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Genexpression

Teil 1 - Decker
1. Vorlesung:
Genexpression: = all das, was dazu fhrt, dass das, was in der DNA codiert ist, in eine Funktion
berfhrt wird.
Die Funktionen, die uns am Leben erhalten, sind zum grten Teil Proteine, knnen auch RNAs
sein, sind aber jedenfalls etwas, das im DNA-Code manifestiert ist und das man exprimieren muss,
damit es funktionell aktiv werden kann.
Dazu kann man zunchst die Transkription kontrollieren, also einfach die Frage bestimmen, ob ein
bestimmtes Gen in einer bestimmten Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt angeschaltet ist oder
nicht.
Die Transkriptionskontrolle der Genexpression ist nur der erste Schritt, bei dem diese reguliert
werden kann, das Transkript wird ja anschlieend weitergegeben und prozessiert, d.h. man muss das
Transkript so verndern, dass es erstens einmal, wenn es sich um eine eukaryotische Zelle handelt,
aus dem Kern transportiert wird, sofern es eine Exon-Intron-Struktur besitzt mssen die Introns
herausgespliced werden, es gibt also eine ganze Menge an Prozessierungs- und Transportschritten,
bevor die reife mRNA schlussendlich im Cytoplasma vorliegt. Auch diese Schritte knnen reguliert
werden.
Auch die Transkriptstabilitt, also die Geschwindigkeit, mit der ein Transkript nach der Synthese
im Cytoplasma wieder abgebaut wird, ist ein ganz wesentlicher Faktor und wird als Halbwertszeit
angegeben, da gibt es groe Unterschiede. Es ist klar, dass eine mRNA, deren Halbwertszeit 5 min
betrgt, zu weniger Genexpression fhrt als eine, deren Halbwertszeit mehrere Stunden betrgt.
Wenn es sich um eine proteincodierende RNA handelt, muss sie natrlich translatiert werden, und
auch die Translation kann reguliert werden.
Schlielich hat man ein Protein, also sozusagen die Maschine, die in der Zelle aktiv werden soll,
diese Maschine ist aber eventuell noch abschaltbar, nmlich durch posttranslationale
Modifikationen, also beispielsweise durch die Einfhrung chemischer Gruppen, z.B.
Phosphorylierung. So kann man auch bei einem fertigen Protein noch regulieren, ob es in aktivem
oder inaktivem Zustand vorliegt. Dementsprechend reguliert man natrlich wieder die
Genexpression.
Das gleiche, das fr die mRNA gilt, dass also ihre Stabilitt ein wichtiger Faktor fr die
Genexpression ist, gilt auch fr Proteine, die sehr langlebig sein knnen, aber eben auch sehr
kurzlebig. Dementsprechend entfalten sie ihre Aktivitt auch mehr oder weniger, was natrlich
wieder nur ein Synonym fr die Regulation der Genexpression ist.
Was ist Transkription?
Das ist der Prozess, bei dem ein DNA-Matrizenstrang in eine mRNA berschrieben wird und zwar
nach den Regeln der Basenkomplementaritt, also ber G-C- bzw. A-T-Paarungen.
Der Chemismus der Transkription bestimmt, dass das Ausgangssubstrat immer ein
Ribonucleotidtriphosphat ist. Das Triphosphat liefert die Energie fr die Verknpfung von
Nucleotiden. Es wird gespalten, so dass das Triphosphat an die wachsende RNA angehngt wird.
Dabei wird ein Pyrophosphat freigesetzt, das dann noch weiter in zwei Phosphate gespalten
werden kann. Daraus kommt die Energie, die man braucht, um ein Transkript herzustellen.
Das Triphosphat sitzt am 5'-Ende des Ribonucleotids, was natrlich bedeutet, dass ein Transkript
immer nur in 5'3'-Richtung wachsen kann. Das heit nmlich, dass die Verknpfung zwischen
dem 5'-Phosphat des nchsten und dem 3'-OH des vorigen Nucleotids erfolgt, wobei die Energie
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eben von dem Triphosphat, das an dem 5'-Nucleotid sitzt, stammt. Das hereinkommende Nucleotid
liefert also immer das Triphosphat zur Verknpfung an das freie OH. Das Ende der bereits
synthetisierten RNA ist demnach ein 3'-OH.
Diese Eigenschaft der unterschiedlichen 5'- und 3'-Enden der DNA wird als chemische Polaritt
bezeichnet.
Bei der Transkription hat man einen DNA-Doppelstrang und mchte einen Teil davon in eine RNA
transkribieren. Es gibt also 2 DNA-Strnge, es wird aber nur einer davon wirklich transkribiert. Das
bedeutet, dass es schon auf DNA-Ebene einen Strang gibt, der die richtige Basen-Sequenz trgt,
man nennt ihn den codierenden Strang, und einen zweiten Strang, der die zu diesem Strang
komplementre Basensequenz trgt. Die mRNA wird auch nach den Regeln der
Basenkomplementaritt gebildet (mit Uracil statt Thymin), das heit sie entspricht ihrer Sequenz
nach dem codierenden Strang, aber sie wird transkribiert durch ihre Komplementaritt zum
nichtcodierenden Strang der DNA. Der nichtcodierende Strang der DNA wird also transkribiert,
wobei eine mRNA entsteht, die in ihrer Sequenz dem codierenden Strang entspricht. Der
nichtcodierende Strang wird deshalb auch als Template- oder Matrizenstrang bezeichnet.
Wie schnell luft Transkription ab?
Dazu gab es Messungen in E. coli und auch in Eukaryoten-Zellen, bei beiden lag die
Geschwindigkeit bei ca. 40-60 Nucleotiden pro Sekunde.
Bei E. coli ist das Wachstum der RNA gut mit der Rate der Translation verbunden, weil das
Ribosom, das die RNA translatiert, etwa 15 Aminosuren pro Sekunde schafft und jede davon von
3 Nucleotiden codiert wird.
Bei Prokaryoten-Zellen sind Transkription und Translation gekoppelte Prozesse. Das
transkribierende Enzym, die RNA-Polymerase, und die translatierende Maschine, das Ribosom,
sind rumlich nicht voneinander getrennt, d.h. sobald die RNA gebildet wird und das Ribosom an
dieser RNA bestimmte Sequenzen erkennt, kann das Ribosom beginnen daran zu binden und sie zu
translatieren. Dementsprechend ist es wichtig, dass die Geschwindigkeiten der beiden Prozesse
aufeinander abgestimmt sind.
Die Transkription ist relativ langsam verglichen mit der Replikation, die DNA-Polymerasen sind
also wesentlich schnellere Enzyme, die z.B. bei E. coli ca. 50.000 Basen pro Minute synthetisieren,
bei Eukaryoten immerhin ca. 20.000 Basen pro Minute.
Transkription bedeutet zunchst, dass die RNA-Polymerase, also das Enzym, das die Transkription
bewerkstelligt, wissen muss, wo sie transkribieren soll. Es wird nicht das ganze Genom
transkribiert. Das ist vor allem bei Eukaryoten-Zellen wichtig, wo es ja deutlich mehr DNA gibt, die
fr kein Gen codiert als solche, die fr ein Gen codiert. Die RNA-Polymerase muss also wissen, wo
ein zu transkribierendes Gen ist, sie muss irgendwelche Mglichkeiten haben zu erkennen, wo
genau sie eigentlich die Transkription beginnen soll. Diese Struktur ist nichts anderes als eine
Hufung von DNA-Sequenzen, die fr kein Transkript codieren, sondern eine Art Signalwirkung
fr die RNA-Polymerase haben, also praktisch eine Bindungsstelle fr die RNA-Polymerase
darstellen und natrlich auch fr die Proteine, die hier Genregulation betreiben. Die Gesamtheit
dieser DNA-Sequenzen, die man braucht, um Gene transkribieren zu knnen, bzw. auch um diese
Gene regulieren zu knnen, nennt man den Promoter eines Gens.
Die RNA-Polymerase muss also irgendeine Mglichkeit haben diese Promotoren zu erkennen.
Wann die RNA-Polymerase einen Promoter erkennt ist einer der zentralen Punkte der
Genregulation. Es gibt zwei Sichtweisen: Man kann sagen, dass ein Promoter etwas ist, was die
RNA-Polymerase immer erkennt, oder man kann sagen, dass sie ihn von allein nicht erkennt,
sondern dafr die Hilfe anderer Proteine braucht. Diese anderen Proteine werden als
Transkriptionsfaktoren bezeichnet und knnen Gene regulieren, also wann die RNA-Polymerase
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bindet und wann sie das nicht tut.


Die kritische Struktur fr die Bindung der RNA-Polymerase ist der Promoter eines Gens.
Wenn die RNA-Polymerase einen Promoter erkennt ist der erste Schritt, dass sie daran bindet und
zwar so, dass sie sich dadurch am Transkriptionsstart des Gens befindet. Sie beginnt die
Transkription dann damit, dass ein sogenannter offener Komplex gebildet wird. Dieser ist die
Folge eines Promoter Meltings, darunter versteht man das Aufschmelzen der DNA-Strnge im
Bereich des Transkriptionsstarts. Die RNA-Polymerase selbst bzw. Hilfsproteine mssen dann in
der Lage sein, die Strnge im Bereich des Promoters zu trennen, so dass im Bereich des Promoters
bzw. dort, wo dann der eigentliche Transkriptionsstart ist, eine dem Template-Strang oder nichtcodierenden Strang komplementre RNA gebildet werden kann. Es erfolgt dann zunchst Initial
Transcription. Darunter versteht man, dass mehrere kurze Stcke RNA synthetisiert werden, deren
Synthese aber wiederholt abgebrochen und neu initiiert wird. Dahinter verbirgt sich ein zumindest
bei Eukaryoten sehr zentraler Punkt der Genregulation, nmlich dass die RNA-Polymerase, wenn
sie die Transkription beginnt, nicht sofort kontinuierlich in die Elongationsphase bergeht.
Elongation heit, dass ein Beginn des Transkripts schon existiert, dieser muss verlngert =
elongiert werden.
Es gibt also zwei Schritte, zunchst den Beginn der Transkription, wo die Transkription vorerst
nicht kontinuierlich erfolgt, dann folgt die kontinuierliche Verlngerung des Transkripts, die
Elongation.
Irgendwann muss die RNA-Polymerase bzw. irgendjemand auch
wissen, wann das Transkript zu Ende ist, wann also das ganze Gen
transkribiert wurde. Deswegen gibt es einen ebenfalls regulierten
Prozess der Termination der Transkription. Die Termination bedeutet
einfach, dass das fertige Transkript aus der Polymerase entfernt wird.
Das kann auf verschiedene Weisen erfolgen.
Es gibt die Mglichkeit, dass das Transkript abgestreift wird, dass
es also einfach die ausreichende Affinitt zum Matrizenstrang
verliert und dann mehr oder weniger aus der Polymerase herausfllt.
Die zweite Mglichkeit ist, dass es aktiv herausgezogen wird.
Die dritte Mglichkeit, die man bei Eukaryoten beobachtet, ist, dass
das Transkript bereits bei der Termination prozessiert wird, also
sozusagen am Ende abgeschnitten wird.
Das Ende der Transkription ist also gerade bei Eukaryoten nicht
unbedingt immer das Ende des Transkripts, da die RNA-Polymerase
noch weiter transkribieren kann, aber das Transkript, das dann
abgeschnitten wird, ist fertig. Irgendwann hat sich die RNAPolymerase dann totgelaufen, was einen Prozess darstellt, der nach
wie vor nicht richtig verstanden wird, nmlich wann genau die RNAPolymerase dann wieder von dem DNA-Strang herunterfllt.
Irgendwann tut sie das aber und kann danach einen neuen
Transkriptionszyklus beginnen.
Das zentrale Enzym, das bei der Transkription zum Einsatz kommt,
ist die RNA-Polymerase. Die Transkription ist ein evolutionr alter
Prozess, deshalb sind die RNA-Polymerasen aller Organismen relativ hnlich. Die zentralen
katalytischen Vorgnge und auch die Strukturen, die fr diese wichtig sind, sind von den Bakterien
bis zu den hchsten Eukaryoten erhalten geblieben.
Mit den zentralen katalytischen Vorgngen ist gemeint, dass sie DNA binden knnen, dass sie eine
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RNA komplementr dazu paaren knnen und dass sie diese RNA enzymatisch verlngern knnen.
Grundaufbau einer solchen Polymerase in Prokaryoten (genauer gesagt in E. coli): Sie besteht aus
zwei groen Untereinheiten, - und '-Untereinheit. Diese beiden bilden das katalytische
Zentrum des Proteins aus. Sie werden in E. coli von den Genen rpoB und rpoC codiert, wobei rpo
fr RNA polymerase steht.
Es gibt auch zwei -Untereinheiten, die der RNA-Polymerase dabei helfen knnen einen Promoter
zu erkennen oder auch dazu beitragen, dass die Bindung einer RNA-Polymerase an einen Promoter
regulierbar wird. Das dafr codierende Gen heit in E. coli rpoA.
Diese - und -Untereinheiten bilden die Core-Polymerase, also die zentrale funktionelle Einheit.
Dort befindet sich das katalytische Zentrum, die Regulierbarkeit und bis zu einem gewissen Grad
die Promotererkennung sind durch die -Untereinheiten gewhrleistet. Die Minimalausstattung
einer RNA-Polymerase ist immer dieses Tetramer aus einer -, einer '- und zwei Untereinheiten.
Es gibt noch eine weitere Untereinheit, die nicht zum Core-Enzym gezhlt wird, sondern die dann
das sogenannte Holoenzym bildet. Das Core-Enzym ist also offensichtlich vor allem in seiner
Fhigkeit Promotoren zu erkennen nicht vollstndig ausgebildet. Das Core-Enzym kann zwar
transkribieren, es fehlt ihm aber die Fhigkeit zur Promotererkennung. Damit diese Eigenschaft
gewhrleistet ist, braucht man das Produkt des rpoD-Gens, die sogenannte -Untereinheit oder den
-Faktor der RNA-Polymerase.
Der Unterschied zwischen Core-Polymerase und Holoenzym ist eben die An- oder Abwesenheit des
-Faktors.

Was sind die essentiellen Strukturen der RNA-Polymerase?


Eine Polymerase muss zunchst eine DNA binden knnen. Dafr hat die RNA-Polymerase das
sogenannte Jaw (auch Klammer oder Pinzette), es kann sich wie eine Art Kiefergelenk bewegen,
was dazu fhrt, dass man einen DNA-Doppelstrang in das Enzym hineinfhren und auch festhalten
kann.
Danach wird die DNA in die sogenannte Cleft (Furche) gefhrt. Diese Furche liegt an der
Oberflche des Enzyms. In diese wird der DNA-Strang hineingebracht, der DNA-Strang wird
getrennt und hier erfolgt auch die Katalyse, das heit hier wchst der RNA-Strang und hier
befindet sich das katalytische Zentrum, die active site, des Enzyms.
Hier, wo also der DNA-Strang schon getrennt vorliegt, werden die Ribonucleotidtriphosphate
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angefgt und die Kette wchst in 5'3'-Richtung.


Um die Triphosphate an die richtige Stelle, also in die active site hinein zu bringen, bentigt man
eine besondere Struktur, dafr gibt es einen Kanal, durch den die Triphosphate so in das Enzym
hineingebracht werden, dass sie genau bei der active site landen.
Um wieder den DNA-Doppelstrang und die reife mRNA erhalten zu knnen, muss man die beiden
Strnge des DNA-RNA-Hybrids wieder trennen. Fr diese Trennung gibt es am Ende der Cleft
eine Struktur, die als Rudder bezeichnet wird. Diese hat die Funktion dafr zu sorgen, dass der
RNA-Strang von der DNA getrennt wird und durch den RNA exit channel, den RNAAusgangskanal, aus dem Enzym herausgefhrt wird und der DNA-Strang davon getrennt wird, so
dass er sich hinter der Polymerase wieder aufwinden kann, also wieder einen DNA-Doppelstrang
bilden kann. (Flap = Teil des RNA exit channels?)
Ein weiterer wichtiger Begriff ist die sogenannte Transcription Bubble, die Transkriptionsblase,
des Enzyms. Das ist ein Bereich von 20-30 Nucleotiden, innerhalb dessen die DNA-Strnge
getrennt sind und der Matrizenstrang vorliegt, um komplementr dazu RNA zu bilden.
Recent X-ray analysis of RNA polymerase has revealed important structural details that help
explain the precise mechanism of transcription. Double-helical DNA enters a long cleft in the
surface of the enzyme, and is held in place by a large flexible portion of the enzyme termed the
clamp." Within the cleft, the DNA is separated and RNA is paired to it. A magnesium ion, sitting at
the critical point where RNA nucleotides are added to the primary transcript, is thought to help
catalyze this reaction. An internal barrier forces a bend in the growing DNA-RNA duplex, exposing
the RNA end for addition of the incoming nucleotide. A short protein extension, termed the
"rudder," helps to separate the RNA from the DNA, and the two exit the polymerase along separate
paths.
Promotoren von Bakterien
Die Transcription Unit ist der Abschnitt auf der DNA, der die vollstndige Information zur
Synthese eines vollstndigen Transkripts enthlt. Zur Transcription Unit zhlt man also alles, was
gebraucht wird, um die DNA binden zu knnen, den codierenden Bereich und natrlich die Signale,
die fr die Termination der Transkription bentigt werden.
Die Transcription Unit besteht aus einer Kontrollregion (alles, was zum Promoter gehrt), einer
Reihe von Genen und einem Terminationssignal. Bei Eubakterien wird sehr hufig eine
polycistronische mRNA gebildet. Polycistronisch bedeutet, dass die mRNA mehrere Proteine
codiert. Die DNA, die eine solche mRNA hervorbringen kann, wird als Operon bezeichnet.
Ein Operon ist also eine Gruppe von Genen, die funktionell in einem Zusammenhang stehen und
deshalb gemeinsam transkribiert werden sollen. Damit sie gemeinsam und stchiometrisch gebildet
wird, entsteht eben ein solches polycistronisches Transkript. Dies ist ein wichtiger Unterschied der
Eubakterien zu den Eukaryoten.
Bei den Eukaryoten ist zunchst der Promoter wesentlich komplexer als bei den Eubakterien, was
natrlich ein Ausdruck dafr ist, dass Genexpression durch die bentigte koordinierte Genregulation
bei vielzelligen Organismen wesentlich komplexer ist.
Es gibt sehr oft eine Gliederung der RNA in Exons und Introns, also die Bereiche, die in der reifen
RNA vorkommen, die Exons, und solche, die in der reifen RNA nicht vorkommen, die Introns. Es
wird zuerst ein sogenanntes primres Transkript gebildet, das diese Introns noch enthlt, die reife
RNA wird dann durch das Heraussplicen der Introns gebildet.
Warum gibt es bei den Prokaryoten polycistronische RNA und bei den Eukaryoten nicht?
Der Grund dafr ist, dass Eukaryoten die Vorgnge der Transkription und Translation rumlich
trennen. Bei den Eubakterien gibt es die sogenannten Shine-Dalgarno-Sequenz vor jedem Cistron,
also vor jeder protein-codierenden Sequenz, man hat also eine interne Initiation der Translation. Das
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heit, dass man im Transkript an mehreren Stellen die Translation beginnen kann. Bei den
Eukaryoten gibt es hingegen in der Regel nur einen Transkriptionsstart am Anfang des Transkripts,
man kann nicht intern ein Ribosom aufspringen und translatieren lassen. Deshalb kann es bei
Eukaryoten aus mechanistischen Grnden keine polycistronischen mRNAs geben.

Ein weiterer wichtiger Aspekt der Transkription ist die DNA-Topologie. Die RNA-Polymerase
bewegt sich auf einer Helix. Durch das Erzeugen der Transcription Bubble, also durch die Trennung
der Strnge, muss man die Strnge umeinander wickeln, so dass diese entstehen kann. Dadurch
entsteht hinter dem Enzym ein Bereich von DNA, in dem die DNA unterwunden vorliegt, wo also
die Anzahl der Windungen der Strnge umeinander kleiner ist als normal, und vor dem Enzym
entsteht ein Bereich, in dem die Windungen enger sind. Das wird als negatives (unterwundene
DNA) und positives (berwundene DNA) Supercoiling bezeichnet.
Die DNA muss nach dem Transkriptionsereignis wieder in den Normalzustand zurckgebracht
werden. Das bewerkstelligen Enzyme aus der Klasse der Topoisomerasen, z.B. die DNA-Gyrase,
die dafr sorgen, dass das DNA-Supercoiling reversibel gemacht wird.
Das Supercoiling entsteht also einerseits durch die Bewegung der RNA-Polymerase und
andererseits durch das Entwinden der DNA-Strnge im Bereich der Transkriptionsblase.
Welche Konsequenzen hat das DNA-Supercoiling fr die DNA-Struktur?
Relaxierte DNA: DNA so wie sie sich, wenn sie sich in einem entsprechend physiologischen
Medium befindet, von allein windet, sie enthlt genau 10.4 bp pro 360-Windung.
Die Verwindung, also die Windung der Strnge umeinander, wird als Twist bezeichnet. Es ist der
Twist, der bei Unter- und berwindung der DNA verndert wird, so dass man eine Abweichung von
den 10.4 bp pro 360 hat.
Das Molekl versucht dann wieder in den relaxierten Zustand zurckzukehren. Dazu kann die DNA
fr sich (ohne die Einwirkung von Enzymen) Writhe durchfhren, also ein umeinander Krmmen,
wodurch der normale Twist wiederhergestellt wird, indem sich die DNA-Strnge umeinander
winden. Dadurch ist das Chromosom nicht mehr zirkulr, sondern es bildet sich eine Doppelbrezel.
Die Anzahl der Windungen des gesamten Molekls, also nicht nur der einzelnen Strnge
umeinander, wird als Writhe bezeichnet. Auch das kann quantitativ angegeben werden.
Das Ergebnis des Ganzen ist die Linkage Number. Diese misst wie oft die DNA-Strnge
umeinander gewunden sind und zwar unabhngig davon, ob man die Windungen der Einzelstrnge
umeinander (Twist) oder die des gesamten Molekls (Writhe) betrachtet. Die Linkage Number ist
also die Summe aus Twist und Writhe. Bei einem zirkulren Molekl ist der Writhe umso grer je
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kleiner der Twist ist, die Linkage Number bleibt insgesamt konstant.
Das Supercoiling kann bei Elektrophorese sichtbar gemacht werden, da die Molekle sich umso
schneller durch das elektrische Feld und die Matrix des Gels bewegen je kleiner sie sind. Die
supercoiled Form der DNA bewegt sich also schneller zum Pluspol als die relaxierte DNA.
Wenn man nun das Supercoiling sukzessive verkleinert, indem man den Writhe immer kleiner
macht, also den Twist wieder allmhlich an die 10.4 Basen fhrt, sieht man, dass die DNA bei der
Elektrophorese zunehmend langsamer wird.
Fr die Topologie von Eukaryoten-DNA ist es wichtig zu wissen, dass die Art und Weise wie sich
das Supercoiling auf die Struktur der gesamten DNA auswirken kann, unterschiedlich ist. Einerseits
gibt es das normale plektonemische Supercoiling eines zirkulren DNA-Molekls [plektonemisch =
Die Eigenschaft von 2 verdrillten Strngen sich nicht ohne Aufdrehen voneinander lsen zu lassen]
und andererseits knnen auch toroidale Strukturen entstehen, wenn man die DNA um etwas
herumwickelt. Diese toroidale Struktur ist gerade bei Eukaryoten sehr wichtig, da hier die DNA
nicht frei vorliegt, sondern sie ist um ein Nucleosom herumgewickelt.
Die plektonemische Struktur entsteht durch Einfhrung eines negativen Twists, also wenn ein
DNA-Strang so um den anderen herumgefhrt wird, dass die Linkage Number kleiner wird. Das
Molekl relaxiert dann wieder dadurch, dass ein negativer Writhe (-1) eingefhrt wird.
Die toroidale Struktur entsteht, wenn man den Twist vergrert. Auch dann kann das Molekl
relaxieren, indem es einen Wirthe einfhrt, aber in diesem Fall ist der Writhe positiv (+1).
Eine eukaryotische DNA kann man sich also als
eine toroidal verwundene DNA vorstellen, da sie
um
Nucleosomen
herumgewickelt
ist.
Nucleosomen
sind
Proteinstrukturen
aus
Histonen, um die sich die DNA zweimal windet.
Diese Windung wird erleichtert, da sie der DNA
hilft sich in einen relaxierten Zustand
zurckzubringen.
Biologisch aktive DNA ist kein relaxiertes
Molekl. Die Art der Spannung, die man in eine
biologisch aktive DNA einbringt, wird dadurch
relaxiert, dass toroidale Strukturen gebildet werden, die der Bildung von Nucleosomen
entgegenkommen.
Die Transkription ist ein topologischer Stress und damit dieser Stress nicht zu gro wird, muss man
aktiv entgegenwirken. Das machen die Topoisomerasen. Davon gibt es Typ I und Typ II
Topoisomerasen.
Die Typ II Topoisomerase oder DNA-Gyrase nimmt die Spannung aus dem DNA-Molekl mit dem
negativen Writhe, indem sie einen Doppelstrangbruch herbeifhrt und den einen Strang durch den
anderen zieht, wodurch die Spannung aus dem Molekl genommen wird.
Die Typ I Topoisomerasen bewirken nur einen Einzelstrangbruch, dann lsst man den Einzelstrang
um den anderen so lange rotieren bis wieder die normale Windungszahl (Linkage Number) gegeben
ist.
Die Topoisomerasen werden bei der Transkription bentigt, um den topologischen Stress, der durch
die Trennung der DNA-Strnge im Bereich der Transcription Bubble und durch das
Entlangwandern der RNA-Polymerase an der DNA entsteht, wieder zu relaxieren.

