Protokoll zu

Versuch 4: PCR (Polymerasekettenreaktion)

von Alicia Golobow

Gruppennummer: 21
Email-Adresse: aliciagolobow_p@outlook.de
Datum: Freitag, der 28.09.2018
Betreuer: Maria und Aru
2. Abgabe
Einleitung:
In diesem Versuch wurde eine Polymerasekettenreaktion durchgeführt, mit deren Hilfe
schon geringe Mengen DNA amplifiziert werden können. Dabei wird die DNA zunächst
denaturiert und dann mithilfe von Primern und Polymerasen verdoppelt. Durch diese
Amplifizierung können die DNA Fragmente später im Elektrophoresegel sichtbar gemacht
werden, da sie dadurch in größerer Menge vorliegen und da das Gel eine Nachweisgrenze
besitzt, die für einen Nachweis überschritten werden muss.1

Das in unserem Versuch untersuchte DNA Fragment stammte aus genomischer Aktin-DNA. 2

Das Fragment beträgt im unverdauten Zustand 417 Basenpaare, verdaut wird es in zwei Teile
geschnitten mit je 73 und 344 Basenpaaren. Der Verdau wurde mit dem Enzym Sma-I
(Serratia marcescens I) durchgeführt.3

Material und Methoden:

Der Versuch wurde weitgehend nach der Anleitung im Skript durchgeführt. 4

Bei der Zugabe des Gel Red zum Agarosegel wurden jedoch 4μL anstatt 3μL verwendet.
Außerdem wurde die Elektrophorese bei 140V anstatt 120V durchgeführt und dafür etwas
kürzer als eine Stunde.

1
http://www.chemgapedia.de/vsengine/glossary/de/nachweisgrenze.glos.html ; aufgerufen am 28.09.2018
2
Biochemie Praktikumsskript 2018, Seite 4-4 (Abb. 4-2, Unterschrift)
3
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/r4503?lang=de&region=DE ; aufgerufen am
28.09.2018
4
Biochemie Praktikumsskript 2018, Seite V 4-4 bis 4-7
1
Ergebnisse:

Abbildung 1 – Fertiges Gel mit Markerproteinen und 4 Testansätzen: Ansatz 1 = nur DNA ; Ansatz 2A = DNA und
Taq-Polymerase ; Ansatz 2B = DNA, Taq-Polymerase und Sma-I ; Ansatz 3 = nur Taq-Polymerase

Tabelle 1 – Zuordnung der Marker zu ihrer jeweiligen Laufweite

Marker 50 100 150 200 250 300 400 500

Laufweite 6,5cm 6cm 5,5cm 5,1cm 4,8cm 4,6cm 4,1cm 3,8cm

Bei Ansatz 1 handelt es sich um einen Kontrollansatz, der zwar DNA aber keine Taq-
Polymerase enthielt. Man erkennt keine Banden, sondern nur unter 1.1, unterhalb des 50er
Markers eine geringfügige Verfärbung.

2
Bei Ansatz 2A wurde sowohl DNA als auch Taq-Polymerase hinzugegeben, damit eine
Amplifikation der DNA stattfinden kann. Man erkennt 3 Banden. 2A.1 liegt etwas höher als
der 400er Marker, 2A.2 zwischen 200 und 250 und die dritte Bande 2A.3 knapp unter 150.

Ansatz 2B enthielt neben der DNA und der Polymerase auch noch Sma-I, welches als
Verdauungsenzym dazu gedacht war, die DNA an der im Skript beschriebenen Stelle 5 zu
spalten. Man erkennt auch hier 3 Banden. Die erste Bande 2B.1 liegt zwischen 300 und 400,
2B.2 liegt bei ca. 200 und 2B.3 genau wie 2A.3 knapp unter 150.

Bei Ansatz 3 wurde nur Taq-Polymerase verwendet, aber keine DNA. Auch hier ist keine
Bande sichtbar, sondern nur eine undeutliche Verfärbung unterhalb von 50.

Zu 1.

Korrelation von Laufstrecke und Fragmentlänge

2.9

2.7
f(x) = − 0.0513038579907675 x² + 0.173624886014837 x + 2.76366407859276
R² = 0.995592208517735
Logarithmus der Fragmentlänge

2.5

2.3

2.1

1.9

1.7

1.5
3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7

Laufweite in cm

Marker Polynomial (Marker)

Abbildung 2 – Korrelation von Laufstrecke und Fragmentlänge der Markerproteine

Anhand der Marker in dem DNA Standard konnte eine Kalibrierungskurve aufgestellt
werden, mit deren Hilfe auch unbekannte Proben relativ genau auf ihre Fragmentlänge und

5
Biochemie Skript 2018, Seite V4-4
3
Laufweite untersucht werden können. Das Bestimmtheitsmaß der Trendlinie zeigt einen
Wert von 0,9956, was mit großer Genauigkeit die vorliegenden Werte beschreibt.

Zu 2.

Um die Fragmentlänge des PCR-Produkts zu ermitteln verwendet man die von Excel
ausgegebene Formel der Trendlinie. In diese wird die Laufweite als x Wert eingesetzt. Nach
Auflösen der Formel ergibt sich dann der Logarithmus der Fragmentlänge, der wiederum
zurück gerechnet werden muss.

Die Laufweite des Fragments 2A.1, welches im erwarteten Bereich liegt, beträgt genau 4cm.

Damit ergibt sich eine Fragmentlänge von 433.

