Manfred R.

Hofmann Serologische Reagenzien GmbH

Leopoldsweg 30 D-61348 Bad Homburg Tel. +496172/96550 Fax +496172/965515

Arbeitsanleitung

genRESLS500ROX Lngenstandard
zur Grenbestimmung von DNA-Fragmenten

Kat.-Nr.: Anwendungen: Kat.-Nr.: Anwendungen: Kat.-Nr.: Anwendungen:

LS01 ca. 700 (ABI 377, mit Probenauftragspuffer) LS02 ca. 840 (ABI PRISM 310, 3100 [-Avant] Genetic Analyzer) LS03 ca. 1200 (ABI PRISM 310, 3100 [-Avant] Genetic Analyzer)

LS500ROX/dt/1201/4

1. Einleitung
genRES LS500ROX ist ein Interner Lngenstandard fr Lngenbestimmungen von DNA-Fragmenten. genRES LS500ROX ist fr die Anwendung auf (DNA-) Elektrophorese-Systemen geeignet, die NHS-Esterfluoreszenzfarbstoffe wie "ROX detektieren knnen (z.B.: ABI PRISM 310/3100/3100-Avant Genetic Analyzer oder ABI PRISM 377 DNA Sequencer, Fa. AB Applied Biosystems). Mit genRESLS500ROX knnen DNA-Fragmentlngen zwischen 90 und 500 Basenpaare (bp) bestimmt werden. genRES LS500ROX besteht aus 18 DNA-Fragmenten (s. Abb. Seite 5), die mit dem NHS-Esterfluoreszenzfarbstoff ROX markiert sind. Die Empfindlichkeit des Fluoreszenz-Farbstoffes ROX ist verglichen mit dem Fluoreszenz-Farbstoff FAM nur ca. 12%. Auf Grund dieser niedrigen Empfindlichkeit wird ROX blicherweise nicht fr die Markierung von DNA-Fragmenten z.B. in der genetischen Analyse verwendet. genRES LS500ROX kann deshalb zusammen mit anders markierten Proben in der gleichen Gelspur aufgetragen bzw. zusammen injiziert werden. genRES LS500ROX ist auch Bestandteil der genRES MPX und DYSplex Kits (serac).

2. Lagerung und Stabilitt der Kitreagenzien

Die Reagenzien knnen bei Verbrauch innerhalb 1 - 2 Wochen bei +2 - +8C im Dunkeln (!) gelagert werden.

Anmerkung:

Achtung! Die Fluoreszenzmarkierung der Standardfragmente ist lichtempfindlich. genRES LS500ROX sollte deshalb nur wenn unbedingt ntig dem Licht exponiert werden.

Wird genRES LS500ROX ber einen lngeren Zeitraum verwendet, sollte der Standard bei -15 bis -25C eingefroren werden. Um mehrmaliges Auftauen und Einfrieren zu vermeiden, sollte genRES LS500ROX vor dem Einfrieren aliquotiert werden. Die Haltbarkeit der Reagenzien betrgt ungeffnet 1 Jahr nach Herstellung.

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3. Inhalt genRES LS500ROX Lngenstandard Kit

Der Testkit enthlt den [ROX]-markierten Lngenstandard sowie einen ProbenAuftragspuffer (nur Kat.-Nr. LS01) fr auf Gelen basierende Elektrophoresesysteme (z.B. ABI 373 DNA Sequencer oder ABI PRISM 377 DNA Sequencer). Kat.-Nr.: LS01 violett* genRES LS500ROX Interner Lngenstandard schwarz* 10x Probenauftragspuffer (Blue Dextran/EDTA)

5 x 70 L 500 L

Kat.-Nr.: LS02 violett* genRES LS500ROX Interner Lngenstandard

6 x 70 L

Kat.-Nr.: LS03 violett* genRES LS500ROX Interner Lngenstandard * Farbe des Gefdeckels

5 x 100 L

4. Anwendung von genRESLS500ROX

Anmerkung: Verwenden sie niemals parallel (in einem Probenset bzw. in einem Gellauf) unterschiedliche Lngenstandards fr die Analyse der Proben (z.B. PCR-Amplifikate oder Allel-Leitern), die zueinander abgeglichen werden (mssen). Die ber eine Kalibrierungskurve durch die Software errechneten Fragmentgren unterscheiden sich z.T. erheblich bei Verwendung unterschiedlicher Lngenstandards. Dies gilt auch fr einen Grenabgleich von Proben aus verschiedenen Projekten, die mit unterschiedlichen Lngenstandards gefahren worden sind! Definieren Sie vor der Analyse der Proben den Lngenstandard. Fr die Definition von genRES LS500ROX lesen Sie bitte die Gebrauchsanleitung zu der von ihnen verwendeten Analysesoftware unter Punkt New Size Standard Definition (z.B. GeneScan Reference Guide , AB Applied Biosystems). Es sollten, unabhngig vom Elektrophorese System, 0.5L genRES LS500ROX je Gellane (z.B. ABI 373 DNA Sequencer und ABI PRISM 377 DNA Sequencer) bzw. je Injektionsprobe (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer) aufgetragen / verwendet werden.

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Anwendungsbeispiele von genRES LS500ROX auf verschiedenen Elektrophoresegerten: ABI PRISM 310 Genetic Analyzer

ABI 373 DNA Sequencer/ ABI PRISM 377 DNA Sequencer 2.1 L deionisiertes Formamid 0.4 L Probenauftragspuffer 0.5 L genRES LS500ROX max. mgliches Volumen in die Geltasche einbringen (je nach Kammgre unterschiedlich !)

12 L deionisiertes Formamid 0.5 L genRES LS500ROX 1.0 L Probe/Amplifikat

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genRESLS500ROX Lngenstandard (Fragmente und Fragmentlngen [bp])

Elektropherogramm des genRESLS500ROX Lngenstandards nach Auftrennung mit ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Laufbedingungen: Polymer POP4, Genetic Analyzer Capillary [grn markiert], Standard Modul GS STR POP4 (1mL) A Laufzeit abgendert auf 28 min.

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