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Typ II:

Typ I:

An der wesentlich geringeren Geschwindigkeit der RNA-Polymerase gegenber der DNAPolymerase bei der Replikation kann man sehen, dass ein relativ intensives Proof-Reading erfolgt.
Die RNA-Polymerase prft also nach, ob ein Nucleotid, das sie komplementr zum DNA-Strang
angefgt hat, auch tatschlich korrekt war. Sollte sie feststellen, dass dem nicht so war, hat sie die
Mglichkeit dieses Nucleotid wieder zu entfernen und durch das richtige zu ersetzen. Das wird als
Proof-Reading bezeichnet.
Die Mechanismen, die hierfr greifen, sind einerseits das Pyrophosphorolytic Editing und
andererseits das Hydrolytic Editing.
Beim Pyrophosphorolytic Editing wird das letzte Nucleotid der wachsenden RNA-Kette durch ein
Pyrophosphat ersetzt. In diesem Fall bricht die RNA-Polymerase die Transkription ab, indem sie ein
Pyrophosphat am Ende anfgt und sich damit die Mglichkeit nimmt an dieses Pyrophosphat noch
ein weiteres Nucleotid anzuhngen. Es kommt zum Ende der Transkription an dieser Stelle.
Das Hydrolytic Editing stellt hingegen eine Mglichkeit dar einen Fehler tatschlich
wiedergutzumachen. Hierbei bewegt sich die RNA-Polymerase einige Nucleotide rckwrts und
entfernt einfach das ganze Stck, das die Fehlpaarung enthlt und fngt an der Stelle nochmal an
den Strang komplementr zum Matrizenstrang zu synthetisieren.
RNA polymerases catalyze rapid RNA chain growth. RNA polymerase II adds between 20 and 70
nucleotides per second to RNA and does this by moving forwards and backwards over at template
at each step. Transcribing RNA polymerases swap between three states: pre-translocated, reversetranslocated and post-translocated. During pre-translocation, the nucleotide that has just been
added is still within the nucleotide addition site of RNA polymerase II. During post-translocation,
RNA polymerase II has a free nucleotide addition site that is available to new nucleotides. In
addition to these two states, there is the backtracked state, when RNA polymerase II moves
backwards over the template, and the 3 end of the new RNA is extruded. The advantage of
backtracking is that it allows the RNA transcript to be checked and is the dominant state when the
template is damaged. The one-residue backtracked state is readily cleaved in the presence of the
elongation factor IIS (TFIIS) and a dinucleotide is released. This adds weight to the theory that
cleavage occurs in the RNA polymerase II active site and that it is important for removal of
misincorporated nucleotides. RNA polymerase II moves forwards and backwards on the template
until a mismatch of RNADNA causes the helix to distort and shift the polymerase into the
backtracked state. If it remains in this state for a long time, cleavage ensues. This one-residue
backtracked state is a key contributor to proofreading by RNA polymerase II.
Termination der Transkription: Man unterscheidet bei Eubakterien die rho-abhngige und die rhounabhngige Termination der Transkription. Man braucht also in einem der beiden Flle ein
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zustzliches Protein, den rho-Faktor, im anderen einfacheren Fall nicht.


Die rho-unabhngige Termination beruht darauf, dass das Transkript die Affinitt zum TemplateStrang so weit verliert, dass man es von diesem Template-Strang trennen kann. Damit die Affinitt
so weit sinkt, mssen zwei Voraussetzungen gegeben sein. Eine davon ist ein sogenannter Poly-URun (im Template-Strang wre das eine Poly-A-Sequenz), da ja die Bindung zwischen G-C mit 3
H-Brcken stabiler ist als die zwischen A-T mit nur zwei Wasserstoffbrckenbindungen. Bei einem
DNA-RNA-Hybrid gilt das gleiche, mit dem Unterschied der A-U-Paarung statt A-T. Dieser PolyU-Stretch, der hier synthetisiert wird, sorgt dafr, dass die Affinitt zum nichtcodierenden Strang
schon von Haus aus relativ niedrig wird.
Der zweite Faktor ist, dass in der
Terminationssequenz der RNA die Mglichkeit
zur Bildung einer Stem-Loop- oder HairpinStruktur gegeben ist. Diese Strukturen knnen
dann gebildet werden, wenn die Sequenz der
RNA eine interne Symmetrie enthlt, so dass eine
interne (intramolekulare) Basenpaarung erfolgen
kann. Dieser Stem-Loop ist relativ stabil, da er
ausschlielich aus G-C-Paarungen besteht und
seine Bildung auch thermodynamisch relativ
gnstig ist.
Beides zusammen, also die erniedrigte Affinitt
zwischen Template und RNA durch die Poly-USequenz und der relativ groe Energiegewinn durch die Ausbildung des Stem-Loops, bewirkt, dass
die RNA im Bereich des Poly-U-Runs vom Template gelst wird und damit die beiden Strnge
voneinander getrennt werden.
Bei der rho-abhngigen Termination gibt es
keine Poly-U-Sequenz. Es gibt zwar einen
Hairpin, dieser ist aber thermodynamisch nicht so
begnstigt, dass er sich von allein auffalten bzw.
dass er die Strnge trennen kann. Dafr ist die
dabei gewonnene Energie nicht ausreichend, es
wird der rho-Faktor bentigt. Dieser ist ein
multimeres Protein, das nicht nur RNA-bindende
Eigenschaften hat, sondern sich auch auf der RNA
vorwrts bewegen kann. Wenn die RNA also aus
der Polymerase herausragt, kann der rho-Faktor
binden und bewegt sich so lange an der RNA
entlang, bis er eine solche Hairpin-Struktur
findet, die ihm signalisiert, dass an dieser Stelle
die Transkription beendet werden soll. Wenn er
diese Signalstruktur erkennt, zieht er aktiv, also
unter Energieverbrauch (ATP-abhngig), das
Transkript aus der Polymerase heraus und die
Termination der Transkription ist erfolgt.
Auch Termination kann als Kontrollmechanismus verwendet werden. Das schnste Beispiel dafr
sind Phagen, z.B. der E.coli-Phage Lambda, der die Termination bzw. die Anti-Termination der
Transkription zur Regulation der Genexpression benutzt.
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Wie gelangen Viren in die Wirtszelle?


Viren brauchen zunchst an ihrer Oberflche Strukturen, mit Hilfe derer sie eine Wirtszelle
erkennen knnen, und einen Aufnahmemechanismus, sie mssen irgendwie sich selbst bzw. ihre
Nukleinsure in die Wirtszelle hineinbringen. Wenn die Nukleinsure nun in die Wirtszelle gelangt
ist, muss der Bakteriophage beginnen, seine Gene zu exprimieren, die ihm helfen sich zu
replizieren, seine Capsid-Proteine zu produzieren, sich zu verpacken und schlielich wieder aus der
Zelle herauszukommen.
Das ganze ist ein streng koordiniertes Programm, das in Phasen geteilt ist. Die erste Phase besteht
darin, sich erst einmal in der Wirtszelle zu etablieren, d.h. die Wirtszelle in gewisser Weise
umzuprogrammieren, so dass mehr Aufwand in die Vermehrung des Phagen gesteckt wird, und dass
dafr gesorgt wird, dass keine weiteren Phagen in die Zelle gelangen (Immunitt). Diese
Etablierung der Infektion bewerkstelligt das frhe oder unmittelbare (early/immediate)
Genexpressionsprogramm.
Dann folgt die mittlere Phase, in der das Virus die ntigen Schritte unternimmt, um sich zu
replizieren, also falls ntig eigene Polymerasen oder Proteine, mit denen sie die Replikation
einleiten knnen, synthetisiert.
In der spten Phase produziert das Virus alles, was es braucht, um ihre Nukleinsure wieder zu
verpacken, also um das Capsid zu bilden und um wieder aus der Zelle herauszukommen. Man
unterscheidet also ein frhes, ein mittleres und ein sptes Genexpressionsprogramm.
Der Phage Lambda reguliert diese Phasenschalter durch Anti-Termination. Am Ende des frhen
Bereichs befindet sich eine Terminationssequenz. Am Anfang, wenn nur der frhe Bereich
exprimiert werden soll, transkribiert die RNA-Polymerase den frhen Bereich und an der
Terminationssequenz wird die Transkription beendet. Eins der Gene im frhen Bereich ist das
antiterminierende Protein N. Dieses akkumuliert in der Zelle, bis irgendwann genug davon
vorhanden ist, dass es der RNA-Polymerase hilft, den Terminator zu berlesen, so dass die
Polymerase in den nchsten Bereich hinein weitertranskribieren kann und fr die Bildung der
Proteine des mittleren Bereichs sorgt. Der selbe Mechanismus bewirkt die Umschaltung auf die
Expression der spten Gene durch das antiterminierende Protein Q.
Die fr die Genexpression wichtigste Struktur stellt der Promoter dar. Der Promoter definiert den
Transkriptionsstart eines Gens, d.h. der Transkriptionsstart ist ein Teil des Promoters. Der Promoter
enthlt aber auch DNA-Sequenzen/DNA-Elemente (Elemente deshalb, weil eine Sequenz in ihrer
Gesamtheit eine bestimmte funktionelle Struktur hervorbringt, z.B. die Bindungsstelle fr ein
Protein). Diese DNA-Sequenzen bzw. Bindungsstellen sind essentiell fr die Rekrutierung der
RNA-Polymerase, aber auch fr Proteine, die bei der Regulation der Bindung der RNA-Polymerase
wichtig sind. In den meisten Situationen entscheiden Proteine, die man in diesen Fllen dann als
Transkriptionsfaktoren bezeichnet, darber, ob die RNA-Polymerase in einer bestimmten
Situation binden kann oder nicht. Es gibt auch Proteine, die darber bestimmen knnen, ob die
Polymerase in einer bestimmten Situation elongieren kann oder nicht.
Initiation und Elongation der Transkription sind also separat regulierbare Schritte. Die Regulation
der Elongation ist aber spezifisch fr Eukaryoten.
Wie findet die RNA-Polymerase einen Promoter?
E.coli besitzt etwa 1.000.000 Basenpaare DNA, von denen sind nur wenige % PromoterBasenpaare.
Wie ist die Interaktion der Polymerase mit der DNA reguliert?
Wenn man die Diffusionskonstanten von Polymerasen der Zelle bestimmt und das mit der
Wahrscheinlichkeit, auf der DNA einen Promoter zu finden, in Verbindung bringt, ist es klar, dass
Polymerasen sich dabei nicht allein auf die Diffusion verlassen knnen, da Diffusion das Finden
eines Promoters viel zu selten gestalten wrde.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Von der Gesamtheit der Polymerasen sind ungefhr 500-1000 als


Core-Enzym lose mit der DNA assoziiert, 500-1000 sind als
Holoenzym lose mit der DNA assoziiert, was bedeutet, dass sie zwar
an die DNA binden, aber nicht so fest wie sie es mssten, wenn die
DNA an dieser Stelle einen Promoter enthielte.
Die RNA-Polymerase liegt also auch, wenn sie nicht aktiv am
Transkriptionsprozess beteiligt ist, zum grten Teil an die DNA
gebunden vor.
Weiters sind 500-1000 Holoenzyme an Promotoren gebunden, das
korreliert auch ungefhr mit der Anzahl an Genen in E. coli, vor allem
mit der Anzahl aktiver Gene zu jedem Zeitpunkt, und 2500
Polymerasen sind gerade dabei irgendwelche Gene zu transkribieren.
Aus dieser Verteilung der RNAPolymerasen kann man klar sehen,
dass sie nicht die DNA per se finden
mssen, sondern nur auf der DNA
den
Promoter.
Das
der
Wahrscheinlichkeit am nchsten kommende Modell ist, dass die
RNA-Polymerase zuerst einmal zur DNA hindiffundiert, aber zu
irgendeiner DNA, nicht direkt zur Promoter-DNA. Dann folgt
random displacement between DNA, d.h. die RNAPolymerase hpft sozusagen auf der DNA von Stelle zu Stelle. Das
wird mglich, da die DNA in der Zelle ja nicht als linearer langer
Strang vorliegt, sondern fest aufgefaltet ist. Wenn nun durch diese
Auffaltung DNA-Bereiche aneinander kommen, kann die RNAPolymerase das bentzen, um auf den nchsten DNA-Bereich zu
springen. Dies geschieht so lange bis die RNA-Polymerase
tatschlich einen Promoter findet. Mathematisch konnte gezeigt
werden, dass mit diesem Modell die Wahrscheinlichkeit gro genug ist, dass Polymerasen in einem
vernnftigen Zeitraum einen Promoter finden.
Die Theorie der direkten Diffusion der Polymerasen an den
Promoter ist also falsch und auch die ursprngliche Vorstellung,
dass die RNA-Polymerase, wenn sie an DNA gebunden ist, an dieser
entlangwandert bis sie den nchsten Promoter findet.
Die RNA-Polymerase liegt in 2 Konformationen vor: Core-Enzym
und Holoenzym. Der Unterschied zwischen diesen beiden Formen
ist der -Faktor. Wenn die Polymerase an die DNA gebunden ist,
kann sie ebenfalls als Core-Enzym oder als Holoenzym vorliegen.
DNA, die noch keinen Promoter gefunden hat, kann Core- oder
Holoenzym sein. Die Polymerase, die an Promotoren gebunden ist,
ist grundstzlich ein Holoenzym und die, die aktiv transkribiert, ist
grundstzlich ein Core-Enzym.
Der -Faktor hat also offensichtlich nichts damit zu tun, ob ein
Transkript gebildet werden kann, aber offensichtlich sehr viel damit,
ob ein Promoter gefunden werden kann. Bei Assoziation des Faktors kann eine Polymerase sehr schnell einen Promoter finden
bzw. feststellen, ob die DNA, an die sie durch ihr Herumspringen
geraten ist, eine Promoter-Sequenz ist oder nicht. Das funktioniert
nur als Holoenzym.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Sobald der Promoter einmal gefunden ist und die RNA-Polymerase in die Elongationsphase der
Transkription bergeht, diffundiert der -Faktor genauso schnell wieder weg und steht fr weitere
Core-Enzyme zur Verfgung, um Promotoren zu finden, den Rest des Transkriptionsvorgangs
bewerkstelligt die RNA-Polymerase aber ohne den -Faktor.
2. Vorlesung:
Wie kann eine Polymerase feststellen, dass eine falsche Basenpaarung passiert ist?
Whrend der Elongationsphase ist die Nettobewegung der RNA-Polymerase natrlich entlang des
Template-Strangs. Diese Bewegung erfolgt aber nicht kontinuierlich, sondern sie ist bei Bedarf
eigentlich eher ein Ruckeln bzw. Inchworming, was heit, dass die Polymerase bei Bedarf in der
Vorwrtsbewegung innehlt und wieder ein Stck zurckgeht. In diesem Schritt zurck ist sie in der
Lage noch einmal die Nucleotide hinter sich zu sehen und bei Bedarf zu entfernen und erst dann
die nchste Vorwrtsbewegung zu machen.
Die Ausgangslage wird hierbei als Post-Translocation bezeichnet. Nach Einfgen eines neuen
Ribonucleotidtriphosphats an der Addition site im katalytischen Zentrum der RNA-Polymerase
befindet man sich im Pre-Translocation state. Jetzt folgt der nchste Bewegungsschritt der
Polymerase. Dieser kann aber zuerst mit einem Backtracking beginnen, also damit, dass sich die
Polymerase nicht gleich weiter vorwrts bewegt, sondern erst sozusagen Anlauf nimmt, sich also
zuerst einen Schritt zurckbewegt, so dass dann nicht nur das gerade angefgte Nucleotid wieder
zugnglich ist, sondern auch das vorhergehende. Wenn nun das vorangegangene Nucleotid einen
Mismatch mit dem Template darstellt, knnte es entfernt werden.
Um so einen Mismatch zu erkennen, muss die RNA-Polymerase bestimmte strukturellen
Gegebenheiten erkennen knnen, die ihr signalisieren, ob ein Mismatch stattgefunden hat. Bei
einem Mismatch sprt die Polymerase anscheinend eine gewisse Spannung bzw. Verzerrung in der
Helix, die sich zwischen Template-Strang und RNA bildet, und diese Spannung fhrt dann dazu,
dass die Polymerase nicht gleich weiterwandert, sondern erst dieses Backtracking durchfhrt.
Der -Faktor macht den Unterschied aus zwischen einer Polymerase, die sehr gut dazu in der Lage
ist Promoter-Regionen auf der DNA zu erkennen, und einer, die das nicht kann.
Was genau an einem Promoter wird hierbei erkannt, was unterscheidet Promoter-DNA von anderer
ganz gewhnlicher DNA?
Nach Entwicklung der Methoden zur Sequenzierung von DNA in den 1970er Jahren hat man in den
1980ern damit begonnen auch Promotoren zu sequenzieren, zur Untersuchung, ob diese
Gemeinsamkeiten aufweisen. Um das machen zu knnen musste man natrlich zuerst wissen, dass
sich in dem jeweiligen sequenzierten Bereich ein Promoter befinden knnte. Schon frher konnte
man zur Bestimmung von (wahrscheinlichen) Promotoren die Bindung von RNA-Polymerasen
verwenden, also Bindungs-Assays durchfhren, mit denen man feststellen konnte welche DNA
besonders gut an einer Polymerase hngen bleibt, was eine hohe Wahrscheinlichkeit fr die
Anwesenheit eines Promoters in diesem DNA-Stck signalisiert.Es konnten dabei tatschlich
bereinstimmungen gefunden werden. Bei den Sequenzierungsexperimenten orientierte man sich
am Transkriptionsstart (+1) und entdeckte im -10-Bereich, also etwas upstream des
Transkriptionsstarts eine auffllige Hufung von A-T-Paarungen. Man hat als Consensussequenz
TATAAT festgelegt und wird als TATA-Box bezeichnet. Ein zweiter aufflliger Bereich war bei ca.
-35, bei dem die Consensussequenz TTGACAT erhalten wurde. Consensus bedeutet, dass es sich
um die Nucleotide handelt, die an dieser Position mit der hchsten Wahrscheinlichkeit auftreten, es
gibt zwar Abweichungen, die allerdings nicht so gro sind, dass die Consensussequenz nicht mehr
erkennbar ist.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Diese Bereiche um die Positionen -10 und -35 definieren einen Promoter. Warum?
Der -Faktor wird unterteilt in die 4 Subdomnen 1-4, die wiederum in Strukturmotive unterteilt
sind, die mit 1.1, 1.2 etc. bezeichnet werden.
Domne 4 ist verantwortlich fr die Erkennung des -35Bereichs, Domne 3 fr die Erkennung des -10- bzw. des
Extended -10-Bereichs, d.h. nicht nur die TATA-Sequenz
selbst, sondern auch die Nucleotide um diese herum.
Eine weitere wichtige Funktion ist das Melting, fr das
Domne 2 verantwortlich ist. Diese befindet sich im Bereich
der Transcription Bubble. Der nchste Schritt nach der
Bindung des Promoters durch die RNA-Polymerase ist, dass die Polymerase erst einmal die beiden
DNA-Strnge voneinander trennen muss, bevor sie beginnen kann eine RNA zu polymerisieren.
Dieses Entwinden der DNA bezeichnet man als Promoter Melting. Dafr braucht man eine
enzymatische Funktion, die als Helicase bezeichnet wird. Das Suffix -ase bedeutet immer, dass eine
Struktur zerstrt wird, in diesem Fall die Helix.
Der -Faktor hat also nicht nur die Fhigkeit die -10- und -35-Bereiche zu erkennen und damit die
Erkennung eines Promoters durch die RNA-Polymerase zu vermitteln, sondern ist auch wesentlich
daran beteiligt, dass die Polymerase in der Lage ist die DNA-Strnge zu trennen.
Das kann z.B. durch Einfhren von Mutationen in die einzelnen Subdomnen des -Faktors
bewiesen werden oder durch Einfhren von Mutationen in die DNA. ber Mutationsanalyse kann
dann festgestellt werden, in welchem Bereich im Promoter kritische Nucleotide sind, die die
Bindung der Polymerase beeintrchtigt. So wurden die -10- und -35-Bereiche als kritische Bereiche
fr die Bindung der Polymerase besttigt.
Es gibt aber auch andere Bereiche, wo die RNA-Polymerase mit der DNA assoziiert ist. In diesen
Bereichen ist die DNA vor chemischen Modifikationen geschtzt. Das Verfahren, mit dem das
festgestellt wurde, wird als DNA Footprinting bezeichnet.
DNA Footprinting kann auf zwei Arten durchgefhrt werden.
Man kann die DNA mit einer Chemikalie behandeln, die eine bestimmte Base (z.B. Purin-Basen)
modifiziert. Diese Modifikation fhrt dazu, dass diese Base durch RNA-Polymerase nicht mehr
erkennbar ist.
Man kann aber auch umgekehrt vorgehen, indem man die Polymerase zuerst an die DNA binden
Genexpression (Decker, Blsi)

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lsst und erst dann die Chemikalie dazugibt. Dann kann man sich die Frage stellen, welche Basen
jetzt durch die Bindung des Enzyms vor der Attacke der Chemikalie geschtzt sind.
Interessant dabei ist, dass die Nucleotide, die durch die RNA-Polymerase-Bindung betroffen sind,
sich fast alle auf demselben DNA-Strang befinden, nmlich auf dem codierenden Strang, also
nicht auf dem, zu dem komplementr die RNA synthetisiert wird.
Der Grund dafr ist, dass die RNA-Polymerase einen Strang nicht gleichzeitig ganz fest halten und
transkribieren kann. Sie bindet deshalb an den codierenden Strang und hat dann viele
Freiheitsgrade, mit dem Matrizenstrang so umzugehen, dass sie optimal eine komplementre RNA
dazu bilden kann. Deshalb betreffen die meisten Kontakte der RNA-Polymerase mit dem Promoter
den codierenden Strang.
Welche Verfahren gibt es, mit denen man die Stelle, an der ein Enzym oder allgemein ein Protein an
die DNA bindet, feststellen kann?
Dafr gibt es eine ganze Reihe von Verfahren, die unter dem Schlagwort DNA Footprinting
bekannt sind. Das sind Verfahren, mit denen man quasi einen Fuabdruck des Enzyms auf der DNA
markieren kann.
Bsp.: DNAse I Footprinting: Die DNAse I ist ein Enzym, das die DNA vor allem in der groen
Furche schneidet, allerdings nicht an einer bestimmten Sequenz, es kann also jedes Nucleotid von
DNAse I geschnitten werden.
Der Footprint wird so erzeugt, dass man die Polymerase an die
DNA binden lsst und so die DNA durch die Polymerase
geschtzt wird, d.h. dort, wo die Polymerase an den Promoter
gebunden ist, kann die DNAse nicht schneiden.
Um das ganze sichtbar zu machen wird die DNA im Vorfeld an
einem Ende radioaktiv markiert (meistens am 5'-Ende, da es dort
am einfachsten ist).
Fr den Versuch erstellt man ein Gemisch aus der zu
untersuchenden DNA, Polymerasen und DNAse, wobei nur so
viel DNAse zugegeben wird, dass jedes DNA-Molekl im
Gemisch genau einmal geschnitten wird. Parallel wird ein zweiter
Ansatz ohne Polymerase erstellt. Stimmt das Verhltnis von DNA
zu DNAse, wird in diesem Ansatz jedes der DNA-Molekle
einmal geschnitten, wobei die Wahrscheinlichkeit eines Schnitts
nach jedem Nucleotid gleich ist. Man erhlt also eine
Fragmentleiter, in der sich die einzelnen Stcke jeweils um ein
Nucleotid unterscheiden.
Nach Binden der Polymerase an die DNA im Bereich des
Promoters kann die DNAse dort nicht mehr schneiden, so dass
man nach elektrophoretischer Auftrennung die Fragmente, die den Schnittstellen innerhalb des
Promoters entsprechen, nicht mehr erhlt. Dieses Loch in den DNA-Fragmentbanden, das
dadurch entsteht, wird als DNAse I Footprint bezeichnet. Durch parallele Sequenzierung des
verwendeten DNA-Stcks kann man auch gleich die durch die Polymerase erkannte Sequenz
bestimmen.
Das Footprinting-Verfahren kann aber auch mit Chemikalien durchgefhrt werden.
Neben den bereits besprochenen Consensussequenzen wurden mit der Zeit auch noch andere
entdeckt und in Verbindung damit auch, dass es bei E. coli nicht nur einen, sondern mehrere Faktoren gibt. Diese werden nach ihrem Molekulargewicht (in kDa) bezeichnet und erkennen
jeweils andere Consensussequenzen. Der von den meisten Genen verwendete ist 70, der genau die
schon besprochenen Sequenzen (-10: TATAAT und -35: TTGACAT) erkennt, es gibt aber auch
Genexpression (Decker, Blsi)

