Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Vely Patel J1 - Biologie GFS - Frau

Zöllner
Gliederung:
1.Einführung:
-Gliederung…………………………………………………………………………….........................…2
-Leitfrage………………………………………………………………………………............................3
-Definition und Grundprinzip der PCR…..........................................................................4
-Historischer Hintergrund und Entwicklung der PCR-Technologie....................................5
2.Hauptteil:
-Materialien und Reagenzien...….............................................................…...................6
-Die drei Hauptphasen der PCR........……………………………….…………………...................7
-Verschiedene Varianten der PCR: Konventionelle PCR, qPCR, RT-PCR usw..…..............10
-Einsatz der PCR zur Diagnose von COVID-19...............................................................11
3.Fazit:
-Schlussfolgerung und Beantwortung der Leitfrage......................................................12
-Quiz..........................................................................................................................13
-Quellen.....................................................................................................................14
 Leitfrage:

Wie spielt die PCR eine Rolle bei der Erkennung

und Bekämpfung von Infektionskrankheiten
wie COVID-19?
 Definition und Grundprinzip

 („Polymerase Chain Reaction“ – PCR)

 die wichtigste Labormethode = „molekulare Diagnostik“
 vervielfältigt ein DNA-Stück in vitro = DNA Amplifikation
 beruht auf den Mechanismus der DNA-Replikation
 drei Hauptphasen
 Humanmedizin: abklärung von Erbkrankheiten und genetischen Fragestellungen,
Erkrankungsrisiko, Vaterschaftstest
 zuverlässigste Verfahren
Historischer Hintergrund und Entwicklung der PCR Technologie

 1983 vom US-amerikanischen Biochemiker Kary B. Mullis

 Ziel: die effiziente Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen
 Idee: die enzymatische Synthese von DNA durch DNA-Polymerasen für
effiziente Vervielfältigung
 erste PCR-Technologie: zeitaufwändig und ineffizient
 Verschiedene Modifikationen und Verbesserungen, um Anwendbarkeit und
Vielseitigkeit zu erweitern
 1993: Wissenschaftliche Anerkennung und Nobelpreis zusammen mit
Michael Smith
 Materialien und Reagenzien

 die zu untersuchende DNA-Ausgangssequenz (DNA-

Matrize)
 zwei Primer (zwei 20 bis 30 Nukelotide lange DNA-
Einzelstränge)
 eine hitzestabile DNA Polymerase (taq-Polymerase aus
Thermus aquaticus)
 die vier Nukleosid-Triphosphate (dATP, dTTP, dGTP,
dCTP)
Abbildung 1

 Pufferlösung, Salze
 ein geeignetes Gerät, das die für die einzelnen Schritte
erforderlichen Temperaturen erzeugt (Thermocycler).
 Die drei Hauptphasen der PCR (ein Zyklus)
1. Denaturierung

-Reaktionsgemisch auf ca. 90-

95°C erhitzt

-die beiden Stränge werden

getrennt
(-->Einzelstränge)

-Wasserstoffbrückenbindungen
lösen sich

Abbildung 2
Die drei Hauptphasen der PCR (ein Zyklus)

2. Primer-Hybridisierung

-Temperatur wird auf etwa 50°C bis

60°C gesenkt

-DNA-Primer binden an die

Einzelstränge durch komplementäre
Basenpaarung

-DNA- anstatt RNA-Primer

Die drei Hauptphasen der PCR (ein Zyklus)

3. Polymerisieren

-Temperatur wird auf etwa 70°C bis

75°C erhöht

-die DNA-Polymerase setzt sich an

die Primer und fügt Nukleotide
hinzu, um neue Doppelstränge zu
bilden

---> aus der Matrizen-DNA sind zwei

doppelsträngige Kopien der DNA-Sequenz
entstanden
---> die Anzahl der Kopien nimmt mit der
Wiederholung des Zyklus exponentiell zu
 Verschiedene Varianten der PCR
Konventionelle Polymerase- Quantitative Polymerase- Reverse-Transkription
Kettenreaktion Kettenreaktion Polymerase-
(PCR) (QT-PCR) Kettenreaktion
(RT-PCR)

Definition Klassische PCR mit Quantifizierung der DNA Umwandlung von RNA in
Endpunktanalyse (Ergebnisse während der PCR (mithilfe DNA zur Amplifikation
durch Gel-Elektrophorese) Fluoreszenzfarbstoff)

Anwendung Klonierung, Genotypisierung und -quantitative Daten : wie viel -nachweis von RNA-Viren
Mutationsanalyse DNA-Sequenz ist vorhanden
-Genexpressionsanalyse

