der Kultivierung angesammelt hat. E.coli erreicht hohe Wachstumsraten. E.coli kann in verschiedenen Medien sehr gut kultiviert werden.

Nachteile[1]: Es ist keine posttranslationale Modifikation wie N- oder OGlycosylierung, Phosphorylierung oder Acetylierung mit E.coli mglich. E.coli neigt bei berproduktion von Proteinen zu Inclusion Bodies. Es kommt zu einer Aggregation in der Zelle.

Allgemeines zur Expression rekombinanter Proteine

Als Expressionsvektor fr rekombinante Proteine werden in den meisten Fllen Plasmide verwendet. Dies sind ringfrmige, extrachromosomale lokalisierte DNA-Molekle. Wichtig fr eine erfolgreiche Expression ist die Stabilitt des verwendeten Plasmids. Man unterscheidet 2 Arten von Plasmidstabilitt: Segregationelle Instabilitt: Verlust des Plasmids durch fehlerhafte Zellteilung Strukturelle Instabilitt: Vernderung der Plasmidstruktur

Da Plasmidzellen mehr Bedarf an Synthesebausteinen fr die Replikation, Transkription und Translation haben, weisen Plasmidzellen eine geringere Wachstumsrate als plasmidfreie Zellen auf. [1]

Zielsetzung:
Im Rahmen des Beispiels Fermentation sollen durch die Produktion eines rekombinanten Proteins (GFP), die unter der Kontrolle eines ProzesssteuerungsSystems durchgefhrt wird, die Elemente eines Bioprozesses nher betrachtet werden. Unter Verwendung des stirred tank reactors sollen grundlegende Prinzipien zur Kontrolle des mirobiellen Wachstums und der Produktbildung sowohl in einer Batch- als auch in einer Fedbatch-Kultur kennen gelernt werden.

Abb. 2.1: Reaktor in dem GFP mit UV-Licht angeregt und dadurch fluoresziert.

Material und Methoden:

Expressionssystem und Protein

Als Expressionssystem wurde das T7- Expressionssystem verwendet, das sich einer viralen RNA-Polymerase bedient, die im Vergleich zur RNAPolymerase von E.coli eine 5fach hhrere Aktivitt aufweist. Als Wirtsstamm wurde E.coli HMS174(DE3) verwendet, welcher einen lysogenen rekombinanten -Phagen DE3, der das Gen fr die T7 RNA-Polymerase unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors, trgt. Der Plasmidvektor ist ein sogenannter pET-Vektor (plasmid for expression by T7RNA polymerase). Das T7-Expressionssystem ist ein Kaskadensystem. Die Transkription des rekombinanten Gens auf den pET Plasmiden wird durch die Induktion der T7 RNA-Polymerase Expression im Wirtsstamm eingeleitet. Die Expression der T7 RNA-Polymerase steht unter der Kontrolle des lacUV5-Promoters, und es wird auch ohne Induktion eine geringe Menge an Polymerase gebildet, was meist unerwnscht ist. Fr eine Reduktion der Expressionshhe im nicht induzierten Zustand wird ein pET-Vektor mit einem kombinierten T7/lac-Promotor verwendet (pET 11a). Der T7/lac-Promotor enthlt eine 25bp lange lac Operator Sequenz und die Expression des rekombinanten Proteins unterliegt somit einer doppelten Kontrolle, sowohl bei der Expression der T7 RNA-Polymerase, als auch bei der Transkription des rekombinanten Gens. GFP (Green Fluorescent Protein) besteht aus 238 Aminosuren (28kd) und stammt ursprnglich aus der Qualle Aequorea victoria. Die Eigenfluoreszenz dieses Proteins beruht auf einer Chromophorbildung durch Zyklisierung von 3 Aminosuren. Die Fluoreszenz entwickelt sich nach spontaner Autooxidation , zu der Sauerstoff, aber kein weiterer Cofaktor notwendig ist, um das fluoreszierende Protein zu erhalten.