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andere -Faktoren, die dann auch andere Consensussequenzen erkennen und in vielen Fllen nur
unter bestimmten Bedingungen vorliegen, z.B. als Reaktion auf starke Temperaturschwankungen
(heatshock) oder wenn Bewegung im Rahmen von Chemotaxis notwendig ist. Diese speziell auf die
bestimmten Situationen abgestimmten Gene besitzen auch dem jeweiligen -Faktor entsprechende
Consensussequenzen.
Es knnen also mehrere verschiedene Holoenzyme gebildet werden, wodurch unterschiedliche
Gene exprimiert werden knnen.
Diese Regulation durch die verschiedenen -Faktoren ist z.B. auch beim Bacillus subtilisBakteriophagen SP01 wichtig. Dieser verwendet nicht wie der E. coli-Phage Lambda AntiTerminationssignale fr das Umschalten zwischen den verschiedenen Stadien der Genexpression,
sondern unterschiedliche phagencodierte -Faktoren. Die frhen Gene enthalten dabei das Gen fr
den -Faktor 28, der den Promoter fr die mittleren Gene erkennt, die wiederum das Gen fr den Faktor 34 enthalten, der den Promoter der spten Gene erkennt.
Eine
weitere
wichtige
StrukturFunktionsbeziehung zwischen RNA-Polymerase
und Promotoren betreffen die beiden kleinen Untereinheiten der Polymerase. Diese knnen die
Affinitt der Polymerase zu bestimmten
Promotoren zustzlich erhhen. Diese Promotoren
besitzen zustzlich zu den -10- und -35Consensussequenzen noch ein UP-Element (UP upstream promoter), zu dem die Untereinheiten der Polymerase Kontakt aufnehmen, was die Bindungsstrke der Polymerase an den
Promoter weiter erhht.
Wie kann man nun Gene zustzlich regulieren?
Bei jedem Gen bzw. Operon braucht man fr die Expression einen Promoter, es gibt aber viele
Gene, die man nicht immer transkribieren mchte, sondern nur in bestimmten Situationen. Deshalb
gibt es abgesehen von der RNA-Polymerase selbst (inklusive der alternativen -Faktoren) noch eine
oder mehrere weitere Ebenen der Regulation.
Was ist ein Operon?
Ein Operon ist eine fr Prokaryoten bzw. Eubakterien typische Anordnung von Genen, es
bezeichnet eine Gruppe von Genen, die in direkter Abfolge auf der DNA angeordnet sind. Die darin
codierten Gene werden gemeinsam reguliert und in einer gemeinsamen polycistronischen mRNA
transkribiert. Das heit jedes Operon hat einen Promoter, aber mehrere Gene, die am Ende alle Teil
eines polycistronischen Transkripts sind.
Wie kann ein Operon reguliert werden?
Operons knnen positiv oder negativ reguliert sein. Negative Regulation bedeutet, dass ein Gen im
Normalzustand (by default) angeschaltet ist, d.h. um es abzuschalten muss man die Transkription
aktiv verhindern. Die RNA-Polymerase kann also ungehindert an den Promoter dieses Gens binden,
um das zu verhindern muss ein Protein gebildet werden, das als Repressor wirkt. So ein
transkriptioneller Repressor verhindert, dass die RNA-Polymerase dieses Gen transkribieren
kann.
Bei der positiven Regulation ist es umgekehrt, d.h. das Gen wird im Normalzustand nicht
transkribiert, wenn man es anschalten mchte muss ein transkriptioneller Aktivator gebildet
werden.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Beispiele fr negative Regulation: Operons in E. coli, die alternative Zuckerquellen (Lactose,


Galactose, Arabinose) erschlieen.
Warum sind diese Operons negativ reguliert, also durch einen transkriptionellen Repressor?
Da der jeweilige Zucker, wenn er vorhanden ist, als Inducer des Operons wirkt, d.h. der Zucker
inaktiviert den Repressor, wodurch das Operon transkribiert werden kann.
Die Lactose-, Galactose- und Arabinose-Operons codieren jene Enzyme, die fr die
Metabolisierung der jeweiligen Zuckerquellen notwendig sind. Diese Enzyme werden also immer
zur gleichen Zeit und auerdem in stchiometrischen Mengen bentigt, deshalb ist es nur logisch
die entsprechenden Gene in einem Operon zusammenzufassen und gemeinsam zu regulieren.
Der Promoter des lac-Operons ist ein wenig komplexer als die bisher besprochenen. Es gibt die
-10- und -35-Bereiche, an die die RNA-Polymerase bindet, zustzlich gibt es aber eine Struktur, die
als Operator bezeichnet wird, und auerdem eine CAP-Bindungsstelle.
Der Name CAP site ist ein wenig
unglcklich gewhlt, da damit in der
Molekularbiologie sonst in der Regel das +1Nucleotid von Eukaryoten-mRNA bezeichnet
wird, an das das Cap angehngt wird. Hier
bezeichnet CAP site allerdings die
Bindungsstelle fr das CAP-Protein.
Der lac-Operator besteht aus zwei halfsites, also zwei halben Bindungsstellen. Die
Sequenzen dieser beiden half-sites bilden ein
Palindrom,
sie
sind
also
rotationssymmetrisch, was bedeutet, dass man
dieselbe Sequenz, die man auf dem einen
Strang vorwrts ablesen kann, auf dem anderen Strang rckwrts ablesen kann. Das ist ein Hinweis
darauf, dass das Protein, das hier bindet, ein dimeres Protein ist, bei dem jedes Monomer eine dieser
half-sites erkennt. Sehr viele DNA-bindende Proteine (Transkriptionsfaktoren) binden die DNA als
Dimere und haben deshalb solche palindromische Erkennungssequenzen (inverted repeats).
Was macht der Operator?
Der Operator bindet ein Repressorprotein, in diesem Fall den lac-Repressor. Dieser wird bei E.
coli von lacI codiert. Dieses Gen produziert permanent diesen lac-Repressor und solange keine
Lactose vorhanden ist bindet der Repressor an den Operator und sorgt dafr, dass das Gen
abgeschaltet ist = aktive Repression bzw. negative Regulation.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Jedes Repressor-Monomer hat selbst auch eine


Bindungsstelle fr Lactose. Lactose wirkt nun als
Inducer des Gens, da sie die Struktur des Repressors
so verndert, dass er nicht mehr an die DNA binden
kann. Er verlsst den Operator und die RNAPolymerase kann das Gen transkribieren.
Es gibt nicht nur eine, sondern 3 Bindungsstellen
(Operatoren) im lac-Operon, der Hauptoperator
(Operator 1, O1) ist allerdings derjenige, der mit der
Bindungsstelle der RNA-Polymerase berlappt. O2
befindet sich relativ weit unterhalb (+410), O3 etwas
oberhalb (-83) des Gens. Maximale Repression des
lac-Operons entsteht dann, wenn der Repressor
gleichzeitig an O1 und entweder O2 oder O3 bindet,
es sind also sogar unterschiedliche Effizienzen von
Repression mglich, indem der Repressor entweder
nur an eine oder an zwei Bindungsstellen gebunden
wird.
Lange Zeit wurde gedacht, dass der lac-Repressor das lac-Operon dadurch reprimiert, dass er die
Bindung der RNA-Polymerase an den Promoter inhibiert. Mittlerweile gibt es aber Studien, die eher
dafr sprechen, dass der Repressor und die Polymerase durchaus gleichzeitig an das Operon binden
knnen, dass die Polymerase in Anwesenheit des Repressors aber nicht in der Lage ist die DNAStrnge voneinander zu trennen, was ja eine elementare Voraussetzung fr die Transkription
darstellt.
Was passiert hier strukturell?
Ein Repressor-Monomer bindet also an der einen half-site am einen Strang, das andere an der
anderen half-site am anderen Strang. Die Struktur des Dimers ist so, dass bestimmte RepressorHelices ganz genau in die groe Furche der DNA hineinpassen, was die Voraussetzung fr dessen
Bindung ist. Diese Helices bilden die DNA-bindende Domne des Repressors.
Wenn nun der Inducer bindet, wird der Repressor von der Lactose zusammengeschoben, so dass die
Helices zusammengedrngt werden, also der Abstand zwischen ihnen verkleinert wird, so dass die
Helices der beiden Monomere in benachbarte groe Furchen der DNA hineinpassen und die
Fhigkeit des Repressors, DNA zu binden, verlorengeht.
Die CAP site stellt ein weiteres regulatorisches Element des lac-Operons dar. Damit unterliegt das
lac-Operon nicht nur negativer Kontrolle durch den Repressor, sondern gleichzeitig auch positiver
Kontrolle durch das catabolite activator protein (CAP, oder auch CRP fr cAMP receptor protein).
Dieses bindet an die CAP site, die sich oberhalb des Operators befindet. Das gleiche gilt fr das galund das ara-Operon.
Die Funktion des CAP hat auch viel damit zu tun, dass Zellen ungern
Energie verschwenden. Die Situation von E. coli ist nmlich so, dass
sehr oft Lactose und Glucose vorhanden sind. Glucose ist mit
weniger Aufwand metabolisierbar, also wird ihr der Vorzug gegeben.
Dadurch wird aber auch ein Mechanismus bentigt, der signalisiert,
ob noch gengend Glucose vorhanden ist. Das bewerkstelligt cAMP,
das bei gengend ATP nur in geringer Konzentration in der Zelle
vorliegt. Bei Glucose-Mangel sinkt die Menge an ATP, die Zelle
Genexpression (Decker, Blsi)

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kann also nicht mehr ausreichend Energie erzeugen, und die Zelle beginnt cAMP zu bilden. Dieses
bindet an das CAP und aktiviert es, so dass es an die entsprechenden Promotoren binden kann.
Ohne Bindung des Aktivators CAP kann die Polymerase an den Promoter binden und es kommt
auch zur Transkription, allerdings nur in basaler Menge, also relativ wenig. Ist keine Glucose
vorhanden, Lactose aber schon, kommt es zur maximalen Transkription, da der Repressor durch die
Lactose inaktiviert wird und CAP durch Anwesenheit von greren Mengen cAMP an die CAP site
gebunden wird.
Was macht das CAP?
CAP verbiegt die DNA so, dass die Polymerase durch ihre -Untereinheiten direkt mit der CAP site
interagieren kann, was der Polymerase erlaubt mit erhhter Affinitt an den Promoter zu binden.
Warum gibt es mehr als einen Operator?
Wenn weder Glucose noch Lactose vorhanden sind gibt es keine Transkription des lac-Operons,
weil zwar positive Kontrolle durch das CAP erfolgt, aber der Repressor am Operator gebunden
bleibt.
Bei Anwesenheit von Glucose, aber Fehlen von Lactose gibt es ein wenig Transkription des lacOperons, da die Repression in Abwesenheit von Glucose noch effizienter ist als in Anwesenheit von
Glucose. Das weist darauf hin, dass das CAP bei gebundenem Repressor die Repression noch
stringenter macht.
Die Bindungsstelle fr das CAP liegt zwischen den beiden Operatoren O1 und O3. Durch Bindung
des CAPs wird die DNA verbogen. Bei der positiven Regulation bedeutet das, dass es die
Interaktion mit den -Untereinheiten der Polymerase erlaubt. Wenn die Polymerase aber eh nicht
transkribieren kann, weil der Repressor aktiv ist, fhrt es dazu, dass die Repressor-Dimere, die an
O1 und O3 gebunden sind, durch die Schlaufe miteinander interagieren knnen und so einen
besonders repressiven Zustand herstellen knnen.
Aus diesem Grund wird der Repressor in lteren Publikationen oft als Tetramer dargestellt.
Positive und negative Regulation kann auf
unterschiedliche Weise erfolgen.
Negative Regulation: Es gibt den Fall, dass es einen
aktiven Repressor gibt, der durch einen Inducer
inaktiviert wird (z.B. lac-Operon), aber auch den, dass
der Repressor von Haus aus inaktiv ist und erst durch
einen Korepressor aktiviert werden muss (z.B. trpOperon).
Positive Regulation: Hier gibt es den Fall, dass ein
inaktiver Aktivator erst durch einen Inducer aktiviert
werden muss (CAP: Inducer = cAMP), aber auch den,
dass der Aktivator von Haus aus aktiv ist und durch
einen Korepressor inaktiviert werden muss.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Das Tryptophan-Operon ist kein


katabolisches Operon, sondern ein
anabolisches, d.h. die hier codierten
Gene dienen nicht dazu eine
Nahrungsquelle zu erschlieen, also
einen Stoff abzubauen, sondern dazu
einen Stoff aufzubauen. Immer, wenn
kein Tryptophan aus der Umwelt
gewonnen werden kann, muss E. coli
es selbst synthetisieren (Menschen
knnen das nicht, fr uns ist Trp
essentiell). Wenn Trp im Medium
vorhanden ist, kann es von auen
aufgenommen werden und das trpOperon ist inaktiv und umgekehrt.
Das Trp wirkt als Korepressor. Das trp-Operon ist im Normalzustand angeschaltet, der Repressor ist
von Haus aus inaktiv. Wird dem Medium Trp zugegeben bindet es als Korepressor an den
Repressor, dieser wird aktiv und die Gene werden abgeschaltet.
Beim Arabinose-Operon ist bei der Repression eine Strukturnderung der DNA wichtig. Auch hier
erfolgt dies durch ein Verbiegen der
DNA, wodurch ein repressive loop
erzeugt wird.
In Abwesenheit von Arabinose, wo die
Gene des ara-Operons nicht gebraucht
werden, sorgt das Repressorprotein araC
dafr, dass durch Interaktion der zwei
Bindungsstellen araO2 (Operator 2) und
I1 genauso wie beim lac-Repressor eine
Tetramer-Situation geschaffen wird, was
eine stabile Repression des Operons zur
Folge hat.
In Anwesenheit von Arabinose sorgt der Inducer nicht dafr, dass der Repressor von der DNA
entfernt wird, sondern er konvertiert den Repressor in einen Aktivator. Dieser Aktivator verliert die
Fhigkeit mit dem Operator araO2 zu interagieren, gewinnt aber die Fhigkeit zur Bindung der I2Bindungsstelle. Das araC-Tetramer bindet nun also nicht mehr an O2 und I1, sondern an I1 und I2
und sorgt dadurch nicht mehr fr den repressive loop, sondern fr positive Regulation durch
Interaktion mit der RNA-Polymerase. Dadurch kommt es zur Transkription des Arabinose-Operons.
Nicht jedes Molekl, das Gene in E. coli regulieren soll, gelangt tatschlich in die Zelle, manche
davon kommen nur bis in den periplasmatischen Raum. Damit diese trotzdem die Fhigkeit von E.
coli, auf unterschiedliche Nahrungsangebote zu reagieren, regulieren knnen, werden Mechanismen
bentigt, um Signale an der Plasmamembran in vernderte Genexpression im Inneren umzusetzen.
Dafr gibt es in E. coli das Zwei-Komponentensystem.
Das Zwei-Komponentensystem besteht aus einem Sensor und einem Response regulator. Die
Aufgabe des Sensors ist es die Menge einer Nahrungsquelle zu detektieren und in ein intrazellulres
Signal umzusetzen.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Bsp.: Der PhoR-Sensor misst die Phosphat-Konzentration im


extrazellulren Raum. Ist gengend Phosphat vorhanden ist der
Sensor inaktiv, die fr die Erschlieung von Phosphatquellen
bentigten Gene werden nicht transkribiert. Sinkt aber die
Phosphatmenge im periplasmatischen Raum und es ist nicht
mehr genug davon vorhanden, damit der Sensor permanent ein
Phosphat gebunden hat, wird der Sensor aktiv. Dadurch
bekommt er eine Kinase-Aktivitt und kann ein Histidin des
Response regulators PhoB phosphorylieren. Das geschieht
durch bertragung des -Phosphats eines ATP-Molekls auf ein
Histidin des Response regulators. Die Phosphorgruppe wird dann
vom Histidin auf ein Aspartat bertragen. In diesem Zustand ist
der Response regulator aktiv, was bedeutet, dass er jetzt ein aktiver Transkriptionsfaktor ist, der
die Transkription einer Reihe von Genen fr die Erschlieung von Phosphatquellen anschaltet.
Ein weiteres Beispiel fr Zwei-Komponentensysteme ist das
Glutamin-Synthase-Gen.
Glutamin
ist
eine
potentielle
Stickstoffquelle.
Das ganze System wird durch die Menge an organisch gebundenem
Stickstoff reguliert. Es gibt also in diesem Fall den Sensor NtrB
und den Response regulator NtrC (Ntr Nitrogen). Ist eine
anorganische Stickstoffquelle vorhanden, mchte E. coli diesen
Stickstoff durch die Bildung von Glutamin binden, die GlutaminSynthase wird synthetisiert. Das geschieht durch ein RNAPolymerase-Holoenzym, das den -Faktor 54 enthlt. Dieses
Holoenzym allein reicht aber nicht fr die Genexpression, es ist
zustzlich positive Regulation durch das Zwei-Komponentensystem
bestehend aus dem Sensor NtrB und dem Response regulator NtrC
notwendig.
Dazu phosphoryliert NtrB NtrC, das daraufhin als Tetramer an den
Promoter der Glutamin-Synthase bindet, was die Bildung einer DNA-Schlaufe zur Folge hat.
Dadurch kann der Response regulator NtrC direkt mit der RNA-Polymerase interagieren, was
wichtig ist, damit die Polymerase die Promoter-Strnge trennen kann.
Das 54-RNA-Polymerase-Holoenzym ist dabei schon vor Binden von NtrC an den Promoter
gebunden, aber nicht in der Lage, ihn in die offene Konformation zu berfhren.
Die NtrC-Bindungsstelle ist hnlich wie bei Enhancern eukaryotischer Gene relativ weit vom
Transkriptionsstart entfernt. Nach Phosphorylierung von NtrC durch NtrB wird fr die Interaktion
mit der RNA-Polymerase eine Schlaufe gebildet und es kommt zu einer Konformationsnderung,
die die Polymerase dazu befhigt die DNA-Strnge zu trennen. Die Energie fr diese
Konformationsnderung bezieht NtrC aus ATP-Hydrolyse.
Ein weiteres Beispiel fr Genregulation, wo der Transkriptionsfaktor die DNA-Struktur verndern
muss, damit Genexpression stattfinden kann, ist das MerT-Protein (Mer Mercury =
Quecksilber). Dieses System wird durch den Transkriptionsfaktor MerR reguliert. Das MerTProtein ist verantwortlich fr die Entgiftung von Quecksilber.
Der Transkriptionsfaktor MerR ist hier die ganze Zeit im Bereich zwischen den -10- und -35Sequenzen gebunden, sorgt aber in Abwesenheit von Quecksilber dafr, dass die RNA-Polymerase
nicht binden kann.
Fr die Bindung der RNA-Polymerase mssen die -10- und -35-Bereiche topologisch so orientiert
sein, dass sie auf derselben Seite liegen. Beim MerT-Gen weisen die beiden Consensussequenzen
Genexpression (Decker, Blsi)

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allerdings im Normalzustand in unterschiedliche


Richtungen, so dass die RNA-Polymerase, die ja beide
Sequenzen von einer Seite her binden muss, dazu nicht in
der Lage ist.
In Anwesenheit von Quecksilber erhlt das MerR-Protein
die Fhigkeit, die DNA-Topologie durch Verwinden der
Helix so zu verndern, dass die -10- und -35-Bereiche auf
die gleiche Seite gedreht werden. Somit schafft das Protein die Voraussetzung, dass die Polymerase
an den Promoter binden und das MerT-Gen transkribieren kann.
All diese Eigenschaften, dass Transkriptionsfaktoren die DNA-Struktur verndern, dass sie
zwischen aktiver und inaktiver Form wechseln, indem sie phosphoryliert werden oder einen
Liganden binden, gibt es in anderer Form auch bei Eukaryoten.
Wo gibt es in der Regulation der Transkription Unterschiede zwischen Prokaryoten und
Eukaryoten?
In den Prokaryoten gibt es nur eine
RNA-Polymerase, bei Eukaryoten
gibt es 3 verschiedene.
In
Prokaryoten
werden
polycistronische mRNAs gebildet,
in Eukaryoten bis auf sehr wenige
Ausnahmen
(meistens
viralen
Ursprungs)
monocistronische
mRNAs.
In Prokaryoten gibt es keine
deutliche Abgrenzung von Kern
und Cytoplasma, es gibt also keinen
Zellkern. Dementsprechend knnen
Transkription
und
Translation
gekoppelt
sein,
weil
die
Ribosomen, sobald ihre Bindungsstellen auf der transkribierten RNA vorhanden sind, diese
sofort beginnen knnen zu translatieren. In Eukaryoten gibt es hingegen eine deutliche
Kompartimentalisierung, dementsprechend knnen Transkription und Translation nicht
gleichzeitig stattfinden. Eine mRNA muss, nachdem sie gereift, also prozessiert ist, erst aus
dem Zellkern heraustransportiert werden, bevor die im Cytoplasma vorhandenen Ribosomen
sie translatieren knnen.
Die Promoterstrukturen der Prokaryoten sind relativ einfach im Vergleich zu den sehr
komplexen Promoterstrukturen mit den vielen unterschiedlichen regulatorischen Einflssen,
die auf ein eukaryotisches Gen einwirken knnen.
In den Prokaryoten ist ein RNA-Polymerase-Holoenzym von sich aus in der Lage, einen
Promoter zu erkennen, allein durch die Assoziation des -Faktors, es sind keine weiteren
Hilfsproteine notwendig. Bei den Eukaryoten muss ein sehr komplexer Initiationskomplex
gebildet werden, der fr die Erkennung eines Promoters durch die RNA-Polymerase und
infolgedessen auch fr die Transkription des auf den Promoter folgenden Gens notwendig
ist.
Warum gibt es in Eukaryoten 3 RNA-Polymerasen?
In Eukaryoten werden Gengruppen dadurch definiert, dass sie von unterschiedlichen Polymerasen
transkribiert werden. RNA-Polymerase I transkribiert ausschlielich rRNA im Nucleolus, RNAGenexpression (Decker, Blsi)

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Polymerase II transkribiert ausschlielich proteincodierende mRNAs, RNA-Polymerase III


transkribiert tRNA und 5S rRNA, aber auch kleine nuklere RNAs (small nuclear RNAs =
snRNAs), die fr das Prozessieren, also das Splicing von RNA gebraucht werden.
Die 3 Polymerasen sind miteinander und auch mit der E. coliPolymerase eng verwandt. In der Struktur der EukaryotenPolymerase gibt es zwar durchaus eine hhere Komplexitt als
in der der E. coli-Polymerase, da sie viel mehr Untereinheiten
haben, aber die grundstzlichen Strukturen der E. coliPolymerase sind vorhanden.
Die E. coli-Polymerase besteht aus den beiden groen
Untereinheiten und ' und aus den zwei kleinen Untereinheiten. Die dazu homologen Untereinheiten, die bei
allen 3 eukaryotischen Polymerasen gefunden wurden, sind
bei den groen Untereinheiten L und L' (L large). Die L'Untereinheit der RNA-Polymerase II hat eine zustzliche
Struktur, die als carboxyterminale Domne bezeichnet wird, ist
aber trotzdem mit den anderen verwandt.
Es gibt in Eukaryoten-Polymerasen auerdem auch -hnliche
Untereinheiten.
Zustzlich zu diesen 4 Untereinheiten, die denen der E. coli-Polymerase homolog sind, besitzen alle
3 eukaryotischen RNA-Polymerasen die gleichen 6 Untereinheiten plus eine variable Anzahl
unterschiedlicher individueller Enzym-spezifischer Untereinheiten (Pol I: +5, Pol II: +4, Pol III:
+7), durch die sich die 3 Polymerasen unterscheiden. Diese Gemeinsamkeiten und Unterschiede
wurden durch elektrophoretische Auftrennung der Untereinheiten festgestellt.
Abgesehen davon lassen sich die Polymerasen aber auch aufgrund ihrer Lokalisation identifizieren
(Pol I: Nucleolus, Pol II & III: Nucleoplasma; im Nucleolus befinden sich die Gene, die fr die
ribosomale RNA codieren).
Auerdem unterscheiden sie sich in ihrer Sensitivitt gegenber dem Gift des Knollenbltterpilzes,
-Amanitin, das eukaryotische RNA-Polymerasen inhibiert. Diese wird als der IC50-Wert in
g/mL angegeben. Der IC50-Wert (IC inhibitory concentration; IC50 half-maximal
inhibitory concentration) ist jene Konzentration, bei der die Polymerase-Aktivitt, also die
Fhigkeit zu transkribieren, zu 50% inhibiert wird (Pol I: >1000 g/mL, Pol II: 0,01-0,05 g/mL,
Pol III: 10-25 g/mL).
Ein weiteres Mittel zur Unterscheidung der 3 Polymerasen ist der Bedarf zweiwertiger positiver
Ionen wie Mn2+ oder Mg2+. Es wurde festgestellt, dass die Polymerase II im Gegensatz zu Pol I und
III ein relativ hohes Mangan-zu-Magnesium-Verhltnis bevorzugt.
Im Moleklkomplex finden sich grundstzlich die gleichen Strukturelemente wie in der E. coliPolymerase.
Die RNA-Polymerase funktioniert nicht ohne zweiwertige Ionen, im katalytischen Zentrum ist vor
allem Mg2+ gebunden, wo es fr die Bindung der Ribonucleotidtriphosphate gebraucht wird, an
anderer Stelle werden Zn2+-Ionen bentigt, wobei der Grund dafr noch nicht bekannt ist, es scheint
aber essentiell zu sein, da die Polymerase ohne Zink nicht funktioniert.