Es gibt im Ansatz 2A noch zwei weitere Banden(2A.2 und 2A.3), die im weiteren Verlauf
diskutiert werden.

Zu 3.

Um die optimale Temperatur (Annealing-Temperatur) zu ermitteln, verwendet man die

Formel:

[(Summe der G- und C-Basenpaare)*4+(Summe der A- und T-Basenpaare)*2] -5

Damit ergibt sich für den ersten Primer:

[(12*4)+(8*2)]-5 = 59°C

Für den zweiten Primer ergibt sich nach der gleichen Formel ein Wert von 51°C.

Diese Ergebnisse werden im Diskussionsteil weiter behandelt.

Diskussion:

Zu 2.

Anhand der im Skript gegebenen Abfolge der Basenpaare wäre ein Wert von 417 zu
erwarten gewesen. Aufgrund von geringfügigen Messfehlern und Ungenauigkeiten in der
Formel der Trendlinie, kann es zu Abweichungen gekommen sein. Da die Werte aber nah

4
beieinanderliegen, kann man sagen, dass die PCR erfolgreich war. Allerdings sind neben
dieser Bande auch weitere unspezifische Produkte entstanden (2A.2 und 2A.3). Eine
mögliche Erklärung dafür liegt in einer falsch gewählten Annealing Temperatur, oder einer zu
großen Menge Magnesium-Ionen. Dies wird unter 3. weiter erläutert.

Zu 3.

Der einfache Weg um die ideale Annealing Temperatur zu bestimmen wäre, einen
Mittelwert aus den beiden ermittelten Temperaturen zu bilden und diesen als optimale
Temperatur anzugeben. Tatsächlich sollte man allerdings beachten, dass zu hohe
Temperaturen sich schädigend auf die PCR auswirken 6, da sich die Primer bei zu hohen
Temperaturen nicht mehr anlagern können. Deshalb sollte man nur geringfügig von der
niedrigeren Temperatur nach oben abweichen. Ein Wert von ca. 53°C erscheint daher
zunächst optimal.

Da man allerdings anhand der Bande 2A.2 und 2A.3 erkennen kann, dass die DNA nicht
vollständig amplifiziert wurde, sondern auch Bruchstücke entstanden sind, ist dieses
Ergebnis in Frage zu stellen. Bei solchen unspezifischen Produkten könnte eine zu niedrige
Annealing Temperatur der Grund sein oder auch zu viele Durchläufe im Thermocycler. Ein
weiterer Grund für die unspezifischen Banden 2A.2, 2A.3 sowie 2B.2 und 2B.3 könnte aber
auch eine zu hohe Konzentration an Magnesium-Ionen sein, da diese sich an die negativ
geladene DNA anlagern und so bei einem Überschuss die spezifische Bindung des Primers
erschweren (siehe Fußnote 6).

Um eine bessere Anlagerung zu erreichen wäre ein mögliches Vorgehen für eine
Wiederholung des Versuchs eine etwas höhere Annealing Temperatur zu wählen (54-55°C)
und weniger MgCl2 hinzuzufügen.

Zu 4.

Da bei 417 keine Bande zu sehen ist, kann man davon ausgehen, dass der Verdau vollständig
abgelaufen ist.

6
http://cdn2.hubspot.net/hubfs/547446/LabManager/Downloads/Infographics/PCR-Eppendorf/
TroubleshootingPCR-WEB.pdf?t=1479934203330 ; aufgerufen am 28.09.2018
5
Für gewöhnlich würde man bei einem erfolgreichen Verdau aber nicht nur das größere
Fragment mit 344 Basenpaaren, sondern auch das zweite DNA Fragment mit 73
Basenpaaren erwarten. Dieses ist in unserem Gel nicht erkennbar. Ein sehr wahrscheinlicher
Grund dafür ist, dass es eine Nachweisgrenze gibt, ab welcher Moleküle sichtbar werden. Da
die Fragmente wesentlich kleiner sind, haben sie diese Grenze vermutlich nicht
überschritten.

Wie in der normalen PCR (2A), treten auch im Verdau unspezifische Banden auf (2B.2 und
2B.3). Mögliche Gründe dafür sind wie bei 3. bereits erwähnt die Annealing Temperatur oder
die Magnesiumionenkonzentration.

Da in den Ansätzen 1 und 3 keine Banden zu sehen sind, ist eine Kontamination mit Fremd-
DNA unwahrscheinlich.

Zu den anderen Ansätzen:

Eine geringfügige Verfärbung (1.1 und 3.1) im Bereich unter 50 bei Ansatz 1 und 3 lässt auf
eine Primerwolke schließen, da dieser im Überschuss hinzugegeben wird.

Ansonsten treten bei Ansatz 1 und 3 keine Banden auf, wodurch ersichtlich wird, dass weder
die DNA Probe noch die Polymerase verunreinigt waren und die Messungen ohne Störungen
verlaufen konnten.

Quellen:

Praktikumsskript Biochemie, Prof. R. Dringen

http://www.chemgapedia.de/vsengine/glossary/de/nachweisgrenze.glos.html ; aufgerufen
am 28.09.2018

https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/r4503?lang=de&region=DE ;
aufgerufen am 28.09.2018

6
http://cdn2.hubspot.net/hubfs/547446/LabManager/Downloads/Infographics/PCR-
Eppendorf/TroubleshootingPCR-WEB.pdf?t=1479934203330 ; aufgerufen am 28.09.2018