Verwendete Gerte:

Fermenter: FE 30, Aernis AG bzw Bioengineering, Bj: 2003, Fll-Max.: 16 l Steuereinheit mit Simatic Touch Panel, Siemens Automation: ISE (Industrie Software Entwicklung GmbH) Pumpen: Peristaltikpumpen Peripex W2 (fr Feedmedium) und Peripex W1 (Lauge, Antischaum), Bioengineering pO2-Sonde: O2 4100e, Mettler Toledo pH-Sonde: pH 2100e, Mettler Toledo Oberschalenwaagen: 30100 DG-FR SCS (d=0,1g; max=30100g), Precisa Analysenwaage: BP 2215, d=0,1mg, max=220g, Sartorius Oberschalenwaage: GP 5202, d=0,01g, max=5200g, Sartorius Lamina: Hera Safe, Heraeus Tischautoklaven: Certoclav-Tisch Autoklav CV-E 12L/18L, Certoclav steriliziser GmbH Schttler: Vortex Genie 2, Scientific Industries Inc. Photometer: Ultrospec 1000E UV/Visible Spectrophotometer , Pharmacia Biotech Zentrifuge Heraeus Labofuge 200 Centrifuge, Thermo Scientific Magnetrhrer: Ikamag RCT HPLC: Fa. Agilent HPLC Autosampler: Beckman Pipetten Kolbenhubpipetten

Verwendete Chemikalien:
Chargennr. Kaliumdihydrogenphosphat Di-Kaliumhydrogenphosphat Hefeextrakt Na-Citrat Mg-Sulphat Ca-Chlorid Ammonsulfat Ammonchlorid Glukose Agar Agar Nutrient Broth No.2
Tabelle 3.1: Verwendete Chemikalien

Lot 730 444 618 735 710 439 449 449 728 618 566223

A863273 A514199 VM642953 A731548 A768486 A546382 A596317 A530445 K37090442 Y781614 CM0067

Nutrient Broth N0.2 wurde von der Firma Oxoid hergestellt, alle anderen verwendeten Chemikalien stammen von der Firma Merck. Medienzusammensetzung von Inokulum, Batch Kultur und Fed-Batch Kultur siehe Anhang

Medien
Menge pro Liter Medium ausgelegt auf Gesamtbedarf BTS 3g/L (1,5 Liter) 3,00 4,50 6,00 0,45 0,75 0,30 0,06 150,00 1,35 1,11 9,99 9,00 0,68 1,13 0,45 0,09 225,00 2,03 1,67 14,99

Reihenfolge Medienzusammensetzung Inokulum 1 Kaliumhydrogenphosphat [g] Di-Kaliumhydrogenphosphat * 3 1 H2O[g] 2 Hefeextrakt [g] 3 Na- Citrat * 2 H2O [g] 4 Mg- Sulfat * 7 H2O [g] 5 Ca- Chlorid * 2 H2O [g] 6 Spurenelementlsung [l] 7 Ammonsulfat [g] 7 Ammonchlorid [g] 8 Glucose- Monohydrat [g]

Reihenfolge Medienzusammensetzung Inokulum 1 Kaliumhydrogenphosphat [g] Di-Kaliumhydrogenphosphat * 3 1 H2O[g] 2 Hefeextrakt [g] 3 Na- Citrat * 2 H2O [g] 4 Mg- Sulfat * 7 H2O [g] 5 Ca- Chlorid * 2 H2O [g] 6 Spurenelementlsung [l] 7 Glucose- Monohydrat [g]

Menge pro Liter Medium ausgelegt auf Gesamtbedarf BTS 3g/L (4 Liter) 3,00 12,00 6,00 0,60 1,00 0,40 0,08 200,00 13,32 24,00 2,40 4,00 1,60 0,32 800,00 53,28

Reihenfolge Medienzusammensetzung Inokulum 1 Kaliumhydrogenphosphat [g] Di-Kaliumhydrogenphosphat * 3 1 H2O[g] 2 Na- Citrat * 2 H2O [g] 3 Mg- Sulfat * 7 H2O [g] 4 Ca- Chlorid * 2 H2O [g] 5 Spurenelementlsung [l] 6 Glucose- Monohydrat [g]

Menge pro Liter Medium ausgelegt auf Gesamtbedarf BTS 3g/L (6 Liter) 3,00 18,00 6,00 10,00 4,00 0,80 2000,00 133,20 36,00 60,00 24,00 4,80 12000,00 799,20