Genexpression (Decker, Blsi)

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3. Vorlesung:
Promotoren in Eukaryotenzellen:
Ein Promoter enthlt generell eine Bindungsstelle fr eine RNA-Polymerase, einen
Transkriptionsstart und regulatorische Sequenzen, die ja nichts anderes sind als Bindungsstellen fr
regulatorische Proteine, also die Transkriptionsfaktoren auf der DNA.
Bei den Prokaryoten liegen diese Bindungsstellen in der Nhe des Transkriptionsstarts und es gibt
unter ihnen auch Flle, wo Transkriptionsfaktoren die DNA-Struktur so verndern, dass diese z.B.
gekrmmt wird, wodurch neue Proteinwechselwirkungen mglich werden. Dabei muss die
Bindungsstelle des Regulators nicht unbedingt so gelegen sein, dass der Regulator direkten Kontakt
mit der Polymerase aufnehmen knnte, das kann auch ber eine Krmmung der DNA
bewerkstelligt werden.
In eukaryotischen Zellen sind solche isolierten regulatorischen Bindungsstellen von Genen blich.
Je komplexer ein Organismus wird, desto komplexer werden auch die Promotoren von Genen, die
stark reguliert werden. Bereits bei Hefe gibt es einen Transkriptionsstart, wo die Polymerase bindet,
was den Promoter im eigentlichen Sinne darstellt, es gibt aber auch sogenannte proximale (=
benachbarte) Bindungsstellen, die noch relativ nah beim Transkriptionsstart liegen, und distale, also
relativ weit vom Transkriptionsstart entfernte Bindungsstellen fr Transkriptionsfaktoren, die
zusammen Ereignisse regulieren, die am Transkriptionsstart stattfinden.
Betrachtet man hher entwickelte Organismen, bei denen als Regulationsebene noch die
Kommunikation zwischen Zellen und Organen hinzukommt, sieht man, dass es sich dabei um ein
komplexes Kommunikationssystem handelt, was heit, dass die Information, die aus dieser
Kommunikation kommt, letztlich Genaktivitt beeinflussen muss. Dementsprechend ist es logisch,
dass die Promotoren von solchen Genen, die viele Kommunikationssignale integrieren und in eine
Genaktivitt, also eine vernderte Transkriptionsantwort, umsetzen mssen, ziemlich komplex sind
und dass sie viele proximale und distale Bindungsstellen fr Regulatoren enthalten knnen. Bei
Sugern und auch schon bei anderen Vertebraten kommt noch dazu, dass diese Regulationsstellen
gar nicht mehr alle oberhalb des Transkriptionsstarts liegen mssen, sie knnen z.B. auch in Introns
unterhalb des Transkriptionsstarts oder im 3'-Bereich des Gens, also dort, wo die codierende
Sequenz bereits beendet ist, liegen.
Es gibt also viele positionelle Mglichkeiten fr Transkriptionsfaktoren, um letztendlich auf das
Transkriptionsereignis, also dass die RNA-Polymerase bindet und sich in Bewegung setzt, Einfluss
zu nehmen.
Bei den Eukaryoten kommt auerdem noch die Komplexitt der drei unterschiedlichen
Polymerasen dazu.
Wie sehen die Promotoren fr diese 3 verschiedenen Polymerasen aus?
Fr die RNA-Polymerase I, die vor allem die ribosomalen RNAs synthetisiert, enthlt der
Promoter einen sogenannten Core-Promoter, der die Bindungsstelle fr die Polymerase enthlt, und
eine einzige Upstream Regulatory Sequence (URS). Es handelt sich also um einen relativ einfach
strukturierten Promoter.
Fr die RNA-Polymerase II, die die proteincodierenden mRNAs und damit die weitaus grte
Anzahl unterschiedlicher Gene und vor allem auch die Gene, die vorwiegend komplex reguliert
werden mssen, transkribiert, enthlt der Promoter neben der Polymerase-Bindungsstelle einige
proximale und distale regulatorische Sequenzen. Diese weit vom Transkriptionsstart entfernten
distalen regulatorischen Sequenzen werden auch als Enhancer der Transkription bezeichnet.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Was ist der Unterschied zwischen einem Enhancer und irgendeiner Bindungsstelle fr einen
Transkriptionsfaktor?
Es gibt eine Reihe von Transkriptionsfaktoren, die unmittelbar am Transkriptionsstart binden und
der RNA-Polymerase sozusagen den Weg zum Promoter weisen, es gibt aber auch solche, deren
Aufgabe nicht ist, der Polymerase durch physischen Kontakt bei der Bindung des Promoters zu
helfen, sie regulieren die Initiation der Transkription, also die Bindung der Polymerase, oder auch
das In-Bewegung-Setzen der Polymerase. Diese Regulatoren knnen nun proximal oder distal
binden, wobei es sich eingebrgert hat die distalen regulatorischen Bindungsstellen als Enhancer zu
bezeichnen, da dort Proteine binden, die auf irgendeine Weise das Transkriptionsereignis positiv
beeinflussen knnen, also positive Regulation darauf ausben. Es handelt sich dabei um eine
historische Bezeichnung, die Effekte der proximal bindenden Transkriptionsfaktoren unterscheiden
sich nicht zwangslufig von denen der an die Enhancer bindenden Faktoren.
Die RNA-Polymerase III hat nicht nur einen, sondern drei unterschiedliche Promotoren. Dabei
gibt es welche, die sehr hnlich aussehen wie die der Polymerase II, die also auch distale EnhancerElemente und proximale Bindungsstellen fr Regulatoren neben dem Transkriptionsstart selbst
enthalten. In vielen Fllen enthalten sie wie die Promotoren der Pol II auch eine TATA-Box, die
zwar nicht wie bei Prokaryoten im -10-Bereich des Transkriptionsstarts, aber durchaus in dessen
Nhe liegen.
Die Gene fr tRNAs bzw. eine 7S RNA (wichtig fr Translation) werden durch Promotoren
reguliert, die Bindungsstellen fr Transkriptionsfaktoren haben, die mitten im codierenden Bereich
liegen. Zustzlich existiert eine Upstream Regulatory Sequence (URS) oberhalb des
Transkriptionsstarts. Das gleiche gilt fr das 5S rRNA-Gen.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Methodik der Genexpression:


Woher wei man, ob ein Gen berhaupt reguliert wird?
Es gibt sogenannte Housekeeping genes, von denen man annimmt, dass sie nicht reguliert werden,
da ihre Produkte dauernd und in konstanten Mengen in der Zelle gebraucht werden. Dazu gehren
die Gene, die den Grund-Metabolismus garantieren, z.B. werden die wenigsten Enzyme, die in der
Glykolyse bentigt werden, auf Transkriptionsebene reguliert, sondern eher auf Ebene der
Enzymaktivitt, und solche, die essentielle strukturelle Komponenten codieren, z.B.
Cytoskelettproteine (Actin, Tubulin, etc.).
3 Fragen in der Genexpression:
Wird das betrachtete Gen berhaupt reguliert?
In welcher Situation wird es reguliert?
Wie stark wird es reguliert?
Das einfachste und historisch erste Verfahren, das sich weitgehend durchgesetzt hat, um die Menge
einer RNA zu bestimmen, ist der sogenannte Northern Blot. Das Verfahren wurde zwar
mittlerweile weitgehend durch nicht-radioaktive Verfahren verdrngt, ist aber nicht rein historisch.
Northern Blots bentigen eine radioaktive Detektionsmethode und werden deshalb heute nur noch
in speziellen Situationen angewandt, nmlich wenn andere Verfahren keine ausreichend quantitative
Aussage erlauben.
Grundstzliche Vorgehensweise: Es wird zunchst die gesamte zellulre RNA isoliert und meistens
auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Danach wird der Northern Blot durchgefhrt,
was bedeutet, dass die dann nach Gre aufgetrennten RNAs auf eine Nitrocellulosemembran
bertragen werden, so dass auf der Membran ein Abdruck des Agarosegels entsteht. Diese
Membran wird nun mit einer radioaktiv markierten genspezifischen Sonde, also einer radioaktiv
markierten zur gesuchten RNA komplementren Nukleinsure, inkubiert. Diese komplementre
Nukleinsure, die meistens aus DNA besteht, bindet nur an die eine gesuchte RNA, was dann
aufgrund der radioaktiven Markierung der Sonden durch Autoradiographie sichtbar gemacht werden
kann. Die Schwrzung des Photofilms ist umso strker, je mehr der gesuchten RNA in dem Gel fr
die Hybridisierungsreaktion mit der Sonde zur Verfgung stand, sie ist also der RNA-Menge in der
Zelle direkt proportional.
Wie werden Nukleinsuren radioaktiv markiert?
Das Enzym Polynucleotidkinase bertrgt die -Phosphatgruppe eines ATP-Molekls auf die 5'OH-Gruppe eines Polynucleotids. Handelt es sich bei dem bertragenen Phosphoratom um das
radioaktive 32P-Isotop, ist die Nukleinsure danach radioaktiv markiert.

In den meisten Fllen gibt es heutzutage eine Alternative zur radioaktiven Detektionsmethode,
nmlich die RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction). Dabei wird wieder die
zellulre RNA isoliert, diese wird dann aber reverser Transkription unterzogen, sie wird also in
cDNA umgeschrieben. Mit dieser cDNA fhrt man eine PCR mit genspezifischen Primern durch
Genexpression (Decker, Blsi)

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und trennt die amplifizierten Nukleinsuren wieder auf einem Agarosegel nach Gre auf. So
knnen mithilfe von Verdnnungsreihen die Expressionslevels unterschiedlicher Gene unmittelbar
anhand des Amplifikationsprodukts der PCR bestimmt werden.
Je mehr RNA in der Zelle vorhanden ist, desto strker wird letztendlich das Signal des PCRProdukts, so dass eine Art quantitative Bestimmung der RNA-Menge in der Zelle mglich ist.
Ein groes Problem dieses Verfahrens, weswegen es auch als semi-quantitativ bezeichnet wird, ist,
dass sich die PCR irgendwann erschpft, wenn die Nucleotide ausgehen oder die Polymerase
inaktiviert wird. Je nachdem mit welcher Menge an Nukleinsure die Reaktion begonnen wird,
desto schneller erschpft sie sich und es kommt zu einer Sttigung, bei Beginn mit einem Molekl
z.B. nach etwa 30 Cyclen, bis dorthin ist die Beziehung der Cyclenanzahl zur DNA-Menge linear,
die Produktmenge korreliert linear mit der Ausgangsmenge. Innerhalb dieses Bereichs ist die RTPCR auch tatschlich quantitativ.
Das Problem dabei ist, dass man sich nie sicher sein kann, ob man sich bei Abbruch der Reaktion
noch im linearen Bereich befindet oder nicht.
Um dieses Problem zu umgehen wurde die quantitative real-time RT-PCR entwickelt, die
mittlerweile fast universell fr solche Problemstellungen verwendet wird.
Hierbei geht man prinzipiell genauso vor wie bei einer normalen RT-PCR, der Unterschied ist, dass
es hier eine Maschine gibt, die bereits whrend der Vermehrung der cDNA in der PCR feststellen
kann wie viel Nukleinsure gebildet wurde und die Kurve anzeigen kann, von der man ablesen
kann, ob man sich noch im linearen Bereich befindet.
Dazu lagert die PCR-Maschine einen fluoreszierenden Farbstoff in die DNA ein, dessen
Fluoreszenz vom Gert gemessen wird. Je mehr DNA vorhanden ist, desto mehr Fluoreszenz wird
emittiert.
Charakteristische Werte bei der Auswertung sind die Lnge des linearen Bereichs und die
halbmaximale Menge der Nukleinsure (beides bezogen auf die Anzahl der PCR-Zyklen).
Dieses Verfahren ist fr eine berschaubare Anzahl von Genen gedacht (10-20 Gene), es gibt
heutzutage aber oft die Frage nach dem gesamten Transkriptionsprofil (= Transkriptom) einer Zelle
zu einem bestimmten Zeitpunkt oder unter bestimmten Umweltbedingungen. Dazu braucht man ein
Verfahren, mit der man die Levels aller RNAs in der Zelle gleichzeitig messen kann.
In solchen Fllen, wo das gesamte Transkriptom einer Zelle bestimmt werden soll, setzt man sehr
hufig DNA Microarrays ein.
Auf ein etwa 2x2 cm groes Trgermaterial sind in regelmigem Muster verschiedene Sonden
aufgebracht, die zu allen im untersuchten Organismus vorkommenden Genen komplementr sind.
An jeder Stelle kann also eine mRNA des Organismus hybridisiert werden. Die Hybridisierung
sorgt dafr, dass die entsprechende RNA an dieser Stelle des Trgermaterials festgehalten wird.
Das Verfahren, um festzustellen, ob eine RNA hybridisiert hat und idealerweise auch wie viel
davon, besteht darin, die RNA der Zelle mit bestimmten (unterschiedlichen) Fluoreszenzfarbstoffen
zu markieren.
Der Array kann in Hinblick auf vergleichende Analysen der Genexpression unter verschiedenen
Umwelteinflssen (z.B. unterschiedliche Nahrungsquellen) noch verbessert werden, indem
verschiedenfarbige Fluoreszenzfarbstoffe fr die unterschiedlichen Einflsse verwendet werden, um
die ursprngliche RNA der Zellen zu markieren. So knnen die Transkriptome mehrerer Zellen
simultan auf einem Genchip untersucht werden.
Sowohl die qualitative Auswertung, also die Zuordnung des Hybridisierungssignals zu dem
entsprechenden Gen des untersuchten Organismus, als auch die quantitative Auswertung, also die
Korrelation der Intensitt der Fluoreszenz mit der RNA-Menge, erfolgt dabei automatisch durch das
durchfhrende Gert.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Die Hybridisierungssignale aus einem solchen Experiment knnen dann in eine Heat map
umgeformt werden. Dazu werden zunchst die Gene entsprechend der Strke des
Hybridisierungssignals in Gruppen zusammengestellt, das nennt man Clusterbildung.
Zustzlich wird ein Farbcode eingesetzt, der die Expressionslevels der einzelnen Gene
widerspiegelt. So knnen Microarrays sehr einfach und schnell ausgewertet werden.
Dieses Verfahren spielt zum Beispiel in der Oncologie bei der Identifikation von Tumorzellen von
Metastasen eine Rolle, um deren Ursprung feststellen und dann die richtige Behandlungsmethode
einsetzen zu knnen. Dazu wurden Expressionsprofile von unterschiedlichen Tumorzellen erstellt,
mit denen das der unbekannten Probe verglichen werden konnte.

Es gibt aber noch eine andere bessere Methode solche Expressionsprofile zu erstellen. Dieses
Verfahren beruht auf der Mglichkeit zum sogenannten Massive Parallel Sequencing oder Deep
Sequencing von DNA.
Dazu wird sogenanntes technisches Pyrosequencing eingesetzt. Die Pyrosequenzierung zusammen
mit speziellen und hochkomplexen Detektionssystemen erlaubt es, gleichzeitig Millionen
unterschiedlicher DNA-Strnge zu sequenzieren, so dass man bei einem Sequenzierlauf, der einige
Stunden dauert, etwa 1 Gb an Information erhlt.
Das bedeutet, dass es heute nicht mehr unmglich ist, die Menge einer bestimmten RNA in der
Zelle einfach dadurch zu bestimmen, dass das gesamte Transkriptom sequenziert wird.
Dazu wird wieder die gesamte RNA-Menge der Zelle isoliert, in cDNA umgeschrieben und dann
sequenziert. So kann genau bestimmt werden, wie viele Molekle von jeder RNA vorhanden sind,
man erhlt also ein sehr genaues quantitatives Transkriptionsprofil einer Zelle in einer bestimmten
Situation. Dieses Verfahren wird als RNA-Seq bezeichnet.
Als nchstes stellt sich die Frage, ob die vernderte Expression eine Folge von
Transkriptionskontrolle ist.
Die eigentliche Transkriptionskontrolle reguliert die Transkriptionsrate, sie bestimmt also wie viel
RNA produziert wird.
Aber auch der Vorgang der Prozessierung der RNA, der erfolgt, um eine pre-mRNA in eine reife
Genexpression (Decker, Blsi)

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mRNA zu berfhren, der Transport aus dem Zellkern und die unterschiedliche Stabilitt der
verschiedenen Transkripte spielen in der Genregulation eine wichtige Rolle.
Die RNA-Menge in einer Zelle ist immer eine Konsequenz von Aufbau (Transkription) und Abbau.
Das heit, dass die in einer Zelle detektierte Steady-State-Menge (Gleichgewichtsmenge) einer
RNA nicht automatisch auch mit der Transkriptionsrate korrelieren muss.
Man braucht also ein Verfahren, um festzustellen, ob es sich bei der Regulation eines Gens
tatschlich um Transkriptionskontrolle handelt. Die bis jetzt beste und quantitativste Methode
dafr stellt der Nuclear Run-On Assay dar.
Dabei wird der Zellkern der zu untersuchenden Zelle isoliert und auf Eis gelegt, so dass die
Polymerasen, die gerade dabei waren ein Gen zu transkribieren, daran festfrieren und die
Transkription abgebrochen wird, die Polymerasen aber nicht von der DNA abfallen.
Die Transkriptionsrate eines Gens ist direkt damit korreliert, wie viele Polymerasen dieses Gen
gerade transkribieren, es kann also die nchste Initiation der Transkription schon erfolgen bevor die
vorige Polymerase das betreffende Gen fertig transkribiert hat. Je mehr Polymerasen nun
gleichzeitig an einem Gen sitzen und dieses transkribieren, desto hher ist die Transkriptionsrate.
Dann werden den Zellkernen radioaktive Nucleotide (in aller Regel 32P-markiertes UTP) zur
Verfgung gestellt und sie werden wieder aufgetaut. Daraufhin setzen die Polymerasen ihre
unterbrochene Transkription fort, bauen nun aber in die gebildete RNA radioaktives UTP ein. Je
hher die Transkriptionsrate, desto mehr Polymerasen sitzen auf dem betreffenden Gen und desto
mehr radioaktives UTP wird eingebaut. Dadurch erhlt man ein radioaktives Signal, das der
Transkriptionsrate proportional ist.
Dazu wird wieder ein Hybridisierungsverfahren mit (einigen wenigen) immobilisierten Sonden
(Macroarray) und im Anschluss Autoradiographie durchgefhrt.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Die nchsten Fragen: Worauf beruht die Transkriptionskontrolle? Wie sieht der Promoter aus? Was
fr Bindungsstellen besitzt er? Welche Transkriptionsfaktoren binden dort?
Dazu muss zunchst der Promoter isoliert werden.
Historisch wurde der Promoter aus sogenannten genomischen Genbanken oder -bibliotheken
isoliert. Diese genomischen Bibliotheken wurden erstellt, indem die gesamte zellulre DNA isoliert,
mit Restriktionsenzymen verdaut und in -Phagen vermehrt wurde.
Das Restriktionsenzym wird dabei in einer nicht zu hohen Konzentration zugegeben, so dass es
nicht bei jeder seiner Schnittstellen schneidet, sondern nur ungefhr alle 20.000 Basenpaare einmal.
Da die dadurch tatschlich geschnittenen Stellen nicht festgelegt sind, entstehen dabei viele etwa 20
kb lange berlappende DNA-Fragmente ( = partieller Restriktionsverdau).

Um mit diesen Fragmenten arbeiten zu knnen


mssen sie vermehrt werden, was dadurch
bewerkstelligt wurde, dass die DNA in -Phagen
eingebracht wurde. Im Genom des -Phagen gibt es
einen etwa 20 kb langen Bereich, der entfernt
werden kann, ohne die Vermehrungsfhigkeit des
Virus in E. coli einzuschrnken. Ersetzt man durch
homologe Rekombination diese 20 kb Phagen-DNA
durch jeweils ein Fragment der genomischen DNA,
erhlt man eine Bibliothek von -Phagen, von denen
jeder ein anderes 20 kb Genom-Fragment enthlt.
Diese -Phagen knnen nun auf einen E. coli-Rasen
aufgebracht werden und zwar in einer Menge, die
nicht den gesamten Rasen zerstrt, sondern klar
unterscheidbare Plaques liefert.
Diese
Plaques
enthalten die Phagen und mit
ihnen
die
eingebrachte genomische DNA.
Auf diesen E. coli-Rasen mit den Plaques wird eine
Nitrocellulose-Membran aufgebracht, es wird auf diesem Filter
ein Abdruck der Plaques generiert und damit wieder eine
radioaktive Hybridisierung durchgefhrt. Aufgrund der
Duplizierung der Verteilung der Plaques auf dem NitrocelluloseFilter kann dann leicht der Plaque identifiziert werden, bei dem
das gewnschte Hybridisierungssignal aufgetreten ist. Das
entsprechende Lysat, das die -Phagen mit dem gesuchten DNAFragment enthlt, wird schlielich isoliert.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Mittlerweile ist dieses relativ komplizierte Verfahren aber vollkommen obsolet.


Heute kann man dank der Existenz von sequenzierten Genomen ganz spezifisch nur genau das
DNA-Stck, das einen interessiert, amplifizieren, man muss dafr nur die Sequenz aus der
entsprechenden Datenbank heraussuchen, isoliert die genomische DNA und kann das gewnschte
Stck DNA gezielt mittels einer PCR vermehren, bei der man fr dieses DNA-Fragment spezifische
Primer designt.
Bei komplexen Promotoren, deren regulatorische Sequenzen ber mehrere Kilobasen verteilt sind,
kann diese Vorgehensweise aber nicht angewendet werden, da mit so langen Sequenzen keine PCR
mehr mglich ist.
Hier verwendet man Bacterial Artificial Chromosomes (BACs), in die groe DNA-Fragmente aus
Genomen eingebracht wurden.
Was ist ein Bacterial Artificial Chromosome?
In E. coli gibt es sogenannte F-Plasmide, die einen eigenen Origin of Replication besitzen, also
unabhngig vom bakteriellen Chromosom replizieren knnen. Die F-Plasmide sind im Vergleich zu
anderen in E. coli vorkommenden Plasmiden sehr gro und knnen dadurch auch groe Mengen
Fremd-DNA aufnehmen. Um ein Artificial Chromosome herzustellen wird das gesamte F-Plasmid
mit Ausnahme der fr die Replikation bentigten Sequenzen deletiert und durch groe genomische
Fragmente, die bis zu 300.000 Basenpaare lang sein knnen, ersetzt.
Es gibt Datenbanken, in denen ganze Genome in solchen Bacterial Artificial Chromosomes gelagert
werden.
Bei so groen Fragmenten versagen oft die Verfahren der klassischen genetischen Rekombination.
Dabei hat man normalerweise ein Plasmid, das als Vehikel fr die Vermehrung dient und das
Schnittstellen fr gezieltes Herausschneiden und Einbringen von DNA besitzt, wobei die beiden zu
verbindenden DNA-Molekle mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten werden, um
kompatible Enden zu erhalten, so dass eine Ligation mglich ist. Diese Konstrukte werden dann in
E.coli eingebracht und dort vermehrt.
Enthlt nun das BAC, in das man dieses klonierte Fragment einbringen mchte, nur eine
Schnittstelle fr das betreffende Restriktionsenzym, gibt es kein Problem, das BAC kann dort
einfach aufgeschnitten und das klonierte Fragment integriert werden.
In der Regel enthalten BACs aber allein aufgrund ihrer Gre mehrere Schnittstellen fr ein
Restriktionsenzym, wodurch das BAC von diesem vollstndig in kleine Stcke geschnitten wrde
und dadurch nicht mehr verwendbar wre.
Um dieses Problem zu umgehen, wurde Recombineering entwickelt. Recombineering bedeutet,
dass das DNA-Stck, das in das BAC eingebracht werden soll, nicht mehr klassisch ber
Restriktionsenzyme integriert wird, sondern durch eine Rekombinationsreaktion, nmlich durch
site-specific recombination.
Dazu wird das Insert, also das DNA-Stck, das in den BAC eingebracht werden soll, mittels PCR
amplifiziert. Dem Primer wird dabei eine Sequenz mitgegeben, die spter durch eine Recombinase
erkannt werden kann. Man erhlt also ein Stck DNA, das an beiden Enden Rekombinationssignale
trgt. Dieselben Rekombinationssignale werden in das BAC eingebracht. Werden diese beiden
DNA-Molekle zusammen mit geeigneten Recombinasen, die meist aus Bakterien stammen,
inkubiert, erkennen diese Recombinasen spezifisch die eingebrachten Rekombinationssignale und
sorgen dafr, dass das amplifizierte DNA-Stck in das BAC hineinrekombiniert wird. Da diese
Signale im BAC nur an einer Stelle vorkommen, kann die DNA auch tatschlich nur dort eingefgt
werden.
Dieses Verfahren erlaubt es, auch relativ groe DNAs zu manipulieren, die einer klassischen
Rekombinationstechnologie nicht mehr zugnglich sind.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Der nchste Schritt ist, sich zu vergewissern, dass das so amplifizierte Stck DNA auch tatschlich
den gesuchten Promoter enthlt.
Dazu kann man bei E. coli das Stck einfach sequenzieren und anhand der -10- und -35-Bereiche
relativ genau den Transkriptionsstart identifizieren, besonders bei Eukaryoten ist der
Transkriptionsstart aber weniger gut durch bestimmte Sequenzen definiert.
Fr diese Problemstellungen wurden bisher zwei Methoden entwickelt, Primer Extension und S1
Mapping.
Beide Verfahren stellen die Frage, ob eine DNA das zu einer mRNA komplementre 5'-Ende
enthlt. Das 5'-Ende der mRNA ist komplementr zum Transkriptionsstart.
Kann man nachweisen, dass die klonierte DNA die Komplementrsequenz des 5'-Endes der mRNA
enthlt, kann man sicher sein, dass es sich bei der isolierten Sequenz um den Promoter handelt.
Bei der Primer Extension wird ein Primer generiert, von dem man genau wei an welcher Stelle
des Plasmids mit der klonierten DNA die fr den Primer komplementre Sequenz liegt. Der Primer
wird aber nicht an dieses klonierte Plasmid hybridisiert, sondern an die entsprechende RNA. Dazu
Genexpression (Decker, Blsi)