Vorteile -kostengünstig und weit -präzise Informationen -ermöglicht die Analyse

verbreitet -die Echtzeitüberwachung von RNA
-qualitative Ergebnisse: Ob DNA
vorhanden ist

Nachteile -keine Echtzeitdaten oder - teurer und komplexer -zusätzlicher Schritt

quantitative Informationen
Einsatz der PCR-Test zur Diagnose von COVID-19
 Prozess der Diagnose

-Probenentnahme
-RNA-Extraktion aus der Probe
-Reverse-Transkription von RNA in komplementäre DNA (cDNA)
-Verwendung spezifischer Primer für SARS-CoV-2
-Echtzeit-Überwachung mit Fluoreszenzfarbstoff
 Vorteile der PCR-Tests

-Hohe Empfindlichkeit
-Hohe Spezifität
-Rasche Diagnose
 Herausforderungen

-Empfindlichkeit gegenüber Kontaminationen

-Sicherer Transport und Lagerung der Proben
 Leitfrage:
Wie spielt die PCR eine Rolle bei der Erkennung und Bekämpfung von
Infektionskrankheiten wie COVID-19?

 Standardtest für COVID-19

 ermöglicht die direkte Detektion des Eregers SARS-CoV-2
 schnelle und präzise Diagnose
 Kontrolle und Prävention
-der Ausbreitung
 Zukunftsperspektiven
 Quiz
1. Was ist der Hauptzweck der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)?
--->Vervielfältigung von DNA in vitro
2. Wie viele Hauptphasen gibt es in einem PCR-Zyklus und wie heißen sie?
--->Drei: Denaturierung, Primer-Hybridisierung, Polymerisieren
3. Warum wird die Reverse-Transkription PCR (RT-PCR) bei COVID-19 verwendet?
--->Weil sie RNA in DNA umwandelt, was für die Amplifikation erforderlich ist
4. Was ist der Zweck der Denaturierungsphase in der PCR?
--->Trennung der DNA-Doppelstränge durch Hitze
5. Welches Enzym ist in der PCR für die Synthese neuer DNA-Stränge verantwortlich?
-->DNA-Polymerase (Taq-Polymerase)
6. Welches Gerät wird in der PCR verwendet, um die erforderlichen Temperaturen zu erzeugen?
-->Thermocycler
Quellen:
 Genetik: Vergleich von PCR und DNA-Replikation - https://abitur-wissen.org/index.php/biologie/genetik/472-genetik-vergleich-von-pcr-und-dna-replikation-noch-frei
(03.05.2024)

 How is the COVID-19 virus detected using real time RT–PCR? -

https://www.iaea.org/bulletin/how-is-the-covid-19-virus-detected-using-real-time-rt-pcr#:~:text=As%20new%20copies%20of%20the,the%20sample%20after%20each
%20cycle.
(28.04.2024)

 Kary Mullis, Erfinder der PCR-Technologie

- https://www.roche.de/unternehmen/stories/brillant-unkonventionell-und-umstritten-kary-mullis-erfinder-der-pcr-technologie (03.05.2024)

 Laborbefund: Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) - https://www.gesundheit.gv.at/labor/laborbefund/polymerase-ketten-reaktion.html (28.04.2024)

 PCR-Test: Goldstandard unter den Corona-Tests - https://www.infektionsschutz.de/coronavirus/tests-auf-sars-cov-2/pcr-test/#tab-16091-c5310 (04.05.2024)

 PCR vs. COVID-19-Schnelltest: Was ist der Unterschied? -

https://www.osfhealthcare.org/blog/pcr-vs-rapid-covid-19-test-whats-the-difference/#:~:text=The%20PCR%20test%20takes%20a,PCR%20test%20will%20detect%20it.
(30.04.2024)

 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) -
https://www.pflanzenforschung.de/de/pflanzenwissen/lexikon-a-z/polymerase-kettenreaktion-pcr-227#:~:text=Mit%20Hilfe%20der%20PCR%20k%C3%B6nnen,Verwan
dtschaftsverh%C3%A4ltnissen%20(Vaterschaftstests%2C%20Stammb%C3%A4ume).
(30.04.2024)

 PCR-Tests - die wichtigsten Informationen - https://www.roche.de/diagnostik/fokusthemen/pcr-tests-die-wichtigsten-informationen (30.04.2024)

 Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR) -

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4102308/#:~:text=WHAT%20PCR%20DOES,based%20on%20size%20and%20charge. (04.05.2024)

 Abbildung 1: https://www.nippongenetics.eu/app/uploads/dynamic/2021/02/category-lab-instruments-725x480-c-default.jpg

 Abbildung 2: https://images.cdn.sofatutor.net/content_images/images/6884/normal/polymerase-kettenreaktion.jpg?1597137971
Vielen Dank für Ihre
Aufmerksamkeit