Tabelle 3.2: Zusammensetzung der verwendeten Medien

Salze und Glucose werden getrennt sterilisiert! 10

Inokulums- Medium: Glucose wird mit RO-Wasser auf 175g aufgefllt, die restlichen Zutaten werden auf 1125g aufgefllt Batchmedium: Glucose wird mit RO- Wasser auf 500g aufgefllt, die restlichen Zutaten werden auf 3500g aufgefllt. Fed-Batch-Medium: Glucose wird mit RO-Wasser auf 2000g aufgefllt, die restlichen Zutaten werden auf 4300g aufgefllt. Da der Substratzulauf ber die Waage gesteuert wird, muss auf das Gewicht umgerechnet werden: Dichte () = 1,05 6 L entsprechen 6300g. Medienbereitung Inokulumsmedium: Die Bestandteile mit den Nummern 1, 2, 3, 4, 5, 7 werden zusammengemischt. Nummer 5 (mit Analysenwaage eingewogen) wird langsam hinzugefgt. Nummer 6 wird erst am Schluss hinzugegeben. Nach dem Einwiegen mit RO-Wasser auffllen und mit Hilfe eines Magnetrhrers vermischen.

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Methoden:
Anstechen der Leitungen: Die Septenffnungen werden aufgeschraubt, mit Ethanol versetzt und fr ca. 30 Sekunden mit einem Gasbrenner abgeflammt, bis der Ethanol verdampft ist. Whrenddessen wird die Plastikhlle, die zum Schutz um die sterile Nadel herum befestigt wurde, mit einem erhitzten Stanleymesser am Ansatz aufgeschnitten. Sobald das Ethanol verdampft ist, wird die Hlle abgezogen und die Nadel drei Mal durch die Flamme des Brenners gezogen. Dann sticht man sofort schnell durch die Mitte des Septums des jeweiligen Anschlusses (z.B. Lauge,...) hindurch und befestigt die Mutter wieder. Probenahme: (ab 13:00 stndlich; vor jedem Schritt vortexen!) ~5 ml Vorlauf ziehen (Waste) ~25 ml ziehen in Probenahmecontainer 2 Mal je 10 ml (Vollpipette) in Zentrifugenrhrchen; 1 ml fr OD-Messung Zentrifugenrhrchen in Zentrifuge geben und 10 Minuten bei 5000 rpm abzentrifugieren 2 Mal je 1 ml berstand in Eppendorfhtchen berfhren, werden bei -20C gelagert; Ab Probenahme 7: 1 ml Kulturbrhe und 1 ml berstand in je 1 Eppendorfhtchen (Restsubstratanalyse, Fluoreszenzmessung) Den Rest des berstandes verwerfen Beide Pellets mit je 10 ml RO-Wasser waschen (vortexen); Durch das Waschen werden mglichst alle Mineralsalze entfernt. erneut 10 Minuten bei 5000 rpm abzentrifugieren berstand verwerfen Pellets in tariertes Becherglas mit ~20 ml RO-Wasser berfhren, sodass sich die gesamte Biomasse quantitativ im Becherglas befindet. 24 Stunden bei 105C trocknen (BTS-Bestimmung) Das Probennahmeventil ist ein Drei-Wege-Ventil. Es regelt die zulaufende Dampfleitung, den Ablauf aus dem Fermenter und besitzt ein abschraubbares Ventil zur Probenentnahme. Um ein Tropfen und eventuelle Kontaminationen zu vermeiden, wurde an letzterem mit einer 10 ml Einwegspritze zuerst ein leichter Unterdruck erzeugt, bevor das zweite Ventil zum Bioreaktor geffnet wurde. Die ersten Milliliter wurden verworfen, um einer Verdnnung durch Dampfkondensat vorzubeugen. Im nchsten Schritt wurden ungefhr 25 ml Kultur entnommen. Nach der Probennahme wurde das fermenterseitige Ventil geschlossen und 15 Minuten dampfsterilisiert. Photometrische Bestimmung: Fr die rasche Bestimmung der Biomassekonzentration wird die Absorbanz der Probelsung bei einer Wellenlnge von 600 nm mittels Photometer gemessen. Da ein linearer Zusammenhang zwischen Extinktion und Konzentration, wie er durch das Lambert-Beertsche Gesetz beschrieben wird, nur bei geringen Konzentrationen bzw. im Extinktionsbereich von 0,1 bis 0,6 gegeben ist, muss entsprechend verdnnt werden. Bestimmung der Biomassentrockensubstanz (BTS): Das Pellet wird nach dem erneuten Zentrifugieren in ca. 20ml RO-Wasser resuspendiert und quantitativ in ein tariertes 50 ml Becherglas berfhrt. Nach dem 12