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wird die gesamte zellulre RNA aus einer relevanten Zelle isoliert und mit dem Primer versetzt, der
dann an die komplementre RNA hybridisiert. Das wird so gemacht, dass der Primer nicht allzu
weit von der Stelle entfernt zu liegen kommt, an der man das 5'-Ende und damit den
Transkriptionsstart erwartet.
Nach Hybridisierung des Primers an die RNA wird Reverse Transcriptase zugegeben, die den
Primer idealerweise bis zum 5'-Ende des betreffenden Gens verlngert. Da der Primer auerdem
radioaktiv markiert wurde, erhlt man nach der Reversen Transkription ein radioaktives
Nukleinsure-Fragment, das der Lnge entspricht, die von dem Ansatz des Primers bis zum 5'-Ende
des Gens reicht.
Hat man die Lnge des Fragments, wei man genau, wie viel man upstream an die Primersequenz
anfgen muss, um an den Transkriptionsstart zu kommen.
Ein alternatives Verfahren zur Identifikation eines Promoters stellt das S1 Nuclease-Mapping dar.
Dabei wird das Fragment der klonierten DNA, von dem man vermutet, dass es den
Transkriptionsstart enthlt, isoliert, die beiden Strnge werden denaturiert und an die entsprechende
RNA der Zelle hybridisiert. So erhlt man ein Hybrid aus der S1-Probe, die man isoliert hat, und
der entsprechenden mRNA der Zelle.
Um jetzt nicht nur zu erfahren, ob ein Transkriptionsstart in der DNA-Sequenz vorhanden ist,
sondern auch wo er liegt, wird die S1-Endonuclease eingesetzt. Diese entfernt die berhngenden
einzelstrngigen Enden und lsst nur den doppelstrngigen Bereich brig. Die Lnge des
doppelstrngigen Bereichs entspricht dann genau der Lnge vom Anfang des DNA-Fragments bis
zum Transkriptionsstart.
Ist das Fragment radioaktiv markiert, kann man wieder das bliche Verfahren bestehend aus
Elektrophorese gefolgt von Autoradiographie durchfhren und erhlt so die Lnge des Fragments,
durch die man wieder genau wei wie weit der Transkriptionsstart von der radioaktiven Markierung
des Fragments entfernt liegt. Liegt dieser innerhalb des klonierten Fragments, wei man, dass in
diesem Fragment der Promoter bzw. der Transkriptionsstart liegt.
Man hat nun also einen Promoter auf einem DNA-Fragment, man wei aber nicht, wo sich die fr
den Promoter wichtigen Sequenzen befinden.
Wo sind Sequenzen, an die irgendwelche transkriptionellen Regulatoren binden?
Dazu braucht man zunchst ein Verfahren, das einem hilft, zu entscheiden, ob ein Promoter in der
klonierten DNA funktioniert oder nicht, nmlich den Reportergen-Assay.
Dabei wird der mittlerweile besttigte Promoter mit einem Gen, das einem erlaubt festzustellen, ob
der Promoter tatschlich funktioniert (= Reportergen), fusioniert. Je mehr dann von diesem
Genprodukt gebildet wird, desto besser funktioniert der Promoter.
Um die Promoter-Aktivitt zu messen, muss dieser natrlich erst zurck in eine Zelle gebracht
werden, die das betreffende Gen tatschlich transkribieren kann. Das wird mithilfe der transienten
Transfektion gemacht.
Kann die Zelle den Promoter tatschlich transkribieren, wird das Reportergen produziert, die Zelle
kann im Anschluss lysiert werden und man kann herausfinden wie viel von dem Genprodukt
entstanden ist.
Damit das einfach gemacht werden kann, muss das Genprodukt, das das Reportergen codiert, eines
sein, das in der Zelle, in der der Assay durchgefhrt wird, ursprnglich nicht vorkommt. Nimmt
man zum Beispiel ein glykolytisches Enzym als Reportergen, kann das Verfahren nicht
funktionieren, da dieses Enzym auch natrlicherweise in der Zelle vorkommt, was es natrlich
schwierig bis unmglich macht festzustellen, ob das Genprodukt vom klonierten DNA-Fragment
oder von der genomischen DNA der Zelle stammt.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Reportergene codieren also immer fr ein Enzym oder ein


anderes Genprodukt, das in der Zelle, in der der Assay
durchgefhrt wird, nicht von Haus aus vorkommt, beliebt sind
dabei irgendwelche Enzyme aus anderen Spezies, die im
verwendeten Organismus nicht exprimiert werden. Das
klassische Beispiel fr ein Reportergen ist die
Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) aus E. coli. Es ist
ein bei E. coli auf Resistenzplasmiden codiert, es ist ein
Enzym, das das Antibiotikum Chloramphenicol detoxifiziert,
indem es mithilfe von Acetyl-CoA eine Acetylgruppe an das
Chloramphenicol hngt, wodurch dieses inaktiviert wird.
Dieses Gen existiert in Sugerzellen natrlich nicht und kann
dort als Reportergen eingesetzt werden.
Gibt man nach Lyse der Zelle radioaktiv markiertes
Chloramphenicol und Acetyl-CoA zum Zellextrakt, wird das
Chloramphenicol in diesem Extrakt acetyliert und man kann
das
acetylierte
Chloramphenicol
durch
Dnnschichtchromatographie von dem nicht-acetylierten
Chloramphenicol
trennen.
Je
mehr
acetyliertes
Chloramphenicol dabei entsteht, desto aktiver ist der Promoter.
Dieses System ist aber mittlerweile auch obsolet.
Was muss ein Promoter besitzen, damit er aktiv ist? Wo befinden sich regulatorische Sequenzen?
Dazu wurde frher Promoter Bashing eingesetzt, wobei der
Promoter mithilfe von Enzymen in Stcke geschnitten wurde.
Jedes dieser Stcke, denen ein immer grer werdender Teil
des Promoters fehlt, wird wieder mit einem Reportergen
gemeinsam in ein Plasmid eingebracht und in E. coli
vermehrt. Dann wird dieses Konstrukt wieder mithilfe der
transienten Transfektion in einer geeigneten Zelle exprimiert
und die Aktivitt des Promoters analysiert. Man erhlt also
eine Serie von unterschiedlichen Plasmiden, die alle das
gleiche Reportergen enthalten, aber unterschiedlich groe
Stcke vom Promoter.
Unterzieht man diese Plasmide separat einem ReportergenAssay, kann man feststellen, wie viel und welche Teile vom
Promoter vorhanden sein mssen, damit dieser aktiv ist, also
in welchen Bereichen wichtige regulatorische Sequenzen
liegen ( = Deletionskartierung).
Heutzutage ist Luciferase aus Glhwrmchen ein sehr
beliebtes Reportergen, das in Sugerzellen auch nicht
vorkommt. Dazu wird dann das Substrat der Luciferase
zugegeben, Luciferase setzt es um, wobei Licht entsteht, das
direkt gemessen werden kann. Es handelt sich dabei also um
eine sehr einfache und unkomplizierte Methode.
Ein anderes beliebtes Verfahren greift auf das Green
Fluorescent Protein (GFP) als Reportergen zurck, das bei
Genexpression (Decker, Blsi)

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Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlnge grne Fluoreszenzstrahlung emittiert. Diese
Methode ist zwar weniger quantitativ als die mit Luciferase, kann dafr aber auch in lebenden
Zellen angewandt werden.
Eine sehr selten eingesetzte Methode ist die Verwendung der -Galactosidase als Reportergen, das
mit einer relativ einfachen Farbreaktion nachgewiesen werden kann, es ist aber dennoch
komplizierter als bei Luciferase, die heutzutage in der Regel die bevorzugte Wahl bei der Suche
nach einem Reportergen darstellt, es sei denn die Analyse soll in lebenden Zellen durchgefhrt
werden, dann benutzt man das GFP.
Mchte man ein Reportergen-Assay durchfhren, muss man das Konstrukt aus Promoter und
Reportergen in eine Zelle einbringen, in der man die Promoter-Aktivitt messen kann. Das gestaltet
sich bei Eukaryoten und vor allem bei Sugerzellen nicht so einfach wie bei E. coli, wo eine
klassische Transformation mit Heat shock ausreicht.
Der ursprngliche Weg, um Sugerzellen dazu zu zwingen, Fremd-DNA aufzunehmen, war eine
Calcium-Phosphat-Koprzipitation mit der DNA durchzufhren. Dabei wird zunchst ein
Calcium-haltiger Puffer zum Plasmid gegeben, in den dann langsam eine Phosphatlsung getropft
wird. Dadurch bilden sich kleine Calcium-Phosphat-Kristalle, die die DNA mit einschlieen. Gibt
man dieses Koprzipitat aus Calcium, Phosphat und DNA auf eine Zelle, nimmt sie diese kleinen
Kristalle und damit die DNA durch Endocytose auf.
Eine andere mgliche Methode ist die sogenannte Elektroporation. Dabei hat man einen
physiologischen Puffer, was bedeutet, dass man Zellen hineingeben kann, ohne dass diese gleich
platzen. In diesem Puffer befindet sich die DNA, die von den Zellen aufgenommen werden soll und
die Zellen selbst. Das Ganze wird in ein elektrisches Feld gebracht, das einen sehr kurzen, aber
relativ starken Strompuls erzeugt. Dadurch entstehen Poren in der Zellmembran, die sich wieder
schlieen, sobald das elektrische Feld weg ist, whrend der kurzen Zeit, wo diese Poren vorhanden
waren, kann aber DNA von auen in die Zelle gelangen. Diese Methode hat den Nachteil, dass
meistens relativ viele Zellen in dem elektrischen Feld sterben, so dass man nur relativ wenige
transfizierte Zellen erhlt.
Am hufigsten wird die sogenannte Lipofektion eingesetzt. Dabei werden kationische (positiv
geladene) Lipide verwendet, die einen Komplex mit der DNA bilden knnen, die man in die Zelle
bringen mchte, aber gleichzeitig auch mit der Zellmembran fusionieren knnen. Durch die Fusion
mit der Zellmembran kann die DNA nach innen in die Zelle gestlpt werden.
Infektion mit Viren ist auch eine mgliche Methode, man kann also die DNA, die in die Zelle
eingebracht werden soll, zunchst in einen viralen Vektor einbringen, daraus das Virus entstehen
lassen und dieses dann die Zelle infizieren lassen.
In Fllen, wo man sehen mchte wie einzelne Zellen auf die Transfektion mit Fremd-DNA
reagieren, kann man Mikroinjektion verwenden. Dabei hat man ein Mikroskop, einen sogenannten
Mikromanipulator, in den eine Pipette mit einer sehr fein ausgezogenen Spitze eingebracht wird.
Mit dieser Pipette wird nanoliterweise die zu transfizierende DNA aufgesaugt, die Pipette wird
mithilfe des Mikroskops vorsichtig in die Zelle manvriert und 1-2 nL der DNA-haltigen
Flssigkeit wird in die Zelle gebracht. Dieses Verfahren wird aber aufgrund seiner Komplexitt nur
verwendet, wenn festgestellt werden soll, wie einzelne Zellen auf die Transfektion reagieren.
Man unterscheidet beim Gentransfer in Sugerzellen zwei grundlegende Mglichkeiten.
Bei der transienten Transfektion befindet sich die transfizierte DNA nur vorbergehend in der
Genexpression (Decker, Blsi)

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Zelle, wird aber nicht mit dieser gemeinsam vermehrt, was bedeutet, dass das eingebrachte Plasmid
bei der Vermehrung der Zelle herausverdnnt wird.
Es gibt aber auch die Mglichkeit der stabilen Transfektion, die auf die sehr wenigen transfizierten
Zellen setzt, die das eingebrachte Plasmid in ihr Genom integrieren.
Mittlerweile gibt es Verfahren, die schon am Computer helfen knnen, wichtige regulatorische
Stellen zu finden und zwar durch das sogenannte Phylogenetic Footprinting. Das ist im Grunde
ein schneres Wort fr Sequenzvergleiche, bei denen man die Homologien von DNA-Sequenzen in
homologen Genen von evolutionr unterschiedlich distanten Organismen bestimmt. Die
evolutionre Distanz macht sich dabei dadurch bemerkbar, dass im Vergleich der Sequenzen
weniger Homologie anzeigende Peaks entstehen.
Auf DNA, die keine Funktion wahrnimmt, wirkt kein Selektionsdruck in der Evolution, was
bedeutet, dass mit der Diversifizierung der Organismen auch die DNA-Sequenzen diversifizieren.
Das bedeutet wiederum, dass die Abweichungen zwischen nicht-codierenden DNA-Sequenzen
proportional zu ihrer evolutionren Distanz ist.
Liegen dort aber wichtige regulatorische Sequenzen, wirkt Selektionsdruck darauf, um z.B. eine
Bindungsstelle fr ein Protein zu unterhalten, und es werden auch in nicht-codierenden Bereichen
die DNA-Sequenzen gleich bleiben.
Wo binden Transkriptionsfaktoren?
Dabei wird das sogenannte Footprinting-Verfahren
angewendet. Dazu wird das DNA-Fragment isoliert,
radioaktiv markiert und es wird ein limitierter DNaseVerdau durchgefhrt, so dass die DNase jedes Fragment
einmal schneidet und man eine Art Leiter von DNAFragmenten erhlt, die sich voneinander immer durch ein
Nucleotid unterscheiden. In einem parallelen Ansatz wird
die DNA vorher mit einem Kernextrakt gemischt, der die
wichtigsten Transkriptionsfaktoren enthlt, was bedeutet,
dass diese an ihre Bindungsstellen auf der DNA binden
und so diese Stellen vor dem Verdau durch die DNase
schtzen. Dort, wo die Bindungsstelle des Proteins ist,
entstehen
also
keine
Fragmente
und
bei
elektrophoretischer Auftrennung entstehen in diesen
Bereichen Lcher in den Banden, die als DNase
Footprint bezeichnet werden.

Ein wesentlich einfacheres Verfahren ist der sogenannte Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA). Dabei muss man schon wissen, wo die Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle ist, dann kann
man damit aber relativ leicht die Frage beantworten, ob der entsprechende Transkriptionsfaktor in
einer bestimmten Situation in der Zelle vorhanden ist bzw. wie viel davon vorhanden ist.
Man hat ein DNA-Fragment, auf dem man eine Bindungsstelle fr einen Transkriptionsfaktor schon
mittels Footprinting identifiziert hat. Davon synthetisiert man ein kleines DNA-Fragment, das
gerade diese Bindungsstelle umfasst, markiert es radioaktiv und mischt es wieder mit einem
Kernextrakt. Die Frage ist nun, wie viel von dem Transkriptionsfaktor, der dort bindet, in diesem
Kernextrakt vorhanden ist. Das DNA-Fragment wird also im berschuss zugegeben, so dass jeder
Transskriptionsfaktor, der an dieser Stelle bindet, auch ein solches Fragment findet. Dieses Gemisch
Genexpression (Decker, Blsi)

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wird im Anschluss wieder elektrophoretisch


aufgetrennt und zwar unter Bedingungen, unter
denen die gebildeten Protein-DNA-Komplexe
erhalten bleiben. Dadurch erhlt man zwei Banden:
eine, die dem freien DNA-Fragment entspricht, und
eine, die dem DNA-Protein-Komplex entspricht. Je
mehr Transkriptionsfaktor zu diesem Zeitpunkt im
Zellkern enthalten war, desto mehr Fragmente
werden von einem Transkriptionsfaktor gebunden.
ber die Relation der gebundenen zur freien DNA
kann dann eine quantitative Aussage ber die
Menge an Transkriptionsfaktor in der Zelle gemacht
werden.
Der Transkriptionsfaktor bewirkt dabei eine
nderung der Mobilitt des freien Fragments im
Gel, der Unterschied der Mobilitt zwischen freiem
DNA-Fragment und Protein-DNA-Komplex wird
als Mobility Shift bezeichnet. Dieser Mobility Shift
ist auerdem ein Charakteristikum fr den
Transkriptionsfaktor, der an das DNA-Fragment gebunden hat.
Will man genau wissen wie sich eine bestimmte Bindungsstelle in der Zelle verhlt, welche Base
dabei also wichtig ist und welche nicht, kann man auch eine saturierende Mutagenese
durchfhren. Dazu wird jede einzelne Base des Promoters mutiert und es wird z.B. mithilfe des
Reportergen-Assays getestet, ob er noch aktiv ist. So bekommt man ber den gesamten Bereich
Information, wo Nucleotide liegen, die fr die Bindung von Transkriptionsfaktoren wichtig sind.
Kombiniert mit EMSA kann man Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen also ganz genau
lokalisieren.
4. Vorlesung (17.04.2012):
Welche Transkriptionsfaktoren sind an der Regulation eines Gens beteiligt?
Man hat nun einen Promoter identifiziert und hinsichtlich seiner Bindungsstellen fr
Transkriptionsfaktoren analysiert, man hat also bisher nur Informationen auf DNA-Ebene
gesammelt, wei aber noch nicht, was an den bereits identifizierten Bindungsstellen bindet.
Der nchste Schritt ist nun die Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die dort binden und damit
die Genregulation bewerkstelligen.
Das wichtigste Verfahren dabei ist die Affinittschromatographie, da man sich hier die Kenntnis
der Bindungsstelle, also der DNA-Sequenz, an die der Transkriptionsfaktor bindet, zunutze macht,
um ihn aufzureinigen.
Dazu bereitet man einen Zellextrakt, in der Regel sogar ein Kernextrakt, vor und das von Zellen,
von denen man wei, zu welchem Zeitpunkt (unter welchen Bedingungen) der gesuchte
Transkriptionsfaktor mit hoher Wahrscheinlichkeit im Kern vorhanden ist. Dieser Zellextrakt wird
zunchst ber verschiedene sulenchromatographische Verfahren fr diesen Transkriptionsfaktor
angereichert. Dabei kommen positive (Affinitt der Sulenmatrix zu dem gesuchten Faktor) und
negative (Affinitt der Sulenmatrix zu allen enthaltenen Stoffen auer dem gesuchten Faktor)
Verfahren zum Einsatz. So erhlt man einen stark fr den gewnschten Transkriptionsfaktor
angereicherten Kernextrakt. Die Identifikation der richtigen Fraktion des Eluats der
Chromatographiesule kann durch Footprinting identifiziert werden.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Nach diesen Anreicherungsschritten wird noch eine DNA-Affinittschromatographie durchgefhrt.


Das bedeutet, dass eine Sulenmatrix (meist Sepharose = weitgehend inertes Trgermaterial)
verwendet wird, an die ein synthetisches doppelstrngiges Oligonucleotid, das die Bindungsstelle
fr den Transkriptionsfaktor enthlt, chemisch gekoppelt ist. Bei Auftragen des angereicherten
Kernextrakts bleibt das, was spezifisch an diese synthetische DNA bindet, an der Sule hngen und
man kann im Idealfall alles andere auswaschen. Fr die Wiedergewinnung des auf der Sule
gebundenen Transkriptionsfaktor wird unter vernderten Bedingungen eluiert und die richtige
Fraktion wird wieder mit der Footprinting-Methode identifiziert.
Fr die Identifikation des aufgereinigten Transkriptionsfaktors gibt es nun verschiedene
Mglichkeiten.
Man kann zum Beispiel einen Bereich des Transkriptionsfaktors
ansequenzieren, wenn man Glck hat ist das gefundene Protein eh
schon bekannt.
Ist es unbekannt, kann man eine cDNA-Klonierung durchfhren.
Dazu hat man wieder eine Genbank in -Phagen, die eine
vollstndig in cDNA umgeschriebene mRNA aus der Zelle enthlt,
aus der man den Transkriptionsfaktor aufgereinigt hat. Diese Phagen knnen nun auf einem E. coli-Zellrasen ausplattiert
werden, wodurch Plaques entstehen, die unter anderem auch
lysierte Phagen enthalten bzw. das, was die Zelle zur Explosion
gebracht hat, und damit auch die cDNA fr den entsprechenden
Transkriptionsfaktor.
Zur Identifikation des Plaques, der den gesuchten
Transkriptionsfaktor enthlt, gibt es wieder zwei Mglichkeiten.
Entweder injiziert man den gereinigten Transkriptionsfaktor in ein
Versuchstier und versucht so ein Antiserum zu gewinnen, das fr
diesen Transkriptionsfaktor spezifische Antikrper enthlt, mit
denen man den Faktor erkennen kann, oder man benutzt den
genetischen Code, um die Aminosuresequenz des Proteins
zurck in die DNA-Sequenz zu bersetzen. Dabei gibt es das
Problem, dass es Wobble-Basen gibt und dass es fr die meisten
Aminosuren mehrere dafr codierende Codons gibt, es ist aber
mglich. Aus der so erhaltenen DNA-Sequenz kann dann eine
radioaktiv markierte Sonde hergestellt werden, die ber eine
Hybridisierungsreaktion den Transkriptionsfaktor auf der
Agarplatte identifizieren kann.
Als nchstes kann man also den Phagen, der die cDNA des Transkriptionsfaktors enthlt, isolieren
und vermehren, die enthaltene cDNA extrahieren und sequenzieren. Dadurch erhlt man die
vollstndige Proteinsequenz des Transkriptionsfaktors.
Da es heute schon sequenzierte (annotierte) Genome gibt, ist dieses Verfahren aber mittlerweile
obsolet, weil durch diese Genomsequenzierungen bereits alle Proteinsequenzen bekannt sind. So
muss man heute das aufgereinigte Protein nur noch kurz ansequenzieren und kann die vollstndige
Sequenz dann in einer Datenbank suchen.
Nun hat man also einen Transkriptionsfaktor identifiziert, der an die Stelle bindet, von der man
wei, dass sie fr die Regulation des Gens wichtig ist. Jetzt muss man sicherstellen, dass es sich bei
diesem Protein tatschlich um den richtigen Transkriptionsfaktor handelt und nicht um ein Protein,
das zufllig ganz gut an die Bindungsstelle bindet.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Dabei gibt es wieder zwei Mglichkeiten.


Die erste ist die sogenannte In-Vitro-Transkription, wo eine Transkriptionsreaktion im
Reagenzglas durchgefhrt wird. Dazu braucht man zunchst einen Promoter. Dieser wird durch
mehrfache Hintereinanderschaltung der Bindungsstelle fr den Transkriptionsfaktor besonders
funktionstchtig gemacht. Auerdem wird noch ein Minimalpromoter, der eine TATA-Box und eine
RNA-Polymerase-Bindungsstelle enthlt, daran fusioniert.
Dieser Promoter wird zusammen mit Nucleotiden, von denen eines radioaktiv markiert ist, und
allem, was abgesehen von dem Transkriptionsfaktor sonst noch fr eine Transkriptionsreaktion
bentigt wird, in ein Reagenzglas gegeben. Dann wird untersucht, ob der gereinigte
Transkriptionsfaktor bei Zugabe zu dieser Mischung die Transkription des Promoters stimulieren
kann.
Die zweite wesentlich einfachere Methode ist Kotransfektion mit gekoppeltem ReportergenAssay. Reportergen-Assay bedeutet, dass der zu
untersuchende Promoter an ein Reportergen gekoppelt
wird, bei dem es sich um ein Gen handelt, dessen Produkt
in der Zelle, in der die Transkription gemessen werden soll,
nicht vorkommt. Dadurch kann man sich bei Detektion
dieses Genprodukts in der Zelle sicher sein, dass das Gen
von auen durch das Assay zugefhrt wurde. Das
bekannteste Reportergen ist das Luciferase-Gen aus
Glhwrmchen.
Bei der Kotransfektion kommt also ein Reportergen zum
Einsatz, das durch einen Promoter, der auch die
Bindungsstelle fr den aufgereinigten Transkriptionsfaktor
enthlt, reguliert werden soll. Dazu bringt man das
Reportergen in eine Zelle ein, gleichzeitig aber auch ein
Plasmid, das fr den gereinigten Transkriptionsfaktor
codiert. Bei diesem Plasmid handelt es sich um ein Expressionsplasmid, was bedeutet, dass es einen
Promoter enthlt, der in der Lage ist in der Zelle die Synthese der mRNA des enthaltenen Proteins
X zu stimulieren.
Bringt man diese beiden Plasmide zusammen in eine Zelle, produziert die Zelle das Protein X. Ist
nun dieses Protein X in der Lage, den anderen synthetischen Promoter zu stimulieren, wird es an die
darauf lokalisierte Bindungsstelle binden und dadurch die Synthese des Reportergens stimulieren.
Handelt es sich um einen falschen Transkriptionsfaktor oder einfach eine andere Art von Protein,
das diese Bindungsstelle bindet, kommt es nicht zur Expression des Reportergens.
Heutzutage ist der nchste Schritt die Durchfhrung sogenannter Loss-of-Function-Experimente.
Bisher hat man den Transkriptionsfaktor nur mithilfe von mehr oder weniger artifiziellen Methoden
identifiziert. Nun stellt sich die Frage, ob das von dem Protein X regulierte genomische Gen auch
tatschlich nicht mehr funktioniert, wenn man dafr sorgt, dass dieses Protein X in der Zelle nicht
mehr produziert wird. Es muss also noch der Beweis erbracht werden, dass X tatschlich auch an
der Regulation des Gens in seinem genomischen Kontext beteiligt ist.
Das kann durch Loss-of-Function von X bewerkstelligt werden, entweder durch Knock-down des
Gens durch siRNAs (RNAi) oder durch Knock-out des Gens. Dabei gewinnt man in aller Regel
Zellen von Musen, in denen das Gen fr Protein X deletiert wurde (= Gene Targeting).
Nun hat man den Transkriptionsfaktor X identifiziert und es wurde festgestellt, dass dieser
tatschlich das betreffende Gen reguliert.
Wie funktioniert dieser Transkriptionsfaktor? Wo in X sind die Teile, die ihn zu einem
Genexpression (Decker, Blsi)

