INFORME DE PRÁCTICA # 8

ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS A SER

APLICADOS EN MUESTRAS AMBIENTALES

Yessid RINCON
Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Escuela de Ciencias Agrícolas,
Pecuarias y del Medio Ambiente – ECAPMA. Química Ambiental (Evaluación
y Control de la Contaminación). Grupo #86 CEAD: San José del Guaviare –
San José Colombia. Docente Nira Díaz (niedrdn@gmail.com).
Sesión 1: Mayo 9 de 2016
Entrega informe: Mayo 15 del 2016

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A

PARTE I
Reconocimiento de los parámetros cromatograficos en cromatografía liquida de alta eficiencia
(CLAE)
 Defina y explique cómo se relacionan los siguientes conceptos. Incluya cuando corresponda,
el símbolo y ecuación que representa al concepto.

1. Factor de separación. (α)

Define que tan selectiva es una columna para separar dos picos. La columna puede ser
selectiva a una separación, que se identifica por un valor alto de este factor.

En términos tomados a partir de un cronograma α se puede calcular:

1
 2. Resolución. (Rs)

La resolución de una columna constituye una medida cuantitativa de su capacidad para

separar dos analitos, en este término si se toma en cuenta el ensanchamiento de los picos,
así que la magnitud de este valor si permite asegurar la separación de dos picos.

Donde WA y WB son los anchos de banda de A y B respectivamente

La resolución expresada en términos teóricos es:

3. Eficiencia. (N)

Para realizar una separación cromatografica optima, debe evitarse en lo posible, el ensanchamiento de
las bandas debido a la dispersión; en efecto cuanto más anchas sean las bandas, menor número de
ellas podrán ser resueltas en un espacio de tiempo dado; es decir cuánto más agudos sean los picos
que emergen de una columna mejor estará actuando dicha columna. Las anchuras de las bandas
cromatograficas dependen de las características de la columna (tamaño de las partículas del lecho
estacionario, homogeneidad de este, velocidad de la fase móvil, etc.). Se expresa como el número de
platos teóricos:

El número de platos de una columna depende de su longitud, por lo que se debe tener en cuenta la
altura equivalente de un plato teórico, que relaciona la eficacia de una columna con su longitud y se
define como el cociente entre la longitud de la columna y su número de platos teóricos

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 4. Factor de retención.

Este factor ( ) es adimensional expresa la retención de un compuesto por la fase

estacionaria, independiente del caudal de la fase móvil.

5. Tiempo de retención.

Es el tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra para que el pico del analito alcance

el detector y se le da el símbolo . O en otras palabras es el tiempo que tarda cada sustancia en

abandonar el sistema cromatografico

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 6. Tiempo muerto. Es el tiempo para que la especie no retenida alcance el detector.

7. Ancho de banda (sigma total)

Corresponde al intervalo de longitudes de onda comprendido entre los puntos en donde la

transmitancia (de la radiación emitida por la fuente y que llega a la rendija de salida) alcanza la mitad
de su máximo de transmisión o el intervalo de longitudes de onda que contiene el 75% de la energía
radiante que proviene del monocromador. La anchura de banda se puede expresar en términos de la
apertura o amplitud de las rendijas, S, y la dispersión lineal recíproca del monocromador como:

SBW = S.D-1

8. Cromatografía liquida en fase normal.

La fase estacionaria es polar (gel de sílice, grupos ciano, amino y diol) y la fase móvil es no polar
(hexano o isopropileter). El componente menos polar es el que he luye primero.

4
 9. Cromatografía liquida en fase reversa

La fase móvil es polar (agua, metanol o acetonitrilo). El componente más polar es el primero en he luir y
la fase estacionaria es no polar (cadena hidrocarbonada que puede ser:

Cadena larga: C: 18

Cadena intermedia: C:8

Cadena corta: C:2

10. Gradiente de elución.

Se utilizan dos o más disolventes de distinta polaridad y se varía la composición de forma continua o
mediante etapas escalonadas.

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 11. Elución isocrática.