Trocknen bis zur Gewichtskonstanz (Trockenschrank bei 105 C, ~24 h) wird auf der Analysenwaage ausgewogen. Restsubstratanalyse mittels HPLC: Die zuvor eingefrorenen Proben werden fr die HPLC-Analyse aufgetaut und entsprechend verdnnt, um die Konzentration der zu bestimmenden Komponenten im Kalibrationsbereich der HPLC (1 - 1,5 gL-1) zu erhalten. Mittels Einwegspritzen und Sterilfilter (0,2 m Porengre) werden die Verdnnungen in Crimp-Vials abgefllt und diese mit Crimp-Kappen mit Septa verschlossen. Die Analyse an sich wird nicht selbst durchgefhrt. Bestimmung der Plasmidstabilitt: Die Plasmide, die die GFP-Sequenz enthalten, tragen auch ein Gen, das fr eine Laktamase kodiert (Ampr). Um das Verhltnis zwischen plasmidtragenden und plasmidfreien Zellen zu bestimmen, wird das Kochsche Plattenguverfahren angewendet. Je 1 ml der Verdnnungsstufen D7, D8 und D9 werden zu jeweils 3 Parallelen sowohl auf Nhragarplatten als auch auf ampicillinhltige Nhragarplatten (c=0,1gL-1) ausplattiert. Inkubation bei 37C fr 24 h. Fluoreszenzmessung: Fluoreszenzreader ermglichen die schnelle fluoreszenzspektroskopische Analysierung von in Mikrotiterplatten kultivierten Zellen. Die unbehandelten Proben werden in Hinblick auf die Menge bzw. Konzentration des gebildeten GFP ausgewertet. Die spezifische Fluoreszenz ist der Fluoreszenzwert bezogen auf die vorhandene Trockenmasse. Die Messung wird von den TutorInnen durchgefhrt.

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Durchfhrung des Versuchs

Im Rahmen des bungsbeispieles stellte die in der Batch-Kultur gebildete Biomasse das Ausgangsprodukt der fr den Fed-Batch da. Das Inokulum, die Batch-Kultur und die Fed-Batch-Kulur wurden nach der vorgegebenen Rezeptur hergestellt und anschlieend bis auf die Batch-Kultur bei 121C, 1 bar berdruck autoklaviert. Die Batch-Kultur wurde direkt im Fermenter autoklaviert. Die Glucoselsungen wurden jeweils separat von den anderen Bestandteilen autoklaviert. Die Glucose und Nhrmedien wurden dann steril vereinigt.

Herstellung der Schttelkulturen

Zur Herstellung der Schttelkultur wurden ca. 300 mL Nhrlsung mit 25 L des E.coli-Stammes in der Laminar Flow Bank inkubiert. Zustzlich wurde die separat autoklavierte Glucose dem Nhrmedium dort zugegeben. Das Medium wurde ber Nacht auf dem Schttler fr 24 Stunden inkubiert.

Vorbereitung der Becherglser fr die BTS bestimmung

Die mit der Probenummer beschrifteten Becherglser wurden in den Trockenschrank bei 105C gestellt um eine Gewichtskonstanz zu erlangen. Im Exsikkator wurden die Becherglser abgekhlt und dann gewogen.

Sterilisation des Biofermentors

Wurde bei 121C und 1bar berdruck durch ein Sterilisationsprogramm durchgefhrt (ca. 20min.)

Inbetriebnahme des Biofermentors:

Wasserdampf (Kessel) aufllen (ca. 2/3) Wasserzulauf anschlieen Khlrohre anschlieen Stahlschlauch anschlieen Anstechen der O2 Zufuhr (abflammen) Kontrolle ob O2 fliet (Luftblasenkontrolle) Inbetriebnahme der Computersteuerung (BID) Anstechen der Glucose (abflammen) Anstechen des Antischaum (abflammen) Anstechen der Lauge (pH-12 (NH3)ist nicht sterilisiert, da es sich selbst durch pH-12 sterilisiert. Die pH und temp. Regelung Das Kalibrieren der Clark-Elektrode 1. UVM, mit kurzschluss Simulator (1 Volumen Luft/Volumen Kulturbrhe/ Minute) 14

Rhrer Umdrehung 800upm Nullpunkt kalibrierung (BID Code: 1001) 100% Kalibration (BID Code: 1100) BID- enter Sobald es sich bei 100% eingestellt hat, Fehler quittiern und Luft abstellen.