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Transkriptionsfaktor machen?
Man fhrt also als nchstes eine StrukturFunktion-Analyse durch, bei der man fragt,
welche Strukturen des Proteins ihm seine
Funktion als Transkriptionsfaktor verleihen.
Dazu macht man sich zunutze, dass der
Transkriptionsfaktor
bereits
gencloniert
vorliegt. Dadurch kann man gezielt Deletionen
in die cDNA einfhren und erhlt so
verstmmelte (truncated) Proteine. Diese
deletierten cDNA-Mutationen knnen wieder
unter Kotransfektion in Zellen eingebracht
werden und man kann so die Funktion des
Transkriptionsfaktors
berprfen.
Die
Funktionsfhigkeit wird nach zweierlei Kriterien gemessen, zum einen anhand seiner Fhigkeit
seine spezifische Bindungsstelle auf dem Promoter zu erkennen und zu binden ( EMSA), zum
anderen anhand seiner Fhigkeit als Transkriptionsfaktor die Expression des betreffenden Gens zu
stimulieren ( Reportergen-Assay). Auf diese Weise kann man eine Kartierung durchfhren, die
es einem erlaubt Aussagen darber zu machen, wo in dem Protein funktionell wichtige Domnen
liegen.
Die Domne, die dafr verantwortlich ist, dass ein Transkriptionsfaktor nach seiner Bindung an die
DNA in der Lage ist ein Transkriptionsereignis zu regulieren, wird als die Transaktivierende
Domne (TAD) bezeichnet, die Domne, die fr die Bindung der DNA verantwortlich ist, nennt
man DNA-bindende Domne (DBD).
Durch solche Kartierungen von Transkriptionsfaktoren nach deren funktionellen Domnen konnte
festgestellt werden, dass es keine Regeln gibt, wo diese Domnen innerhalb des Proteins liegen.
Die letzte Frage, die es zu beantworten gibt, ist nun, mit welchen anderen Proteinen der
Transkriptionsfaktor interagiert.
Ein Transkriptionsfaktor muss ja immer auf irgendeine Weise die Aktivitt der Polymerase
verndern. Er kann z.B. die DNA-Bindung der RNA-Polymerase beeinflussen, er kann
beeinflussen, ob eine bereits an die DNA gebundene RNA-Polymerase anfngt zu transkribieren
oder auch deren Fhigkeit zur Elongation.
All diese Funktionen liegen nicht in dem einen Transkriptionsfaktor, er ist nur ein wichtiges
Strukturelement in einem groen Spielfeld, das insgesamt die Genexpression reguliert.
Man muss nun also diesen Transkriptionsfaktor irgendwie in den Kontext anderer Proteine und
Proteinkomplexe stellen, die einem letztlich ein Verstndnis darber vermitteln, wie er eigentlich
funktioniert.
Es gibt zwei grundlegende Verfahren zur Identifikation von interagierenden Proteinen.
Das erste, das heutzutage eigentlich kaum noch verwendet wird, ist das Yeast Two-Hybrid System
(Y2H-System). Das Ganze beruht darauf, dass in einen Hefestamm zunchst ein Gen des HistidinStoffwechsels als Reportergen eingebracht wird, das es den Hefezellen erlaubt, ohne Zugabe von
Histidin zum Medium zu berleben, sie sind dann also prototroph fr Histidin. Dieses Histidin-Gen
wird an einen Promoter fusioniert, der der Kontrolle eines Transkriptionsfaktors untersteht. Bei
Transkriptionsfaktoren wie GAL4, wo die funktionell wichtigen Domnen weit auseinander liegen,
knnen diese Teile des Proteins leicht voneinander getrennt werden. Diese Eigenschaft macht man
sich bei dem Y2H-System zunutze, man teilt das Gen in eine cDNA, die die TAD codiert, und eine
Genexpression (Decker, Blsi)

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cDNA, die die DBD enthlt. GAL4 funktioniert also nicht,


wenn nicht irgendjemand dafr sorgt, dass diese frei
flotierenden transaktivierenden und DNA-bindenden Domnen
miteinander interagieren knnen.
Dazu fusioniert man die DBD an eine sogenannte Bait-Domne
[bait Kder] und die TAD an eine sogenannte Fish-Domne. Wenn
nun auf Ebene der cDNA die TAD mit der Fish-Domne und die DBD mit der Bait-Domne
fusioniert ist, und Bait- und Fish-Domne miteinander interagieren, entsteht ein Hybrid, in dem die
DNA-bindende und die Transaktivierende Domne von GAL4 durch diese Interaktion
zusammengebracht werden und das Histidin-Gen kann exprimiert werden.
Wie findet man mit dem Y2H-System Interaktionspartner eines Transkriptionsfaktors?
Man setzt den zu untersuchenden Transkriptionsfaktor als BaitDomne ein, fusioniert ihn also mit der GAL4-DBD, und
verwendet das Protein, bei dem man eine Interaktion mit diesem
Transkriptionsfaktor vermutet, als Fish-Domne, fusioniert es
also mit der GAL4-TAD. Kommt es danach zur Expression des
Histidin-Gens in den Hefezellen, gab es eine Interaktion zwischen
den beiden Proteinen.
Diese Vorgehensweise wird verwendet, wenn schon mgliche
Kandidaten fr die Interaktion bekannt sind, die man gezielt
testen mchte.
Viel fter ist man allerdings in der Situation, dass man diese
mglichen Kandidaten gar nicht kennt. In diesem Fall verwendet
man den zu untersuchenden Transkriptionsfaktor wieder als BaitDomne, fusioniert dessen cDNA also wieder an die GAL4-DBD, verwendet dann aber als FishDomne nicht nur eine cDNA fr ein Protein, sondern man fusioniert eine ganze Bibliothek von
cDNAs an die GAL4-TAD und transformiert diese Konstrukte in Hefezellen. Dabei bringt man in
jeden Hefestamm das gleiche Bait-Hybridprotein, aber unterschiedliche Fish-Hybridproteine ein.
Lsst man diese Hefezellen dann auf Medium ohne Zugabe von Histidin wachsen, werden nur
solche Zellen wachsen, bei denen der richtige Fish an der Aktivierungsdomne hngt, wo also Fishund Bait-Domne miteinander interagieren. Aus den auf diesen Platten wachsenden Hefezellen
kann das Plasmid, das die Fish-Domne codiert, dann wieder isoliert werden und das Fish-Protein
kann ber Sequenzanalyse identifiziert werden.
Heutzutage wrde man in einer solchen Situation aber eher den proteomischen Ansatz
durchfhren. Dabei reinigt man zunchst einen Proteinkomplex auf, der den Transkriptionsfaktor
enthlt, was in der Regel dadurch bewerkstelligt wird, dass ein sogenannter Tag an den
Transkriptionsfaktor gehngt wird. Ein Tag ist eine Aminosuresequenz, die eine Domne bildet,
die dann besonders gut an irgendeinen bestimmten Stoff bindet. So hat man den zu untersuchenden
Transkriptionsfaktor an eine Domne fusioniert, die eine sehr effiziente Aufreinigung erlaubt. Man
kann dann also Proteinkomplexe aufreinigen, die den Transkriptionsfaktor enthalten. Die
Komponenten dieser Komplexe werden dann getrennt, idealerweise durch eine zweidimensionale
Gelelektrophorese.
Bei einer zweidimensionalen Gelelektrophorese erfolgt die Auftrennung der Proteine in zwei
Richtungen, in der einen Richtung nach dem isoelektrischen Punkt ( Isoelektrische Fokussierung)
und in der anderen Dimension nach ihrer Gre ( SDS-PAGE).
Die Isoelektrische Fokussierung (IEF) beruht darauf, dass Proteine in einem pH-Gradienten so
lange wandern, bis sie ihren sogenannten isoelektrischen Punkt (pI) erreichen. Der pI ist definiert
als der Punkt, bei dem Proteine ladungsneutral sind. Je nach pH-Wert dissoziieren H +-Ionen weg
Genexpression (Decker, Blsi)

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von den positiv geladenen Aminogruppen an den N-Termini oder binden an die negativ geladenen
Hydroxylgruppen an den C-Termini, so dass es einen pH-Wert gibt, bei dem die Moleklladung
genau ausgeglichen ist, dass also alle Hydroxylgruppen mit H + gesttigt sind, die Aminogruppen
aber noch keine Protonen aufgenommen haben.
Nach dieser 2D-Elektrophorese isoliert man die erhaltenen Proteine und fhrt einen Proteaseverdau
durch, in der Regel mit Trypsin (= Gemisch dreier Verdauungsenzyme, die im Dnndarm Proteine
zersetzen: Trypsin-1, -2 und -4). Dadurch erhlt man Peptide der einzelnen Proteine, deren Masse
man durch Massenspektrometrie bestimmt. Das Massenspektrometer trennt diese Peptide nach
ihrem Masse-Ladung-Verhltnis auf, so dass man einen sogenannten Fingerprint des Proteins erhlt,
gemessen an den Peptiden, die der Trypsinverdau erzeugt hat.
Da jedes Protein nach so einem Proteaseverdau mit Trypsin einen charakteristischen Fingerprint
zeigt, kann man den erhaltenen Fingerprint wieder ber bestimmte Datenbanken einem bestimmten
Protein zuordnen.

Transkriptionsfaktoren:
Was ist die einheitliche Grundstruktur eines Transkriptionsfaktors?
Ein Transkriptionsfaktor hat immer eine DNA-bindende Domne (DBD), da jeder
Transkriptionsfaktor an DNA binden knnen muss, und eine Transaktivierende Domne (TAD), die
den Teil des Transkriptionsfaktor darstellt, die es ihm erlaubt mit der brigen Maschinerie, die in die
Regulation von Transkriptionsereignissen involviert ist, zu kommunizieren.
Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass sowohl bei Prokaryoten als auch bei Eukaryoten die meisten
Transkriptionsfaktoren nicht als Monomere aktiv sind, sondern als Dimere. Das bedeutet, dass
Transkriptionsfaktoren in der Regel noch eine dritte funktionelle Domne besitzen, die
Genexpression (Decker, Blsi)

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Dimerisierungsdomne. Diese erlaubt es, entweder mit einem gleichartigen Partner (


Homodimer) oder mit einem anderen Protein ( Heterodimer) eine dimere Struktur zu bilden.
Betrachtet man Transkriptionsfaktoren global kann man zwei Arten unterscheiden, die sogenannten
basalen oder generellen Transkriptionsfaktoren und die eigentlichen Transkriptionsfaktoren.
Die basalen (generellen) Transkriptionsfaktoren (engl.: general transcription factors) heien
deshalb so, da sie im Gegensatz zu den eigentlichen Transkriptionsfaktoren nicht besonders
genspezifisch sind. Unter diesem Begriff werden also die Transkriptionsfaktoren zusammengefasst,
die man bei den allermeisten Genen braucht, um Genexpression regulieren zu knnen. Darunter
fallen die Transkriptionsfaktoren, die einen Initiationskomplex der Transkription bilden, die also in
der Lage sind, Polymerasebindung an einen Promoter in die Wege zu leiten.
Die eigentlichen Transkriptionsfaktoren weisen eben im Gegensatz zu den basalen eine Spezifitt
fr bestimmte Gengruppen auf, sie sind also nicht an der Regulation aller Gene beteiligt, sondern
nur an der Regulation bestimmter in aller Regel in einem physiologischen Kontext stehender
Gengruppen. Diese Transkriptionsfaktoren binden typischerweise an Bindungsstellen, die entweder
im Promoter-nahen Bereich liegen und deshalb Promoter-proximale Bindungsstellen genannt
werden, oder an solche weit entfernt vom Transkriptionsstart, dann spricht man von Promoterdistalen Bindungsstellen. Solche distalen Bindungsstellen sind in der Regel das, was man als
transkriptionelle Enhancer bezeichnet.
Was machen die eigentlichen Transkriptionsfaktoren?
Die generellen Transkriptionsfaktoren sind daran beteiligt, einen Komplex zu bilden, mit dessen
Hilfe man die RNA-Polymerase an einen Promoter binden kann.
Die eigentlichen Transkriptionsfaktoren beeinflussen entweder die Frequenz, mit der dieser
Initiationkomplex gebildet wird, oder sie beeinflussen die Rate, mit der eine bereits gebundene
RNA-Polymerase in der Lage ist, die Transkription tatschlich zu starten.
Klassifizierung von Transkriptionsfaktoren:
nach Struktur der DNA-bindenden Domne
nach Funktion und Zeitpunkt ihrer Aktivitt (konstitutiv oder konditionell aktiv)

Genexpression (Decker, Blsi)

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Funktionelle Klassifikation:
Ein Transkriptionsfaktor kann also entweder immer in der Zelle vorhanden sein, oder er kann nur zu
bestimmten Zeitpunkten der Entwicklung gebildet werden, ist dann aber aktiv, oder er wird zwar
immer gebildet, braucht aber ein bestimmtes Signal, um aktiv zu werden.
Strukturelle Klassifikation:
Die Basic region kommt immer in Zusammenhang mit einer Dimerisierungsdomne vor, die die
Leucine-Zipper- bzw. die Helix-Loop-Helix-Domne darstellt.
Bei dieser ersten Superklasse gibt es also zwei verschiedene Arten von Dimerisierungsdomnen,
den Leucine-Zipper und die Helix-Loop-Helix-Domne, in beiden Fllen ist die DNA-bindende
Domne aber eine sogenannte Basic Region.
Die Basic Region ist eine rein helikale Domne von Proteinen, die miteinander dimerisieren
mssen. Die Basic Region enthlt eine Reihe von Aminosuren, die bei physiologischem pH-Wert
positiv geladen sind. Das bedeutet, dass sie mit der bei physiologischem pH-Wert negativ geladenen
DNA gut interagieren kann, die Affinitt der Interaktion wird hier ganz wesentlich durch
elektrostatische Wechselwirkungen charakterisiert.
Die Dimerisierungsdomne ist z.B. der Leucine Zipper. Der Leucine Zipper ist ein ebenfalls
helikaler Bereich, der aber eine amphipathische Helix bildet.
Amphipathisch bedeutet, dass die Aminosuren in dieser Helix so
angeordnet sind, dass auf der einen Seite hydrophile Aminosurereste zu
liegen kommen und auf der anderen Seite der Helix hydrophobe
Aminosuren, klassischerweise Leucine. Das bedeutet, dass die
Dimerisierung dieser Proteine dadurch zustande kommt, dass die
hydrophoben Aminosuren, die auf der Innenseite der amphipathischen
Helix liegen, miteinander interagieren und zwar getrieben durch Entropie
( hydrophobe Wechselwirkungen).
Leucine Zipper-Proteine knnen sowohl Homodimere (2 gleiche Partner) als auch Heterodimere (2
unterschiedliche Partner) bilden, wenn die beteiligten Proteine kompatible Leucine ZipperDomnen besitzen.
Leucine Zipper sind eine Unterkategorie der Coiled-coil-Domnen. Das sind Domnen, bei denen
Helices Interaktionen mit anderen Helices bilden.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Die andere Mglichkeit ist sozusagen ein extensiveres Coiled-coil, das


aber auf dieselbe Art gebildet wird, die Helix-Loop-Helix-Proteine. Der
Name kommt daher, dass sie aus zwei Helices bestehen, die von einer
AS-Schlaufe (= Loop) getrennt werden. Als DNA-bindende Domne
dient wieder eine Basic Region. Auch hier interagieren bei Dimerisierung
die beiden Helices miteinander, im Bereich der Schlaufe kommt es zu
keiner Interaktion. Die Triebkraft ist die gleiche wie bei den Leucine
Zipper-Proteinen, nmlich dass die Helices amphipathisch sind und ber
hydrophobe Wechselwirkungen interagieren, hier ist die Interaktion aber
extensiver und durch eine Schlaufe unterbrochen.
Die nchste strukturelle Einheit der DNA-Bindung ist der sogenannte Zinkfinger. Der Zinkfinger
ist eine Struktur, die nicht nur bei Transkriptionsfaktoren als DBD gefunden werden kann,
Zinkfinger knnen auch einfach fr Proteininteraktionen verwendet werden. Bei
Transkriptionsfaktoren ist die Besonderheit, dass die Zinkfinger-Struktur an der Bindung der DNA
beteiligt ist.
Die Zinkfinger-Proteine stellen die grte Familie der eukaryotischen Proteine dar, es gibt mehr als
1000 Mitglieder mit den unterschiedlichsten Funktionen.
Es gibt zwei Arten von Zinkfingern, C2H2- und C4-Finger.
Bei den C2H2-Fingern sind zwei Cysteine und zwei Histidine wichtig fr die Bildung des Fingers,
bei den C4-Fingern sind es 4 Cysteine, die fr die Bildung des Fingers verantwortlich sind. Den
Finger zu bilden bedeutet immer, dass diese Aminosuren, also entweder das C2H2- oder das C4Modul ein Zinkatom komplexieren mssen.
Zu den Zinkfingerproteinen gehrt z.B. die Familie der Nuclear Hormone Receptors, das sind
Transkriptionsfaktoren, die dadurch aktiviert werden, dass sie einen Liganden binden, der entweder
von auen kommt (klassische Steroidhormone, z.B. Cortison) oder auch Liganden, die in der Zelle
selbst gebildet werden. Allgemein sind Nuclear Hormone Receptors solche, die durch einen
Liganden aktiviert werden.
Die Strukturelemente sind immer zwei -Faltblatt-Strukturen und eine Helix, wobei beim C2H2Finger die beiden Cysteine im Bereich der -Faltblatt-Strukturen liegen und die Histidine Teil der
Helix sind.
Der Finger wird dadurch gebildet, dass eine
Schlaufe zwischen den -Faltblatt-Strukturen und
der Helix entsteht, so dass die
-FaltblattStrukturen antiparallel angeordnet werden und der
-Helix gegenberstehen und dass die Histidine
und
Cysteine
gemeinsam
ein
Zinkatom
koordinieren knnen. Diese Koordination des
Zinkatoms hlt den Finger zusammen.
Es gibt auch einen Unterschied in der Hufigkeit zwischen C2H2- und C4-Fingern, C2H2Fingerproteine enthalten immer mindestens 3 Finger oder mehr und sind eine Ausnahme zu der
Regel, dass Transkriptionsfaktoren in der Regel als Dimere an die DNA binden.
Die Dimerisierung von Transkriptionsfaktoren erhht die Affinitt zur DNA, da das bedeutet, dass
es zwei DNA-bindende Domnen gibt, die an zwei Stellen an die DNA binden und so natrlich die
Affinitt des Faktors fr die DNA doppelt so hoch ist wie die eines monomeren Proteins.
Die als Monomer bindenden Zinkfingerproteine gleichen das dadurch aus, dass sie mehr als eine
DBD besitzen, so dass keine Notwendigkeit zur Dimerisierung mehr besteht.
Die C4-Fingerproteine besitzen grundstzlich zwei Finger und binden die DNA als Dimer.
Das Element des Zinkfingers, das tatschlich den Kontakt mit der DNA herstellt, ist die Helix, die
in die groe Furche der DNA hineinragt und die basenspezifischen Kontakte herstellt.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Die historisch erste DBD, die man kannte, ist die sogenannte Helix-TurnHelix-Struktur, die vor allem in vielen entwicklungsbiologisch wichtigen
Transkriptionsfaktoren vorkommt, dazu gehren z.B. Homodomnen,
Paired Box- oder Fork head- bzw. Winged helix-Strukturen.
Die Struktur besteht grundstzlich aus drei Helices, zwischen Helix 1 und 2 befindet sich
ein sogenannter -Turn, also eine Schlaufe, bei
der die Aminosuresequenz ihre Richtung
ndert. Diese beiden Helices kontaktieren dann
eine dritte Helix, die Helix 3, die die
eigentliche Recognition Helix darstellt, die sich also in die groe
Furche der DNA einlagert und die basenspezifischen Kontakte knpft.
Der N-Terminus dieser Struktur greift zustzlich von der anderen Seite
um die Helix herum und stellt auch auf der anderen Seite der Helix, in
der kleinen Furche der DNA, basenspezifische Kontakte her.
Zu guter Letzt gibt es noch die -Scaffoldproteine. Diese Proteine stellen eine Besonderheit dar, da
sie nicht wie die anderen Transkriptionsfaktoren hauptschlich die leichter zugngliche groe
Furche der DNA kontaktieren, sondern die kleine DNA-Furche.
Sie sind charakterisiert durch eine ausgedehnte -Faltblattstruktur der DBD, dazu gehren z.B.
Proteine der NF-B-Familie, die STAT-Proteine, das Antioncogen oder Tumorsuppressorgen p53
oder der generelle Transkriptionsfaktor TATA-binding Protein (TBP).
Transkriptionsfaktoren knnen aber auch anhand ihrer Dimerisierungsdomnen klassifiziert werden.
Da gibt es z.B. den Leucine Zipper, die Helix-Loop-Helix-Domne, die beide Beispiele fr Coiledcoil-Domnen sind.
Es gibt eine Familie von Transkriptionsfaktoren, nmlich die STAT-Proteine, die zur Dimerisierung
eine SH2-Domne benutzen. SH2-Domnen sind Proteinmodule, die in der Lage sind ber ein
bestimmtes kritisches Arginin an Phosphotyrosinreste von Partnerproteinen zu binden. Mit nicht
phosphoryliertem Tyrosin findet keine Interaktion statt.
Transaktivierende Domnen (TADs) knnen prinzipiell auch zur Klassifikation herangezogen
werden, das gestaltet sich aber schwierig, weil sie keine klar ausgeprgten Strukturen bilden. Sie
zeichnen sich in aller Regel vor allem dadurch aus, dass sie keine ausgeprgten Sekundrstrukturen
bilden und sind deshalb auch sehr schwer zu kristallisieren, da die Fhigkeit eines Proteins Kristalle
zu bilden, die man dann mittels Rntgenstrukturanalyse bestimmen kann, beruht darauf, dass stabile
Sekundrstrukturen gebildet werden, die man dann in den Kristallen wiederfindet.
In unterschiedlichen Transaktivierenden Domnen findet man aber Hufungen bestimmter
Aminosuren, wodurch diese Domnen gekennzeichnet sind:
Saure TADs (Glu, Asp)
Gln-reiche TADs
Pro-reiche TADs
Ser/Thr-reiche TADs
Der Unterschied zwischen diesen einzelnen Klassen an TADs ist, dass sie vermutlich
unterschiedliche Arten aufweisen, mit der Transkriptionsmaschinerie zu interagieren, also mit den
anderen Proteinen, die gebraucht werden, um das Transkriptionsereignis in Gang zu setzen.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Initiation der Transkription:


Bei Eukaryoten muss genau wie bei Bakterien das Transkriptionsereignis immer eine RNAPolymerase an einen Promoter binden. Dieses Binden der RNA-Polymerase an den Promoter wird
als Pr-Initiation oder Initiation bezeichnet, wobei die beiden Begriffe synonym verwendet
werden.
Dabei wird am Transkriptionsstart des Promoters ein Initiationskomplex aus generellen
Transkriptionsfaktoren, sogenannten Cofaktoren und der RNA-Polymerase gebildet. Dieser
Initiationskomplex ist Voraussetzung fr alle weiteren Schritte.
Der nchste Schritt ist die sogenannte Promoter Clearance, was bedeutet, dass der
Initiationskomplex bereits die DNA-Strnge im Bereich des Promoters getrennt hat, es liegt also
bereits die offene Promoterstruktur vor, und dass die RNA-Polymerase schon einige Nucleotide
synthetisiert hat, dann aber erst einmal pausiert. Dieses Losstottern der Transkription ohne gleich
kontinuierlich eine Elongation der Transkription zu betreiben, wird als Promoter Clearance
bezeichnet.
Danach folgt die eigentliche Elongationsphase, in der das Gen kontinuierlich transkribiert wird,
und danach die Terminationsphase, die bei Eukaryoten ganz anders abluft als bei Prokaryoten,
das Transkript wird aber im Zuge dessen von der RNA-Polymerase getrennt und die Polymerase
fllt irgendwann wieder vom Matrizenstrang ab.
Bei Bakterien kann man einfach durch die DNA-Sequenz schon Promotoren identifizieren, da sie
charakteristische -10- und -35-Bereiche besitzen, in denen man eine Anordnung von mehr oder
weniger immer gleichen Nucleotiden findet. Bei den Eukaryoten ist das schwieriger, da der -35Bereich, der ja bei den Prokaryoten die Bindungsstelle fr den -Faktor ist, wegfllt, weil es diesen
-Faktor bei Eukaryoten nicht gibt. Stattdessen gibt es hier einen komplexeren Initiationsbereich
um die Initiationsstelle selbst, wobei es mehrere Mglichkeiten gibt wie dieser Initiationsbereich
beschaffen sein kann.
Eine Mglichkeit ist das Vorhandensein einer TATA-Box wie bei Prokaryoten, nur dass diese bei
Eukaryoten nicht im -10-Bereich, sondern etwas weiter upstream, im Bereich von -26 bis -34, liegt.
Der Consensus hier lautet T A T A A/T A.
Vor allem in Sugergenen besitzt aber nur ein Teil der Promotoren eine TATA-Box, es existieren
Alternativen dafr, dass das erste Protein der Initiation, TFIID, gebunden wird. Die Bindung von
TFIID leitet die Bildung des Initiationskomplexes ein.
Das TFIID-Protein kann mit seiner Untereinheit TBP an die TATA-Box binden, aber auch an andere
Bindungsstellen, die dann Initiatorelement (Inr) oder TF IID Control Element I, II oder III (DCE I/II/III)
oder TFIID Promoter Element (DPE) heien. All das sind Elemente, die die Bindung von TF IID
vermitteln und somit die TATA-Box ersetzen knnen.
Auerdem gibt es an den Initiationsstellen Elemente mit dem Namen BRE, das sind
Bindungsstellen fr den generellen Transkriptionsfaktor des Initiationkomplexes TF IIB, weswegen
diese Elemente TFIIB Response Element (BRE) genannt werden.
Sequenzierung fhrt also vor allem bei Sugern nicht zu einer wirklich eindeutigen Bestimmung
eines Initiationsstarts.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Die tiefgestellte rmische Ziffer im Namen eines generellen Transkriptionsfaktors gibt an, fr
welche der drei RNA-Polymerasen der jeweilige Transkriptionsfaktor zustndig ist.
Diese generellen Transkriptionsfaktoren sind oft kleine Proteinkomplexe, TF IIA ist z.B. ein Dimer,
TFIIB ist ein Proteinkomplex, der ein sogenanntes TATA-binding Protein (TBP) enthlt, das ihm
erlaubt die TATA-Box zu erkennen, sofern es eine gibt, und 11 sogenannte TBP-associated Factors
(TAFs), TFIIH besteht aus 9 Untereinheiten.
Wie erfolgt die Bildung des Initiationskomplexes?
Das erste, das stattfinden muss, ist die Bindung von TFIID
an den Initiationsstart, dabei ist die TATA-Box nur eine
von mehreren Mglichkeiten TFIID an de Promoter zu
bringen.
Wenn TFIID an die TATA-Box bindet, tut er dies mithilfe
seiner Untereinheit TBP.
Das nchste, das gebunden werden muss, ist das TFIIA,
das die Bindung von TFIID an die DNA stabilisiert, dann
folgt TFIIB, der sozusagen die Brcke zur RNAPolymerase schlgt, da er auf der einen Seite mit TF IID
und auf der anderen Seite mit der RNA-Pol interagieren
kann.
An die RNA-Polymerase ist ein weiterer genereller
Transkriptionsfaktor permanent assoziiert, nmlich das
TFIIF. Wenn das gebunden ist, binden TFIIE und TFIIH,
was den Initiationskomplex komplettiert.
Welche
Funktion
haben
die
einzelnen
Transkriptionsfaktoren?
TFIID erkennt den Promoter, die mit TFIID assoziierten
TAFs haben die Funktion die Bindung von TF IID
regulierbar zu machen, sie kommunizieren mit
Transkriptionsfaktoren, die die TFIID-Bindung regulieren.
TBP hat noch eine weitere Funktion, es fhrt eine
Krmmung in die DNA ein,die offenbar wichtig fr die
Bindung der Polymerase ist.
TFIIB kontaktiert die Polymerase selbst und TF IIH phosphoryliert die carboxyterminale Domne
(CTD) der Polymerase, diese posttranslationale Modifikation der RNA-Polymerase II ist offenbar
ebenfalls ein wichtiger Bestandteil des Transkriptionszyklus.
Es gibt eine klar definierte Reihenfolge wie diese generellen oder basalen Transkriptionsfaktoren an
die DNA binden mssen.
Woher ist diese Reihenfolge und auch erstmal ihre Existenz bekannt?
Dafr wurde EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) eingesetzt. Dabei hat man ein kleines
Stck DNA, das einerseits radioaktiv markiert ist, um es durch Autoradiographie leicht sichtbar
machen zu knnen, und andererseits Bindungsstellen fr einen oder mehrere Transkriptionsfaktoren
enthlt. Dieses Stck DNA enthlt eine Transkriptionsinitiationsstelle, die man auch als minimaler
oder basaler Promoter bezeichnet. Ein solcher minimaler Promoter enthlt die Initiationsstelle und
den Teil, der bentigt wird, um den Initiationskomplex zu bilden.
Jedes Protein, das nun an diese Sonde bindet, erhht das Molekulargewicht und macht die Sonde in
der Gelelektrophorese langsamer. Der Unterschied zwischen der Migrationsweite der freien
ungebundenen Sonde und der der proteingebundenen Sonde wird als Electrophoretic Mobility Shift
Genexpression (Decker, Blsi)

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bezeichnet.
Durch einzelne Zugabe der verschiedenen aufgereinigten generellen Transkriptionsfaktoren konnte
festgestellt werden, dass nur TFIID wirklich zur Bindung an die freie Sonde gebracht werden konnte
und so weiter.