Es la separación con disolvente de composición constante.

PARTE II

Efecto de la estructura de los compuestos (solutos) y de la composición de la fase

móvil sobre la retención y la resolución.

A. Dibuje estructuras de los siguientes compuestos utilizando las convenciones de

cuña/slash representando los ángulos de enlace.

FORMULA
NOMBRE IMAGEN PROPIEDADES FÍSICAS MOLECULAR

Acetofenona

6
Benzofenona

Butilparabeno
C11H14O3

Propiofenona

Etilparabeno

Propilparabeno

7
Ketoprofeno

C6H5NO3

3-nitrofenol

4-nitrofenol C6H5N

O3

B. ¿Cuáles son los principales usos de cada uno de estos compuestos Acetofenona

 Se usa como precursor en la preparación de fragancias que se asemejan a la almendra, la

cereza, la madreselva, el jazmín y la fresa.

 También se usa para preparar resinas y como aditivo en las gomas de mascar y en cigarrillos.

Benzofenona

La benzofenona es una cetona aromática que ayuda a filtrar las radiaciones. Esta cetona
absorbe la radiación y la disipa en forma de calor. Por esa principal característica es utilizada en
la producción de perfumes, jabones y protectores solares.

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  En el caso de los perfumes y jabones, la benzofenona provoca que ni el olor ni el color, pierdan
sus propiedades debido a la exposición con los rayos UV, mientras que en los protectores
solares tienen como función absorber la radiación y transformarla en energía no nociva para la
salud de la piel.
 Fabricación de productos farmacéuticos (antihistamínicos, hipnóticos, pantallas solares),
cosméticos e insecticidas, en análisis, química fina, etc.

Butilparabeno

 Es utilizada en diversos productos del cuidado de la piel e incluso en medicinas tan comunes
como el ibuprofeno.

 Es el anti fúngico más potente de entre los parabenos. De hecho, su potencial microbiano es
mayor que el del metilparabeno, el propilparabeno o el etilparabeno. Es particularmente eficaz
contra mohos y levaduras, y menos contra bacterias. En cuanto a cómo funciona, parece que
inhibe la capacidad de síntesis del ADN y el ARN y con ello la capacidad de transporte de
sustancias entre membranas, lo cual retarda el crecimiento microbiano porque les impide
desarrollarse al ritmo habitual. Aun así, es frecuente encontrárselo combinado con otras
sustancias biocidas como liberadores de formaldehido, isotiazolinonas y fenoxietanol para
aumentar sus capacidades conservadoras, así como con otros tipos de parabenos.

Propiofenona

 Utilizado en la síntesis de efedrina y derivados de propiofenona tales como metcarinona y

catinona.
 Intermediario útil para la preparación de medicamentos que actúan sobre el sistema nervioso
central tales como los hipnóticos, ansiolíticos
 utilizado en la síntesis de alquenos arilo tales como fenilpropanoides

Etilparabeno

Son utilizados como conservadores protegiendo a los productos de las levaduras y los hongos.
No obstante, no son muy efectivos contra las bacterias. Su actividad es independiente de la
acidez, y adicionalmente, son poco solubles, lo que limita sus aplicaciones (antimicrobianos y
ciertas propiedades antioxidantes) en formas farmacéuticas liquidas como jarabes, soluciones,
suspensiones e inyectables.

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  son usados en una gran variedad de alimentos y cosméticos.

Propilparabeno

 se usa con frecuencia en cosméticos, productos de cuidado para la piel y comida. Tiene una
toxicidad generalmente baja por ingestión
 Es muy poco soluble en agua fría, por lo que se trabaja en procesos con calor. Es anti
fermentativo, tiene amplio espectro antimicrobiano es bacteriostático y antioxidante, combate
mohos y levaduras. Es muy utilizado en cosméticos (es el segundo producto de este tipo más
utilizado), pero también es empleado en la industria alimenticia, se recomienda utilizarlo del 0,05