Nullprobe ziehen
(Septum durchstechen) Bereithalten von Spritze ,WASTE Behlter, Probenrhrchen Abschrauben der Fritte Spritze ansetzten und leichten Unterdruck erzeugen Etwas Absaugen (wird in den WASTE-Behlter verworfen) Dann Nullprobe ziehen (ca.5ml) Nullprobe ins Probenrhrchen berfhren Von der Nullprobe wird 1ml in ein Eppendorferhtchen (Nr. 0) eingefllt und eingekhlt 8. Danach wird ausgedampft (Wichtig nicht vergessen den Schalter (Bgeleisensymbol)) 9. Min. 5 Sekunden gut ausdampfen 10. Wieder zuschrauben und 10-15 Minuten durchdampfen lassen 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

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Batch-Phase
Die Glucoselsung wurde in einem Behlter, welcher einen Schlauch enthielt, durch den die Glucose aseptisch in den Fermentor berfhrt werden kann, bei 121 C und 20 Minuten sterilisiert.Es folgt das berfhren der E.Coli Lsung vom Schttelkolben in das berfhrungsgef. Nach einem Anstechen (vorheriges abflammen) in den Stutzen erfolgt das Abpumpen der E.Coli Lsung in den Kessel. Inkobierungszeitpunkt: 10:30VUhr Danach folgen Probenahmen: Nun werden whrend der Batch-Phase in gleichbleibenden Abstnden Proben genommen um in erster Instanz die Biomasse und in zweiter Instanz die OD-Werte zu bestimmen. Zeiten: stndlich ab 13:00 Uhr Dazu folgender Ablauf: Bestimmung eines Probenahmechefs Abnahme der Frite Spritze (20ml) (gleich wie bei der Nullprobeziehung) ansetzten und 5 ml Vorlauf abziehen Den Vorlauf in den WASTE-Behlter Eine Volle Spritze (20ml) aufziehen und in den Probenbehlter berfhren Neuansetzen der Spritze und die noch ausstehenden 5 ml abziehen und in den Probenbehlter berfhren (gesamt 25ml) Danach erfolgt wieder das Nach-oder Durchdampfen des Ventils , ca. 10 bis 15 min.

Aufbereitung der Probe fr die OD-Bestimmung und Biomassenbestimmung (BTS)

Die 25ml Probe vortexen Es werden 2x 10ml (Vollpipette) in Plastikeprovetten berfhrt (Beschriftung nicht vergessen) 10min bei 5000rpm zentrifugieren Durch die zentrifugation entsteht ein Pellet Der berstand des Zentrifugationsrrchens wird 2x je 1ml in Eppendorferhtchen pippetiert und bei -20C gekhlt Der Rest des berstandes wird verworfen Nun wird das Pellet mit je 10ml RO-Wasser gevortext Und erneut bei 5000rpm 10min. zentrifugiert Den berstand verwerfen Das entstandene Pellet wird mit etwas RO-Wasser in ein Becherglas berfhrt. So wenig Wasser wie mglich verwenden

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Die Becherglser werden mit der Tiegelzange in einen Heizraum gestellt und bei 105C fr 24 getrocknet Nach dem Trocknen werden die Becherglser gewogen um die Biomasse zu bestimmen

Zur Messung der optischen Dichte (OD600)

Photometrische Messung der optischen Dichte (Trbung) bei 600 nm, dient zur raschen Bestimmung der Zunahme der Biomasse. Die Extinktion sollte zwischen 0,1 und 0,6 liegen. Bei hherer Biomassenkonzentration und OD600 Werten von mehr als 0,6 muss die Probe in den linearen Bereichen von 0,1 bis 0,6 verdnnt werden.