Wie sieht der gesamte Transkriptionszyklus aus?


Der Transkriptionszyklus ist auch ein Phosphorylierung/Dephosphorylierungszyklus fr die
Polymerase.
Es gibt eine Unterscheidung zwischen einer Erstinitiation eines Gens und einer Initiation, die
unmittelbar einer vorhergehenden folgt.
Nach der Assemblierung der generellen
Transkriptionsfaktoren,
der
RNAPolymerase und dem Mediatorkomplex
zum
(Pr-)Initiationskomplex
(Preinitiation Complex, PIC) kommt es zur
ffnung
des
Promoters
(Promoter
Melting),
also
zur
Bildung
der
Transcription Bubble, dann zur Promoter
Clearance und schlielich zur Elongation.
Nach der Elongation fllt die Polymerase
irgendwann wieder vom Template ab und
mchte dann neu initiieren. Wenn dieses
Gen aber gerade transkribiert wurde, muss
der Initiationskomplex nicht von ganz neuem gebildet werden, sondern ein Teil der
Initiationsfaktoren, nmlich TFIIA, D, E und H, bleibt hngen und die Reinitiation erfolgt so, dass
TFIIB an dieses sogenannte Scaffold oder Gerst bindet und sofort die Polymerase und damit TF IIF
rekrutieren kann. Die Reinitiation erfolgt also einfacher als die Neuinitiation.
Was bewirkt die Bindung von TFIID an den Promoter?
Das TBP besitzt eine perfekte Symmetrie, die auch dadurch angedeutet wird, dass dieses Protein
zwei DNA-bindende Stellen hat, die ebenfalls symmetrisch an die DNA binden. Diese Bindung
durch zwei -Scaffolds fhrt dazu, dass das TBP die DNA verkrmmt, was wichtig fr die
nachfolgenden Schritte der Initiation ist.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Der nchste Schritt ist die Bildung des TFIIB-TFIID-Komplexes. TFIIB ist in der Lage, das TBP
direkt zu kontaktieren, wodurch das TFIIB in den Initiationskomplex gebracht wird.
Die sogenannte Linker-Domne von TFIIB bindet dann die Rudder-Domne der Polymerase, die
spter bei der Trennung der Nucleotidstrnge wichtig ist, und der N-Terminus von TF IIB reicht bis
in das aktive Zentrum der Polymerase hinein.
Das TFIIB hilft jetzt im Zuge der Bildung des offenen Promoterkomplexes bei der Erkennung des
Transkriptionsstarts, weil die sogenannte Reader-Domne des TFIIBs in der Lage ist, diesen zu
erkennen und der Polymerase vermittelt, wo sie die DNA-Strnge trennen soll.
TFIIB wird dann wieder verdrngt, wenn die RNA-Polymerase anfngt zu transkribieren, da die
gebildete RNA das TFIIB aus dem aktiven Zentrum des Enzyms verdrngt, wodurch die Bindung
von TFIIB an die Polymerase allgemein so geschwcht wird, dass diese schlielich verloren geht.
TFIIB hat also eine sehr wichtige passive Funktion beim Rekrutieren der Polymerase und beim
Brckenschlag zwischen TBP und der Polymerase, andererseits aber auch eine aktive Funktion
beim Auffinden des Transkriptionsstarts und bei der Strangtrennung im Bereich des
Transkriptionsstarts.
Der Transkriptionszyklus ist auch ein Phosphorylierungszyklus. Das heit, die RNA-Polymerase
II existiert immer in zwei Formen bezogen auf ihren Phosphorylierungsstatus, nmlich in der
sogenannten II0-Form oder der IIA-Form. Die IIA-Form ist die nicht-phosphorylierte Form und
diejenige, die an der Initiation beteiligt ist.
Im Zuge der Initiation wird nun aber eine bestimmte Domne der RNA-Polymerase II, nmlich die
sogenannte carboxyterminale Domne (CTD), phosphoryliert. Das transkribierende Enzym ist
dann stark phosphoryliert und erst nach Beendigung der Transkription und dem Abfallen vom
Template findet eine Dephosphorylierung der Polymerase statt, so dass aus der II0-Form wieder die
IIA-Form gebildet wird, die dann wieder in der Lage ist, ein Initiationsereignis zu durchlaufen.
Fr diese Phosphorylierung sind zwei Proteinkomplexe verantwortlich, der erste ist einer, der selbst
ein genereller Transkriptionsfaktor ist, nmlich TFIIH. TFIIH enthlt also eine enzymatische
Aktivitt, nmlich die einer Proteinkinase, genauer gesagt einer Serin/Threonin-Kinase.
TFIIH existiert in zwei strukturell unterschiedlichen Formen, einer, die fr die Initiation der
Transkription bzw. die Promoter Clearance wichtig ist, und einer, die wichtig fr die DNAReparaturfunktion ist.
Den beiden Komplexen ist das sogenannte Core, also die zentrale Einheit, gemeinsam. Diese
zentrale Einheit besteht aus den Proteinen XPB und XPD sowie
4 weiteren nach ihrem Molekulargewicht benannten
Untereinheiten (p34, p44, p52, p62). Der Grund warum diese
so hervorgehoben werden ist, dass sie eine zweite wichtige
enzymatische Funktion bernehmen, die in diesem TFIIHKomplex beinhaltet ist, nmlich die einer DNA-Helicase, d.h.
TFIIH ist nicht nur fr die Phosphorylierung der RNAPolymerase, sondern durch seine Helicase-Funktion auch bei
der Strangtrennung im Initiationsbereich wichtig.
Das Core beinhaltet also die Helicase-Funktion, die sowohl bei
der Promoter Clearance als auch bei der DNA-Reparatur
bentigt wird, bei der Clearance braucht man aber auch die
Kinasefunktion, die spezifisch zum Core hinzukommt.
Diese Kinasefunktion liegt in zwei Proteinen, in einer Kinase,
die einer Zellzyklus-Kinase hnlich ist und deshalb CDK7 genannt wird und in dem diese
regulierenden Cyclin, dem Cyclin H.
Die Core-Untereinheit assoziiert mit der Kinasefunktion, um den Clearance-Komplex zu bilden.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Die Kinasefunktion besteht aus den drei Proteinen CDK7, Cyclin H und MAT1.
Wenn bei der Transkription eine Schdigung der DNA auftritt und die RNA-Polymerase deshalb
pausieren muss, bindet der TFIIH-Reparaturkomplex und hilft bei der Reparatur.
Man kann den Phosphorylierungszustand der RNAPolymerase an den polytnen Riesenchromosomen von
Drosophila mikroskopisch sichtbar machen. Dazu wurden die
Chromosomen mit zwei unterschiedlich fluoreszierenden
Antikrpern gefrbt, wovon einer nur das phosphorylierte
Enzym erkennt und der andere nur das nicht-phosphorylierte
Enzym.
Phosphorylierte
RNA-Polymerase
findet
sich vor allem in den
sogenannten Puffs der
Chromosomen. Puffs sind
die Bereiche, die stark
transkribiert werden. Das
nicht-phosphorylierte
Enzym ist mit Bereichen
assoziiert, wo es keine
ausgeprgten Puffs gibt,
d.h. es handelt sich dabei
vermutlich um eine eher
unspezifische Assoziation
mit der DNA.

5. Vorlesung (24.04.2012):
Die Initiation der Transkription ist derjenige Schritt, der am Transkriptionsstart einen Komplex
aufbaut, innerhalb dessen die RNA-Polymerase an den Promoter rekrutiert wird. Die Initiation geht
damit einher, dass zunchst eine Reihe von sogenannten generellen Transkriptionsfaktoren einen
solchen Komplex bilden. Zu diesem Komplex gehrt auch der generelle Transkriptionsfaktor TF IIH,
der unter anderem die Aufgabe hat, die RNA-Polymerase zu phosphorylieren.
Der Transkriptionszyklus ist auch ein Phosphorylierung/Dephosphorylierungszyklus, der zwischen
der IIA- und der II0-Form der Polymerase unterscheidet. Die phosphorylierte Form ist diejenige,
die elongiert, die Phosphorylierung geschieht im Rahmen der Initiation. Die RNA-Polymerase
bleibt phosphoryliert bis sie wieder vom DNA-Templatestrang abfllt und wird dann von der
Phosphatase FCP1 dephosphoryliert. Die dephosphorylierte Form kann den Transkriptionszyklus
wieder neu beginnen.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Ein Transkriptionsfaktor, der an der Phosphorylierung beteiligt ist, ist TF IIH, der aus einem Core
besteht, der an den Promoter bzw. an DNA bindet. Er kann zwei Zusatzmodule haben, eines, das als
Cyclin-dependent Kinase (CDK) 7 an der Initiation beteiligt ist und vom Cyclin H reguliert wird,
und ein alternatives Modul, das an der DNA-Reparatur beteiligt ist, wobei das Kinasemodul dann
durch andere Proteine ersetzt wird, die bei der DNA-Reparatur zum Einsatz kommen.
Bei der RNA-Polymerase gibt es von E. coli bis hin zu den Sugern die zwei groen
Untereinheiten, die bei E. coli und ' genannt werden und zusammen die wichtigen
Grundbausteine der Polymerase bilden, nmlich das katalytische Zentrum, die Stelle, wo die DNA
eingefdelt wird und die Stelle, wo die RNA gebildet und wieder aus dem Enzym herausgefhrt
wird.
Diese - und '-Untereinheiten sind in allen drei RNA-Polymerasen, die in Eukaryoten vorkommen,
sehr hnlich.
Allerdings hat die RNA-Polymerase II, also diejenige, die im Wesentlichen fr die Bildung von
mRNAs verantwortlich ist, an der '-Untereinheit eine sogenannte carboxyterminale Domne
(CTD), die aus dem Molekl herausragt. Diese ist wenig strukturiert und bildet wahrscheinlich eine
lang ausgedehnte Struktureinheit, die relativ leicht von auen zugnglich ist.
Betrachtet man die Aminosuresequenz dieser carboxyterminalen Domne, fllt auf, dass sie aus
Wiederholungen einer immer gleichen Aminosuresequenz besteht. Diese Sequenz besteht aus 7
Aminosuren, die sich also immer wieder wiederholen, bei Mensch und Maus besteht die CTD aus
insgesamt 52 Wiederholungen dieser kurzen Sequenz aus 7 Aminosuren, man spricht von einem
Heptad Repeat. Die Sequenz lautet Y S P T S P S, sie besteht also zu einem groen Teil (5/7) aus
den 3 Aminosuren, die phosphorylierbare Hydroxylgruppen tragen. Von diesen 5
phosphorylierbaren Aminosuren werden zwei tatschlich phosphoryliert, nmlich das Serin an
Position 2 und das Serin an Position 5.
Die Phosphorylierung ist nicht beliebig, je nachdem ob Serin 2 oder Serin 5 phosphoryliert werden,
gibt es unterschiedliche Konsequenzen fr den Transkriptionszyklus.

Dieser Heptad Repeat kann sich also bis zu 50-mal in der CTD wiederholen, d.h. wenn man z.B.
von einer am Serin 2 phosphorylierten CTD spricht existieren auch bis zu 50 phosphorylierte Serine
in dem Molekl, meist sind aber nicht alle entsprechenden Serine in allen Wiederholungen
phosphoryliert. Das gilt analog natrlich auch fr Serin 5.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Den beiden phosphorylierbaren Serinen sind unterschiedliche Phasen des Transkriptionszyklus


zugeordnet. Der Serin 5-Phosphorylierung wird die Phase, die als Promoter Escape bezeichnet
wird, zugeordnet, und Serin 2-Phosphorylierung die Elongation.
Serin 5-Phosphorylierung muss also schon stattgefunden haben, wenn die Polymerase anfngt sich
zu bewegen und die Promoter Clearance stattfindet, die Polymerase also etwa 50 Nucleotide
synthetisiert und dann pausiert.
Elongation bedeutet dann, dass dieses Pausieren der Polymerase nach 50 Nucleotiden aufgehoben
wird und die Polymerase in die Phase der Elongation bergeht.
Warum kommt es zu diesem Pausieren am Beginn der Transkription?
Das 5'-Ende der mRNA wird modifiziert, es wird dort ein sogenanntes Cap gebildet, es wird also
ein modifiziertes Guanin-Nucleotid angehngt. Dieses Cap ist wichtig fr die mRNA, da es das 5'Ende, das aus der Polymerase herausgefhrt wird, vor dem Abbau schtzt.
Bevor die Polymerase also beginnt zu elongieren, stellt sie sicher, dass das 5'-Ende der mRNA in
Ordnung ist. Da es ein relativ komplexer chemischer Vorgang ist, der zu der Cap-Bildung fhrt,
muss die RNA-Polymerase erst einmal stehenbleiben und warten bis das Cap fertig angehngt ist.
Ein wesentlicher Sinn dieses Pausierens ist also, dass in dieser Zeit die Capping-Reaktion
durchgefhrt werden kann.
Die Capping-Reaktion ist ein biochemischer Prozess, der mehrere Enzyme bentigt.
Woher wissen diese Enzyme, wo sie wirken sollen?
Die Serin 5-Phosphorylierung ist fr diese Enzyme der Capping-Reaktion ein Signal, dass sie an die
CTD binden und sozusagen warten sollen, bis das 5'-Ende der mRNA aus der Polymerase
herauskommt, um es dann entsprechend zu modifizieren.
Die CTD der RNA-Polymerase II ist also eine Art Plattform fr das Binden von Proteinen, die fr
die Prozessierung des Transkripts gebraucht werden.
Die primre mRNA enthlt Introns, die zumindest teilweise bereits whrend der Transkription
gesplicet werden. Eine andere Funktion dieser Plattform ist also auch das Binden der Proteine, die
mit diesem Splicing zu tun haben.
Ist das Ende der Transkription, also das Ende des Leserahmens erreicht, kommt irgendwann ein
Signal, dass das 3'-Ende gebildet werden soll und die RNA die Polymerase verlassen soll. Dazu
braucht man dann wieder Enzyme, die mit der Bildung des 3'-Endes des Transkripts betraut sind.
Fr all diese Proteine ist die carboxyterminale Domne eine Plattform. Der
Phosphorylierungszustand der CTD bestimmt, welche dieser Faktoren wann an die Polymerase
binden sollen, um ihre entsprechenden Funktionen auszuben.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Die Polymerase II wurde mittels TFIIB an den Transkriptionsstart gebunden, es wurde also der
TFIID/A/B-Komplex gebildet. Als nchstes kommt TFIIH dazu, das die CDK7 enthlt, die durch
das Cyclin H reguliert wird. CDK7 nimmt die erste Phosphorylierung vor, nmlich am Serin 5, was
das Signal fr die Assoziation von Capping-Komplexen und in geringerem Mae fr die
Assoziation von Komplexen, die mit der Elongation zu tun haben, also dann spter bewirken sollen,
dass das Pausieren am Transkriptionsstart beendet werden soll.
Die Serin 5-phosphorylierte RNA-Polymerase kann nun die Promoter Clearance vornehmen, es
wird also das 5'-Ende der mRNA gebildet und sie kommt aus der Polymerase heraus, wird durch die
Capping-Komplexe erkannt und die Capping-Reaktion kann durchgefhrt werden. Whrenddessen
pausiert die Polymerase.
Wenn die Capping-Reaktion durchgefhrt ist, assoziiert die nchste Proteinkinase, nmlich der
Proteinkomplex pTEFb (TEF Transcription Elongation Factor). Dieser enthlt wiederum ein
Modul aus einer Zellzyklus-hnlichen Kinase, die CDK9, die auch durch ein Cyclin, das Cyclin T,
reguliert wird. Die CDK9 phosphoryliert das Serin 2, die Polymerase ist nun an Ser-5 und Ser-2
phosphoryliert, kann dadurch Splicing-Komplexe binden und dafr sorgen, dass die Polymerase
elongieren kann und schon whrend der Elongation Transkript-Splicing und am Schluss auch
Transkript-Termination stattfinden kann.

PTEFb phosphoryliert nicht nur das Ser-2 der Polymerase, sondern auch die Proteine, die die RNAPolymerase zum Pausieren zwingen, die also einen Elongationsblock bilden, und das sind DSIF
und NELF, wobei DSIF mit einer zweiten Untereinheit, SPT5, assoziiert ist.
PTEFb muss also zwei Dinge bewerkstelligen, es muss Serin 5 phosphorylieren, damit Transkriptprozessierende Proteine gebunden werden knnen, und es muss auerdem dafr sorgen, dass der
Elongationsblock inaktiviert wird. Zweiteres macht CDK9, indem es NELF phosphoryliert,
Genexpression (Decker, Blsi)

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woraufhin dieses von der DNA verschwindet. DSIF bindet seinerseits an die Polymerase und
wandert einfach mit dieser mit.
Die Phosphorylierungen am Serin 5 werden im Laufe der Elongation immer mehr entfernt, so dass
die CTD dieser Polymerase am Schluss des Transkriptionszyklus berwiegend am Serin 2
phosphoryliert ist, strittig ist hier noch eine Phosphorylierung am Serin 7. In diesem Zustand kann
sie von den Proteinen, die am Prozessieren des 3'-Endes beteiligt sind, erkannt werden.
Die pTEFb-Kinase wird durch Transkriptionsfaktoren rekrutiert, sie stimuliert die Elongation durch
CTD-Phosphorylierung am Serin 2 und die Phosphorylierung der Proteine DSIF und NELF,
wodurch der Elongationsblock inaktiviert wird. Dieses Verlassen des Elongationsblocks ist dann
Voraussetzung fr kontinuierliche Elongation, zustzlich sorgt die Serin 2-Phosphorylierung fr die
Assoziation von allen mglichen Proteinen, die mit der Transkript-Prozessierung, aber auch mit der
Elongation korreliert sind.
Bildung des 5'-Caps:
Am 5'-Ende der mRNA sitzt natrlicherweise ein Triphosphat,
was das erste Nucleotid reprsentiert, bei dem es sich meist um
ein Adenin handelt.
Von diesem Triphosphat wird zunchst durch eine RNATriphosphatase das -Phosphat entfernt, woraufhin es zu einer
nucleophilen Attacke des -Phosphats der mRNA an das Phosphat eines freien Guanin-Nucleotids kommt. Diese
Reaktion wird durch die Guanylyl-Transferase katalysiert.
Zuletzt wird durch eine Methyl-Transferase das angefgte
Guanin an Position 7 methyliert, so dass schlussendlich ein 7Methylguanin
ber
eine
eigentlich
atypische
Phosphotriesterbindung an das 5'-Ende der mRNA gebunden
ist. Diese Struktur kann von RNAsen nicht gespalten werden,
man erhlt also einen Schutz gegen den 5'3'-Abbau der
mRNA.

Was ist die Aufgabe von Elongationsfaktoren?


Sie sind wichtig dafr, dass die RNA-Polymerase relativ kontinuierlich transkribieren kann. Nicht
jede DNA-Sequenz ist gleich leicht transkribierbar, bei Sequenzen mit vielen A-T-Paarungen kann
es z.B. manchmal aufgrund der geringeren Stabilitt des DNA-RNA-Hybrids zu Problemen
kommen, weil die RNA-Polymerase dann eine Backtracking-Reaktion wie beim Proofreading
durchfhrt, also einige Schritte rckwrts geht. Sie braucht dann an dieser Stelle
Elongationsfaktoren, die ihr darber hinweghelfen.
Einer dieser Elongationsfaktoren ist TFIIS, der direkt an die Polymerase bindet und einen langen
Fortsatz besitzt, der bis zum katalytischen Zentrum reicht und dort mit der RNA interagieren und so
dafr sorgen kann, dass diese Backtracking-Reaktion der RNA-Polymerase gestoppt wird. Auf
diese Weise sorgt TFIIS dafr, dass DNA-Sequenzen, aus denen ein relativ instabiles DNA-RNAHybrid resultiert, trotzdem transkribiert werden knnen, und dass das exzessive Backtracking der
Polymerase verhindert wird.
Die zweite Funktion von TFIIS ist, dass es beim Proofreading hilft, indem es die RNAse-Aktivitt
der Polymerase und dadurch das Hydrolytic Editing stimuliert. Gibt es Mismatches im Bereich des
Backtracking, stimuliert TFIIS also auch den Abbau der Nucleotide an dieser Stelle und
Genexpression (Decker, Blsi)

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entsprechend die Neusynthese von richtigen Nucleotiden.


Das Homolog in E. coli ist das GreB-Protein, das im Grunde sehr hnlich aussieht.
Es gibt aber auch Elongationsfaktoren, deren Aufgabe hauptschlich darin besteht, der RNAPolymerase zu erlauben, nucleosomale DNA zu transkribieren.
DNA liegt an den meisten Stellen nicht einfach als nackte Doppelhelix vorliegt, sondern es gibt in
den Bereichen, wo DNA transkribiert wird, in den meisten Fllen eine nucleosomale Struktur.
Die DNA ist also um Nucleosomen gewickelt, was ein Problem darstellt, da die DNA dort nicht
transkribiert werden kann, ohne dass man sie zumindest ein bisschen von den Nucleosomen
wegbewegt.
Dazu gibt es den Transkriptions-/Elongationsfaktor FACT, der aus den zwei Proteinen SSRP1 und
Spt16 besteht und dessen Aufgabe darin
besteht, einen Teil des Nucleosoms,
nmlich ein H2A/H2B-Dimer, zu entfernen.
Das fhrt dazu, dass die DNA ein bisschen
vom Nucleosom entfernt wird und zwar so
weit, dass die RNA-Polymerase diese DNA
transkribieren kann. Ist der entsprechende
Bereich transkribiert, wird das H2A/H2BDimer wieder eingefgt und das Nucleosom
ist wieder intakt. Das Nucleosom wird also
nicht wie bisher angenommen vollstndig
disassembliert, sondern nur teilweise und
zwar so, dass es danach leicht wieder
repariert werden kann.
Termination der Transkription:
Die Polymerase ist am Ende des Transkriptionszyklus
hauptschlich Ser-2-phosphoryliert, was die Assoziation der
Terminationsfaktoren CstF und CPSF erlaubt. Diese sitzen
an der CTD und warten bis das 3'-Ende der mRNA erscheint,
das sie daran erkennen, dass es ein sogenanntes
Polyadenylierungssignal enthlt.
In Eukaryotenzellen wird das 3'-Ende der mRNA
polyadenyliert, d.h. es wird eine Poly-A-Sequenz angehngt.
Diese ist nicht in der DNA codiert, sondern sie wird erst
nach der Transkription durch eine Poly-A-Polymerase
(PAP) angehngt. Damit diese Poly-A-Polymerase aktiv
werden kann, muss das 3'-Ende geschnitten werden.
CstF und CPSF erkennen das Polyadenylierungssignal,
werden von der CTD auf diese Sequenz transferiert und
schneiden das 3'-Ende ab. Dieses freie 3'-Ende kann nun von
der Poly-A-Polymerase erkannt werden und sie fgt die
Poly-A-Sequenz an, die 100-300 Nucleotide lang ist. Die
Lnge der Poly-A-Sequenz variiert in den verschiedenen
Transkripten.
Die Funktion dieser Polyadenylierung liegt auch im Schutz
des 3'-Endes durch RNAsen.