al 0,1%; en la preservación de grasas en una proporción del 0.1%. Ketoprofeno

 El ketoprofeno de prescripción se usa para aliviar el dolor, sensibilidad, inflamación (hinchazón)
y la rigidez causada por la osteoartritis (artritis causada por un deterioro del recubrimiento de las
articulaciones) y la artritis reumatoide (artritis causada por la hinchazón del recubrimiento de las
articulaciones). También se usa para aliviar el dolor, incluyendo el dolor menstrual (dolor que se
presenta antes o durante el período menstrual). El ketoprofeno sin prescripción o de venta libre
se usa para aliviar dolores leves causados por cefaleas (dolor de cabeza), períodos
menstruales, dolor de muelas, resfrío común, dolores musculares, dolor de espaldas y para
reducir la fiebre. Pertenece a una clase de medicamentos llamados antiinflamatorios sin
esteroides. Funciona al detener la producción de una sustancia que causa dolor, fiebre e
inflamación.
El ketoprofeno por vía oral es efectivo y bien tolerado como tratamiento agudo en los ataques
de migraña.

3-nitrofenol

Se utiliza en peletería como fungicida,

4-nitrofenol

Es usado principalmente en la manufactura de medicamentos, fungicidas, tinturas y para oscurecer

el cuero.

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C. Abra el HPLC simulador (http://www.hplcsimulator.org/)

D. configure el simulador así:

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E. posteriormente, registre para cada compuesto:

Tiempo de retención ( )

Factor de retención (K’)

Ancho de banda (sigma total – )

Adjunte imagen del cromatograma obtenido.

F. cambie la composición de la fase móvil de metanol a acetonitrilo como se muestra

en la tabla 15.

G. posteriormente, registre para cada compuesto:

Tiempo de retención ( )

Factor de retención (K’)

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 Ancho de banda (sigma total – )

Adjunte imagen del cormatograma obtenido

H. explique por qué se da el cambio en los tiempos de retención y en la separación de los

compuestos cuando el metanol es sustituido por el acetonitrilo.

Los solventes polares arrastran más eficazmente los compuestos más retenidos en la fase
estacionaria
Los solventes menos polares, arrastran muy lentamente a los compuestos los compuestos
más polares estarán menos retenidos que los menos polares. Los tiempos de retención
disminuyen cuando menor sea la proporción de agua, cuando menos polar sea el
disolvente empleado.

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 El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y
disminuye con la introducción de disolventes más hidrológicos.

 En qué caso se obtiene una mejor separación

En el primer caso, cuando utilizamos metanol, ya que se observan 8 de las 9 muestras y con
picos bien definidos y separados, solo encontramos un compuesto que sale al mismo tiempo con
otro. Mientras que en el segundo caso, utilizando acetonitrilo, vemos 7 de 9 compuestos y en
algún caso están integrados varios picos en 1

I. ¿Cuál es la importancia del agua en la composición de la fase móvil?

El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido trifluoroacético, que
ayudan a la separación de los compuestos

La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que

resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar (el agua es
altamente polar), un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar.

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PARTE III

Efecto por porcentaje del modificador en la composición de la fase móvil sobre la retención y la
resolución.

1. En el listado de compuestos, elimine 7 solutos dejando solo a Acetophenone

(acetofenona) y Ethylparaben (etilparabeno).

2. Fije las condiciones del simulador de acuerdo con las indicaciones de la guía:
A. Registre el tiempo de retención, el factor de retención y la sigma total para
los dos compuestos. Adjunte una imagen del cromatograma obtenido.

Compuesto 95% Tiempo de factor de sigma total

retención retención K’
(Tr)
Acetofenona 1,1185 0,0516 0,5485

Etilparabeno 1,1196 0,0526 0,5490

B. Calcule el tiempo muerto.

El tiempo muerto es de 65 seg.

C. Calcule la resolución, α, para los dos compuestos.

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 3. Cambie gradualmente el porcentaje de metanol en intervalos de 10% iniciando en
95% y terminando en 5% (95%, 85%, 75%, 5%).