Plasmidstabilitt
Mit Hilfe des Kochschen Plattengussverfahrens kann das Verhltnis zwischen plasmidtragenden und plasmidfreinen Zellen bestimmen.Die Verwendeten Plasmide sind mit Ampicillin als Resistenzmarker ausgestattet. Deswegen wird 1ml jeder Verdnnungsstufe auf je 3 Platten aufgetragen, wobei pro Verdnnungsstufe 3 Platten ampicillinhltig sind und 3 Platten kein Ampicillin enthalten. Dazu folgende Ergebnisse: Koch1 (10^-8): 250, 218, 183 Koch1 amp (10^-8): 41, 49, 59 Koch2 (10^-9): 33, 42, 46 Koch2 amp (10^-9): 34, 48, 61

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Auswertung
Batch- Phase
Beginn der Batch Phase: 15.6.2010; 10:30 Ende der Batch Phase: 15.6.2010; 17:00
8 7 6 BTS [g/L], OD600 5 4 3 2 1 0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 Laufzeit[h] OD600 BTS [g/L] OD/BTS

Abb. 6.1: OD600, Biomassekonzentration [g/L] und OD/BTS vs. Laufzeit.

In Abb. 6.1 ist sehr gut ersichtlich, dass die OD600 exponentiell ansteigen und die Biomassenkonzentration steigt auch kontinuierlich an. Der OD/BTS Wert sollte etwa bei 2,5 liegen. Allerdings befindet sich dieser Anfangs zwischen 3 und 4 doch pendelt sich dann zwischen 2 und 3 ein. Dieser Fehler knnte wegen Messunsicherheiten zustande kommen.

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14 12 Konzentration [g/L] 10 8 6 4 2 0 0.0 2.0 4.0 Laufzeit[h] 6.0 Glucosekonzentration [g/L] BTS [g/L]

Abb. 6.2: Biomassekonzentration und Glucosekonzentration vs. Laufzeit

In Abb. 6.2 sieht man, dass die Glucosekonzentration whrend der BatchPhase abnimmt und gleichzeitig die Biomassekonzentration stetig zunimmt. Allerdings sind die berechneten Teilungsraten aus BTS und OD sehr unterschiedlich und gleichen sich erst gegen Ende des Batch- Prozesses an wie in Abb. 6.3 ersichtlich ist.
0.8 [h-1] aus BTS, [h-1] aus OD

0.7
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 3.0 4.0 5.0 Laufzeit [h] 6.0 7.0

OD
BTS

Abb. 6.3: aus Biomassekonzentration und aus OD vs. Laufzeit

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Fed- Batch- Phase:

Der Verlauf der Biomassekonzentration wird in Abb.6.4 dargestellt. Im Vergleich wurde auch der theoretische Verlauf im Diagramm aufgetragen. Tatschlich ist der Verlauf anfangs hnlich dem theoretischen. Allerdings verlangsamt sich dieser nach einiger Zeit. Dies kann von einem Plasmidverlust abhngen, oder durch unzureichend genaue Einstellungen des Fermenters und des Substratzulaufs.
800
700 600 BTS gesamt [g] 500 400 300 200 100 0 6.5 11.5 16.5 21.5 26.5 31.5 Laufzeit [h] Abb. 6.4: Verlauf BTS [g] vs. Laufzeit whrend Fed-Batch Phase. tatschlich theoretisch

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In Abb.6.5 ist erkennbar, dass sich OD und BTS am Anfang des Fed-Batch Prozesses stark unterscheiden. OD ist sehr viel hher was mglicherweise auf die Ungenauigkeit der Methode hinweist. Etwa ab Stunde 26 nhern sich die Werte immer nher an. Das ist mglicherweise darauf zurckzufhren, dass bei einer hheren Biomassekonzentration die Auswertung der Methoden genauer wird, da die Messfehler bei hheren Konzentrationen sich nur geringfgig auf das Ergebnis auswirken. Meistens kann man auch behaupten, dass die gravimetrische Messung genauer ist als die OD-Messung.

1.600 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 -0.200 6.0 11.0 16.0 21.0 26.0 31.0 Laufzeit [h] OD BTS

Abb. 6.5: Vergleich OD und BTS vs. Laufzeit

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Plasmidstabilitt
Verd. 10^-8 ohne Amp. Platte 1 Platte 2 Platte 3 250 218 183 217 Verd. 10^-8 mit Amp. 41 49 59 49,66
-8

Mittelwert

Tabelle 6.1: Ergebnis der Auszhlung Koch-Plattengussverfahren der Verdnnungsstufe 10^

Verd. 10^-9 ohne Amp. Platte 1 Platte 2 Platte 3

Verd. 10^-9 mit Amp.

33 42 46 40,33

34 48 61 47,66
-9

Mittelwert

Tabelle 6.2: Ergebnis Auszhlung Koch-Plattengussverfahren der Verdnnungsstufe 10^

In den Tabellen 6.1 und 6.2 ist das Ergebnis des Plattengussverfahrens dargestellt. Bei der Verdnnungsstufe 10^-8 sind die Werte auswertbar. Bei der Verdnnungsstufe 10^-9 hingegen nicht, da es bei dieser Verdnnungsstufe theoretisch keinen Plasmidverlust geben wrde, was allerdings unwahrscheinlich ist.

0,22884793

Allerdings sind die zu wenig Platten ausgezhlt um ein statistisch brauchbares Ergebnis zu bekommen.

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Fluoreszenzanalyse
Gemessene Fluoreszenz in Kulturbrhe in rfu 2458,868 5898,807 27206,975 57185,688 77513,586 82539,929 Gemessene Abgeschtzte Fluoreszenz in spez. Menge GFP in den berstand in Fluoreszenz Zellen in mg GFP/g rfu Differenz in rfu/ g BTS BTS Produktbildungrate 588,31 1870,558 187,06 2,07 639,007 5259,8 329,87 3,64 1,82 676,423 26530,552 1263,96 13,97 4,66 832,793 56352,895 2311,44 25,54 6,39 932,869 76580,717 2940,89 32,50 6,50 947,442 81592,487 3292,01 36,38 6,42 Tabelle 6.3: Ergebnis der Fluoreszenzmessung

Probe 7 8 9 10 11 12

35 30 25 20 15 10 5 0 0 2 3 4 5 5.67 Laufzeit nach Induktion [h]

6 5 4 3 2 1 0

Produktbildungsrate [mg GFP/ g BTS /h]

spez. GFP-Produktion [mg GFP/ g BTS]

40

spez. GFP-Produktion [mg GFP/ g BTS] Produktbildungsrate

Abb. 6.6: Produktionsverlauf GFP und Produktionsbildungsrate vs. Laufzeit

Abb. 6.6 zeigt den Produktionsverlauf von GFP. Die spezifische GFP Produktion ist von Beginn an sehr konstant. Genauso wie Produktbildungsrate anfangs linear ansteigt und noch etwa 4 Stunden nach der Induktion konstant zwischen 6 und 7 mg GFP*g-1 BTS*h-1 bleibt. Bei unserer Gruppe war die spez. GFP-Produktion im Vergleich zu den anderen Gruppen am hchsten.

Restsubstratanalyse
Glucose [g/L] Glucose [g/L] (HPLC) theoretisch Laufzeit [h] 11,5496 12,93325 0,0 10,6178 12,5325 2,5 10,4977 11,31583333 3,5 9,9144 10,29916667 4,5 7,9828 9,0325 5,5 5,3089 5,715833333 6,5 1,7589 0 22,5

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Prozessdaten
pH Wert 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0.0 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 22.5 24.5 26.5 27.5 28.5 29.5 30.2 Laufzeit [h] Abb 6.7: Prozessdaten vs. Laufzeit pO2 Temperatur [C] SIC 1400 1200 Rhrerdrehzahl 1000 800 600

pH, pO2, Temperatur [C]

400
200 0

Startzeitpunkt im Abb.6.7 wurde die Erste Messung (Probe 0) am 15.6.2010 um 10:30 gewhlt. In der Abbildung ist gut zu erkennen, dass die Rhrerdrehzahl ansteigt sobald, der pO2- Wert abfllt, um mehr Sauerstoff einzubringen. Die Temperatur hielt sich konstant bei etwa 37C. Ebenso Konstant verhielt sich der pHWert bei etwa 7.

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Ergebnistabelle
-> Tabelle exel

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Literaturverzeichnis
[1] K.Bayer et. al.: Skriptum 791.105 Angewandte Mikrobiologie bungen 1, Auflage 2007

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