A. Registre el tiempo de retención, el factor de retención y la sigma total para los dos
compuestos. Adjunte una imagen del cromatograma obtenido.
% Compuesto Tiempo factor de sigma Imagen
de retención total
retención K’
(tR)
95 Acetofenona 1,1185 0.0516 0.5485

Etilparabeno 1,1196 0.0526 0.5490

85 Acetofenona 1.1802 0.1096 0.5654

Etilparabeno 1.1987 0.1270 0.5739

75 Acetofenona 1.3109 0.2325 0.6243

Etilparabeno 1.3897 0.3066 0.6601

65 Acetofenona 1,5885 0,4935 0.7571

Etilparabeno 1,8506 0,7399 0.8785

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55 Acetofenona 2,1774 1,0472 1,0401

Etilparabeno 2,9628 1,7856 1,4101

45 Acetofenona 3,4272 2,2222 1,6380

Etilparabeno 5,6471 4,3094 2,6934

35 Acetofenona 6,0793 4,7157 2,8960

Etilparabeno 12,1254 10,4002 5,7717

25 Acetofenona 11,7073 10,0070 5,5334

Etilparabeno 27,7601 25,0997 13,1177

15 Acetofenona 23,6504 21,2358 11,0663

Etilparabeno 65,4928 60,5755 30,6429

5 Acetofenona 48,9946 45,0642 22,7749

Etilparabeno 156,5566 146,1926 72,7735

B. Calcule el tiempo muerto.

Podemos darnos cuenta que el tiempo muerto va disminuyendo, con el cambio del porcentaje del
metanol, en el 95% el tiempo muerto es de 65 seg, y baja gradualmente con el cambio de
porcentaje, para el 5% el tiempo muerto es de o,8 milicimas de segundo.

C. Calcule la resolución, α, para los dos compuestos.

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WA y WB son los anchos de banda de A y B respectivamente.

Resolución Acetofenona

Resolución Etilparabeno

D. Repita el mismo proceso cambiando el metanol por ACETONITRILO.

Tiempo de retención ( )

Factor de retención (K’)

Ancho de banda (sigma total – )

Adjunte imagen del cromatograma obtenido

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20
21
4. Repita el mismo proceso cambiando el metanol por acetonitrilo

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23
24
25
E. Con los hallazgos realizados en esta sección, elabore una conclusión sobre el efecto del
porcentaje del modificador en la composición de la fase móvil sobre la retención y la
resolución.

A mayor cantidad de solvente menos polar los tiempos de retención son menores, es decir a
menor cantidad de agua como solvente menor tiempo de retención.

 Si fuera contratado en un laboratorio para separar, por medio de cromatografía

liquida, de una mezcla los compuestos acetofenona y etilparabeno. Cuál sería la
mejor composición de fase móvil a emplear? Justifique?

De acuerdo a la información recolectada que la composición de fase móvil es la mezcla de agua:

metanol en las condiciones 5 ( 45:55 ) y la 6 (55:45) porque los compuestos salen con diferencia de
tiempo prudencial, los picos están bien definidos, y gastaríamos menos solventes que en otras
condiciones. Los dos reactivos tienen el mismo riesgo de inflamabilidad (3), igual riesgo de
reactividad (0) pero tiene menor riesgo de salud el metanol (2) y el acetonitrilo (3)

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 BIBLIOGRAFIA

 http://www3.uah.es/mol_play/1.htm
http://www.quiminet.com/productos/butilparabeno-6373322859.htm
http://www.madrimasd.org/blogs/remtavares/2009/02/20/113222
http://www.hplcsimulator.org/http://www.youtube.com/watch?v=wYEDJu0pJy4
http://www.hplcsimulator.org/index.php
 http://www.ulpgc.es/hege/almacen/download/39/39360/separaciones_po r
cromatografia_1.pdf
 http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatogr
afia/principios_de_cromatografia.pdffile:///D:/DATOS/Downloads/file.pdfhttp://o cw.uv.es/ocw-
formacio-permanent/2011-1-35_Manual.pdf

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