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Ribosomale RNAs, die durch RNA-Polymerase I transkribiert werden, werden eigentlich


kontinuierlich produziert, hier gibt es wenig Regulation. Das gleiche gilt fr die kleinen RNAs, die
fr das Splicing gebraucht werden, und die 5S rRNA, die von der RNA-Polymerase III transkribiert
werden.
Die Promotoren, die durch RNA-Polymerase I erkannt werden, bestehen aus zwei Elementen, dem
sogenannten Core-Promoter, der sich beim Transkriptionsstart befindet, und einem Upstream Core
Element (UCE), das ungefhr 100 Basenpaare oberhalb des Transkriptionsstarts liegt.
An diese UCE-Sequenz bindet der Proteinkomplex UBF
(Upstream Binding Factor), der nun den SL1-Komplex
an den Transkriptionsstart rekrutiert, der sozusagen fr
TFIID steht und mit diesem die Untereinheit des TATABinding Protein (TBP) gemeinsam hat. Der Promoter der
von RNA-Polymerase I transkribierten Gene enthlt aber
keine TATA-Box, das TBP hat hier nicht die Funktion eine
TATA-Sequenz zu erkennen, sondern vermutlich
strukturelle Funktionen, es knnte z.B. sein, dass es bei der Krmmung der DNA mithilft oder auch
andere Funktionen.
Der SL1-Komplex rekrutiert dann die RNA-Polymerase.
Die RNA-Polymerase III-abhngigen Promotoren enthalten wichtige Bindungsstellen, die fr die
Initiation bentigt werden, unterhalb des Transkriptionsstarts, mitten in der codierenden Sequenz
(umfasst auch Introns und regulatorische Sequenzen!).
Es gibt zwei Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, Box A
und Box B. Der Transkriptionsfaktor TFIIIC, der aus
generellen Transkriptionsfaktoren besteht, erkennt diese Box
A- und Box B-Sequenzen, bindet mitten in der codierenden
Sequenz, rekrutiert aber einen weiteren generellen
Transkriptionsfaktor, TFIIIB. TFIIIB enthlt wieder eine TBPUntereinheit, das auch hier wieder meistens nicht die
Funktion hat eine TATA-Box zu erkennen.
TFIIIC verlsst den Promoter, nachdem TF IIIB gebunden hat, da es ja sonst der Polymerase im Weg
stehen wrde, TFIIIB rekrutiert die Polymerase und die Transkription kann beginnen.
Wie beeinflussen Transkriptionsfaktoren die Initiation, also alle Vorgnge bis hin zur Elongation?
Die Initiation besteht eigentlich aus zwei Schritten:
Bildung des Initiationskomplexes, Rekrutierung der Polymerase, Phosphorylierung an Ser-5
und Clearance bis ungefhr 50 Nucleotide nach dem Transkriptionsstart
Rekrutierung von pTEFb, Phosphorylierung an Ser-2, Phosphorylierung von NELF
Fr Schritt 1 muss ein Initiationskomplex gebildet werden, der auch das TFIIH enthlt.
Beide Schritte knnen durch Transkriptionsfaktoren beeinflusst werden, sie knnen dafr sorgen,
dass der IC (Initiation Complex) gebildet ( Aktivatoren) oder auch verhindert wird (
Repressoren) und sie knnen dafr sorgen, dass z.B. durch die Rekrutierung des pTEFb-Komplexes
die Elongation gefrdert wird.
Ist also die RNA-Polymerase bereits gebunden, was ja bei vielen Genen der Fall ist. Bei vielen
Genen wird nicht in erster Linie reguliert, dass die RNA-Polymerase an den Promoter bindet,
sondern dieser IC wird mehr oder weniger automatisch gebildet. Was dann reguliert wird ist der
Schritt zur Elongation, also die Ser-2-Phosphorylierung und die Aufhebung des Elongationsblocks.

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Wie nimmt ein Transkriptionsfaktor Einfluss auf die Elongation oder die Initiation?
Dabei gibt es verschiedene Mglichkeiten.
Er kann z.B. ganz direkt Kontakt mit Komponenten des IC aufnehmen und so die Bindung
des IC frdern oder verhindern.
Er kann auch andere Faktoren, die dann Cofaktoren oder Coaktivatoren genannt werden,
oder auch weitere Transkriptionsfaktoren dazu bentzen, Kontakt herzustellen. In diesem
Fall findet der entscheidende Kontakt mit der Elongations- oder Initiationsmaschinerie nicht
durch den Transkriptionsfaktor selbst statt, sondern ber Cofaktoren oder weitere
Transkriptionsfaktoren.
Es kann auch die CTD-Phosphorylierung und damit die Elongation beeinflusst werden.
Transkriptionsfaktoren knnen auerdem sehr indirekt auf diese Vorgnge Einfluss nehmen,
indem sie die Chromatinstruktur eines Promoters so verndern, dass dieses Chromatin
entweder
transkriptionsfreundlich
oder
transkriptionsunfreundlich
wird.
Transkriptionsaktivatoren
regulieren
es
zur
Transkriptionsfreundlichkeit,
Transkriptionsrepressoren zur Transkriptionsunfreundlichkeit.
Die Chromatinstruktur ist ein sehr wichtiger Spieler bei der Regulation der Transkription.
Es gibt Proteine, die vor allem dafr verantwortlich sind, dass Transkriptionsfaktoren mittelbar oder
unmittelbar die Initiation beeinflussen knnen. Einer dieser Komplexe, die mit
Transkriptionsfaktoren Kontakt aufnehmen knnen, ist der TFIID-Komplex. Dieser ist der erste
generelle Transkriptionsfaktor, der bei der Initiation an einen Promoter bindet, er stellt also so etwas
wie einen rate-limiting step (geschwindigkeitsbestimmenden Schritt) dar, was sich allgemein immer
fr Regulation anbietet.
Der TFIID-Komplex besteht aus der TBP-Untereinheit und den sogenannten TBP-associated factors
(TAFs).
Ein weiterer Komplex, der sich anbietet, um Kontakt zwischen Transkriptionsfaktoren und der
Polymerase herzustellen, ist der Mediatorkomplex.
TFIID enthlt also TBP und 13-14 TAFs (je nach vorliegender Form), die die Bindung an den
Promoter, die Bindung von TBP (und damit die Erkennung einer TATA-Box und die Krmmung der
DNA) und den Kontakt zu Transkriptionsfaktoren und Coaktivatoren regulieren. Auerdem sind sie
in der Lage, eine Chromatinmodifikation vorzunehmen, die fr die Transkription auch wichtig ist.
Die TAFs knnen unterschiedliche Transkriptionsfaktoren binden, die dadurch dann dafr sorgen,
dass TFIID an die DNA rekrutiert werden kann.
Es gibt 3 Mglichkeiten, wie TF IID die Bindung an die
Initiationsstelle vermitteln kann:
Eine TATA-Box wird von TBP erkannt und
gebunden
Initiatorelemente (Inr) werden durch TAF1
und TAF2 erkannt
TFIID Promoter Elements (DPEs) werden
durch TAF6 und TAF9 erkannt
TFIID kann also ber mehrere Untereinheiten die
Bindung an den Transkriptionsstart vermitteln, kann
durch viele unterschiedliche TAFs den Kontakt mit
Transkriptionsfaktoren vermitteln und kann durch die
Histon-Acetylase-Funktion von TAF4 auf die
Chromatinstruktur Einfluss nehmen.
Die komplexe Struktur mit den vielen Untereinheiten
bedeutet eben, dass nicht nur die eine Funktion, an
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DNA zu binden und die Initiationsstellen zu erkennen, wahrgenommen werden kann, sondern diese
Bindung dann auch noch davon abhngig gemacht werden kann, ob andere TAFs mit
Transkriptionsfaktoren, Cofaktoren oder Coaktivatoren interagieren.
Der Mediatorkomplex wird strukturell in eine Kopfstruktur, eine Mittelstruktur, eine
Schwanzstruktur und eine Kinasestruktur eingeteilt.
Genau wie TFIIH oder TFIIB enthlt er eine
Proteinkinase, kann also phosphorylieren und auch
hier handelt es sich um eine Cyclin-dependent
Kinase, CDK8, die durch das Cyclin C reguliert
wird. Es wird deshalb angenommen, dass er auch an
der Phosphorylierung der CTD der RNAPolymerase beteiligt ist, es ist aber bisher nicht klar,
wo er diese phosphoryliert und was das fr
Konsequenzen hat, bei manchen Genen bewirkt es
negative Regulation, bei anderen positive.
Generell sind aber die vielen MediatorUntereinheiten wie bei TFIID deswegen vorhanden,
weil sie den Kontakt zu sehr vielen
unterschiedlichen
Transkriptionsfaktoren
und
Cofaktoren und zur Polymerase aufbauen. Den
Kontakt zur RNA-Polymerase stellt z.B. Med17 her.
Bei einigen Untereinheiten ist schon geklrt, mit
welchen Transkriptionsfaktoren sie unmittelbar
Kontakt aufnehmen knnen.
Ein nucleosomaler Promoter wird zunchst von
Transkriptionsfaktoren erkannt und mithilfe von
Coaktivatoren die Nucleosomenstruktur verndert. An
diesem Punkt wird durch den direkten Kontakt mit den
Transkriptionsfaktoren der Mediator rekrutiert. Bei den
meisten Promotoren, deren Transkription stimuliert
werden soll, verschwindet jetzt das Kinasemodul des
Mediators und es bleibt nur der Core-Mediator PC2
brig. PC2 tritt in Kontakt mit der Polymerase und dem
Initiationskomplex, z.B. auch mit TFIIH. Es gibt hier
allgemein viele Interaktionen, die dazu fhren, dass der
Mediator den Kontakt zum Initiationskomplex herstellt.
Jetzt kann Elongation stattfinden, in dem Fall kme es
noch zu den Regulationsereignissen, die bentigt
werden, um den Elongationsblock aufzuheben. Nach der
Clearance verschwindet Mediator nicht unmittelbar vom
Promoter, sondern bleibt als Gerststruktur (Scaffold)
am Promoter hngen. Dieses Gerst sorgt dafr, dass das
zweite Initiationsereignis (Reinitiation) viel einfacher
und schneller stattfinden kann. Zu diesem Gerst
gehren neben dem Core-Mediator auerdem einige
generelle Transkriptionsfaktoren wie z.B. TFIID und
TFIIA.
Mediator muss nicht sofort zur Elongation fhren,
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sondern kann alternativ auch zunchst einmal nur zur Clearance fhren, dann wren noch weitere
Schritte ntig, um die Clearance in die Elongation zu berfhren.
In jedem Fall ist Mediator aber an der Rekrutierung der Polymerase beteiligt und bleibt nach der
Clearance Teil der Scaffold-Struktur am Promoter, die die Reinitiation erleichtert.
Die Funktion von Mediator ist also einerseits das Rekrutieren des Initiationskomplexes (IC) und der
RNA-Polymerase, andererseits aber auch eine Regulation der Cofaktoren, die die Histone
modifizieren.
Mediator muss nicht immer mit einem positiven Transkriptionsereignis korreliert sein, es gibt
Promotoren, wo Mediator darin involviert ist, die Enzyme REST und G9a zu rekrutieren, die durch
Methylierung von Histonen eine Chromatinstruktur erzeugen, die transkriptionsunfreundlich ist. In
diesem Fall ist Mediator also mit seinem Kinasemodul daran beteiligt, einen Promoter zu
reprimieren.
Je nachdem, welcher Mediatorkomplex vorhanden ist (nur Core-Mediator oder Mediator mit
Kinasemodul), kommt es zu unterschiedlichen Einflussnahmen auf die Transkription.
Der Core-Mediator PC2 stimuliert also die Bildung des Initiationskomplexes, aber auch der CoreKomplex muss nicht immer gleich beschaffen sein, die Untereinheitstruktur kann variieren. Je
nachdem wie diese Variation aussieht, knnen unterschiedliche Transkriptionsaktivatoren
kontaktiert werden.
Auch die Reihenfolge der Bindung ist nicht vollstndig geklrt, da es auch Flle gibt, wo Mediator
bereits an die RNA-Polymerase gebunden ist und dann im Komplex mit dieser an den Promoter
bindet.
Das Kinasemodul interagiert wahrscheinlich nicht mit der RNA-Polymerase, sehr oft ist die
Aufgabe dieses Moduls die Promoter Clearance zu inhibieren, in manchen Fllen ein repressives
Chromatin zu erzeugen, es gibt aber auch Flle, in denen das Kinasemodul mit positiven
Transkriptionsereignissen korreliert ist.
Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen knnen weit vom Transkriptionsstart entfernt liegen. Mediator
und TFIID helfen auch dabei DNA-Schleifen zu bilden, die es erlauben, dass die Bindungsstelle fr
den Transkriptionsfaktor mit Mediator und dem IC in Kontakt kommt.
Mediator ist also ein groer Integrator vieler Funktionen, nmlich RNA-Polymerase-Bindung,
Initiation und Elongation der Transkription, Kontakt zu Transkriptionsfaktoren, aber auch Kontakt
zu und Regulation von Enzymen, die die Chromatinstruktur verndern.
Der Einfluss von Transkriptionsfaktoren auf die Initiation oder Elongation kann also sehr direkt
sein, weil die Distanz ihrer Bindungsstellen durch die Schlaufenbildung der DNA keine Rolle spielt.
Nicht jeder Transkriptionsfaktor hat die Funktion mit Mediator oder TF IID zu interagieren, es gibt
auch Transkriptionsfaktoren, deren Funktion eher darin liegt, die Chromatinstruktur fr
Transkriptionsfaktoren vorzubereiten, die dann diese Funktionen des direkten Kontakts zur
Initiations- und Elongationsmaschinerie bernehmen.
Die dritte Funktion, die Transkriptionsfaktoren ausben knnen, ist die Beeinflussung der
Chromatinstruktur, sie helfen Proteinen zu binden, die die Nucleosomen modifizieren, also
chemisch verndern, oder diese verschieben, umlagern oder auflsen (Chromatin Remodelling).

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Die kompakteste Form der DNA im Zellkern ist die des


Metaphasenchromosoms. Das ist die Form, in der
Chromosomen transportiert und auf Tochterzellen aufgeteilt
werden, aber auch die passivste Form eines Chromosoms, also
die biologisch inaktivste.
Die aktivste Form ist die sogenannte 10 nm-Struktur
(bezogen auf den Durchmesser), dabei handelt es sich um die
Beads-on-a-string-Struktur, die DNA ist also nicht die
nackte Doppelhelix (das wre die 2 nm-Struktur), sondern die
Nucleosomen und die nackte DNA zwischen ihnen.
Diese Struktur kann dann noch kompakter werden und eine
sogenannte 30 nm-Struktur bilden.
Nackte DNA findet man nur in den sogenannten Linker- oder
Spacer-Bereichen zwischen den Nucleosomen der 10 nmStruktur.
Wickelt man die 30 nm-Struktur um eine Gerststruktur
(Chromosome Scaffold) kann auch diese noch kompakter
werden und eine 300 nm-Struktur bilden.
Die 10 nm-Struktur kann so verndert werden, dass sie
Transkriptionsereignisse entweder erlaubt oder unmglich
macht.
Um die Nucleosomen sind
ungefhr zwei Windungen an
DNA gewickelt, was genau 146 bp entspricht, dazwischen liegt die
Linker- oder Spacer-DNA, die sehr unterschiedlich lang ist (20-80
oder mehr bp). Das hngt damit zusammen, dass die
Nucleosomenstruktur vor allem in Promoter- und Genbereichen nicht
vollkommen starr und unvernderbar ist, sondern dynamisch. Folglich
sind natrlich auch die Bereiche, die zwischen zwei Nucleosomen
liegen, vernderbar und dynamisch.
Nucleosomen bestehen aus einem Histonoctamer,
also aus 8 Histonen, wovon je zwei immer gleich
sind, es besteht also aus 4 unterschiedlichen
Histonen, die alle zweimal vorkommen.
Die Histone sind miteinander verwandt und haben
eine Struktur, die als Histone Fold bezeichnet wird.
Die Grundstruktur der Histone ist also immer gleich,
sie unterscheiden sich voneinander durch ihre
langen, relativ unstrukturierten N-Termini, die
sehr wichtig fr Histonmodifikationen sind.
Das Histonoctamer besteht eigentlich aus einem
H3/H4-Tetramer, die zweite Grundstruktur ist ein
H2A/H2B-Dimer. 2 dieser Dimere und 1 dieser Tetramere bilden das Histonoctamer, was in einem
regulierten Vorgang geschieht. Zunchst werden das Tetramer und die beiden Dimere gebildet, dann
wird zuerst das Tetramer in die DNA eingelagert, die sich schon darum wickelt, und schlielich
kommen die beiden Dimere dazu und das Nucleosom ist vollstndig assembliert.
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Das Nucleosom bildet zwar immer die in Schemata


zylinderfrmig dargestellte kompakte Grundstruktur, es gibt
aber zustzlich stark unstrukturierte Fortstze, die aus dieser
kompakten Grundstruktur herausragen. Das ist wichtig, weil die
N-Termini, die diese Fortstze bilden, von auen her zugnglich
und dadurch modifizierbar sind.
H1 korreliert damit, dass eine kompaktere nucleosomale
Struktur gebildet wird. Dazu bindet H1 an die nucleosomale
DNA und erlaubt einzelnen Nucleosomen, miteinander zu
interagieren und so eine kompaktere Struktur zu bilden. Diese
kompaktere Struktur gilt als wenig transkribierbar, das H1 ist
also eher ein negativer Regulator der Genexpression.
Wie kann man Chromatin verndern? Was hat Chromatin mit Genregulation zu tun? Regulation
heit in diesem Fall Vernderung was wird am Chromatin verndert?
Dabei ist der Begriff des Chromatin Remodeling wichtig, was einfach bedeutet, dass Chromatin
von einer in eine andere Struktur berfhrt werden kann, im Extremfall wird Eu- in
Heterochromatin berfhrt wird.
Euchromatin ist das biologisch aktive Chromatin und Heterochromatin ist in der Regel
Chromatin, in dem die DNA stillgelegt ist. Die beiden Formen knnen ineinander berfhrt werden.
Sehr wichtig ist das Chromatin Remodeling auch bei der nucleosomalen Struktur, Nucleosomen
knnen aufgelst, neu gebildet oder umgelagert werden.
Die Histonoctamere knnen verndert werden, indem variante Histone eingefhrt werden.
Diese Vernderung der Chromatinstruktur sind in der Regel eng damit korreliert, dass die Histone
chemisch verndert werden, dass an den Histonen also sogenannte posttranslationale
Modifikationen eingefhrt werden.
Chromatin Remodeling:
Damit meint man in erster Linie das Verschieben, Umlagern oder Auflsen von Histonen. Dafr
werden biochemische Maschinen bentigt, die als Chromatin Remodeling Complexes bezeichnet
werden. Es handelt sich dabei um Komplexe mit relativ vielen Untereinheiten, in denen immer
wieder Domnen, also Proteinmodule vorkommen, die in der Lage sind mit Histonen zu
interagieren: Bromodomne, Chromodomne, SANT Domne, PHD Finger.
Es gibt also vier unterschiedliche Domnen, die alle in der Lage sind auf unterschiedliche Weise
Histone zu erkennen und an diese zu binden.
Welche biochemischen Reaktionen fhren diese Chromatin Remodeling Complexes aus?
Zum einen bewirken sie Nucleosome Sliding, was bedeutet, dass das Nucleosom an der DNA
entlanggleitet, wodurch sich die DNA im Linker-Bereich und die nucleosomale DNA verndern.
Sliding von Nucleosomen verndert also, welche DNA im Spacer frei vorliegt und welche um ein
Nucleosom gewickelt ist.
Die Chromatin Remodeling Complexes sind durch eine
bestimmte Untereinheit definiert, die biochemisch eine
ATPase ist. ATPasen spalten ATP und gewinnen daraus
Energie, was zeigt, dass fr das Chromatin Remodeling
Arbeit, also Energie aufgewendet werden muss.
Jede der Chromatin Remodeling Complex-Familien ist
durch eine bestimmte ATPase charakterisiert, jede davon
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enthlt aber eine ATPase-Domne bestehend aus DExx und HELICc. Zwischen diesen beiden
Teilen der Domne liegt immer eine Insertion von Aminosuren, die kurz oder lang sein kann.
Die ATPasen haben auch Domnen bzw. Module, die mit Histonen interagieren knnen.
Die Funktion der ATPasen wird dadurch reguliert, dass sie selbst posttranslational modifiziert, z.B.
acetyliert werden, dass sie aber auch mit anderen Proteinen interagieren, die wichtig sind fr die
Regulation ihrer Funktion.
Die Chromatin Remodeling Complexes sind evolutionr konserviert, es wurden homologe
Komplexe in Hefe, Drosophila und Mensch gefunden.
Bindungsstellen fr Transkriptionsfaktoren sind in nucleosomaler DNA in der Regel dem
Nucleosom so zugewandt, dass sie unzugnglich sind. Durch das Nucleosome Sliding wird das
Nucleosom ein Stck an der DNA entlang verschoben und DNA, die vorher nucleosomal war, wird
zur Linker-DNA, wodurch die Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen zugnglich werden.
Eine Alternative hierzu wre, ein Nucleosom von einem Stck DNA auf ein anderes zu bertragen
(Nucleosome Transfer?). Das konnte aber bisher nur im Reagenzglas beobachtet werden und es ist
deshalb nach wie vor ungeklrt, ob das in Zellen berhaupt stattfindet.
Die dritte Mglichkeit stellt das Rotational Positioning, was bedeutet, dass die DNA nur so weit
verndert wird, dass eine Rotation relativ zum Nucleosom stattfindet, so dass eine
Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle, die zunchst zum Nucleosom hingewandt ist, dann vom
Nucleosom abgewandt wird und deshalb fr Transkriptionsfaktoren zugnglich ist.

Konsequenzen des Chromatin Remodelings:


Man hat zunchst eine nucleosomale DNA, an die der Remodeler gebracht wird und kann jetzt
Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen durch Repositioning (Sliding), Nucleosome Ejection oder
Unwrapping freilegen.
Bei Nucleosome Ejection wird tatschlich ein Nucleosom vollstndig entfernt, beim Unwrapping
wird die DNA ein wenig vom Nucleosom weggedreht, so dass sie fr Transkriptionsfaktoren
zugnglich wird (Rotational Positioning).
Es gibt aber auch noch die Mglichkeit, variante Histone einzubringen, die oft andere
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Eigenschaften haben, es handelt sich dabei also um einen Regulationsmechanismus.


Auerdem knnen Dimere aus einem Histonoctamer herausgenommen werden, so dass das
Octamer auf diese Weise nicht ganz zerstrt wird.

Ein Remodeling Complex besitzt drei wichtige


Strukturelemente:
eine Domne, mit der er sich an der DNA
festhalten kann (DNA-binding Domain,
DBD)
eine Domne, die als Translocation
Domain (Tr) bezeichnet wird und fr das
Translozieren von DNA entlang des
Nucleosoms gebraucht wird
Diese beiden Strukturen mssen flexibel
miteinander
verbunden
sein,
das
bernimmt eine dritte Struktur, die als
Gelenk (Hinge) bezeichnet wird.
Der Remodeler bindet und die DBD bewegt sich
nach vorne und nimmt dabei die DNA mit,
wodurch sich diese auf dieser Seite vom
Nucleosom wegbewegt und eine Schlaufe bildet.
Als nchstes macht die Translocation Domain eine
Gegenbewegung nach hinten und nimmt auch
wieder die DNA mit, so dass der Teil der DNA, der
davor die Schlaufe gebildet hat, in Richtung der Tr
weitergezogen wird. So ist die DNA also am
Nucleosom entlang ein Stck weitergerutscht. Dieser ganze Vorgang kann wiederholt werden,
indem die DBD wieder nach hinten rutscht und neu bindet, ohne dabei die DNA mitzunehmen.

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Je weiter eine Bindungsstelle in ein Nucleosom


hineingewickelt ist, desto unwahrscheinlicher ist es, dass sie
durch Sliding freigelegt wird. Dementsprechend passiert es
oft, dass erst einmal eine Bindungsstelle freigelegt wird und
der daran bindende Transkriptionsfaktor dann weitere
Remodeling-Komplexe ins Spiel bringt, die dann die zweite
Bindungsstelle freilegen, es ist aber sehr unwahrscheinlich,
dass ein Remodeling Complex gleich beide Bindungsstellen
freilegen kann.
Das Chromatin Remodeling trgt zur kooperativen Interaktion von Transkriptionsfaktoren bei.
Es ist oft so, dass zwei Bindungsstellen fr Transkriptionsfaktoren vorhanden sind und eine
Interaktion zwischen den beiden dort bindenden
Transkriptionsfaktoren
fr
deren
Bindung
notwendig ist. Dabei kann diese Interaktion direkt
erfolgen oder ber ein weiteres Brckenprotein X,
das einen Cofaktor der Transkription darstellt. Hier
beruht die Kooperativitt der beiden Faktoren auf
dieser Brckenbildung, whrend sie im ersten Fall
auf einer direkten Interaktion zwischen den beiden
beruht.
Die Chromatinstruktur kann dabei ein Problem
darstellen, wenn die Bindungsstelle eines der beiden
kooperativen Transkriptionsfaktoren in einer
nucleosomlaen Struktur steckt. In diesem Fall wird
wie oben beschrieben zunchst einer der beiden
Faktoren gebunden, der dann einen Remodeling
Complex an das Chromatin bringt. Dieser
veranlasst dann z.B. Rotational Positioning und
ermglicht so die Bindung des zweiten
Transkriptionsfaktors. In diesem Fall liegt die
kooperative
Bindung
der
beiden
Transkriptionsfaktoren nicht in einer direkten oder
indirekten Interaktion, sondern der eine schafft die
strukturellen Bedingungen, die fr die Bindung des
anderen bentigt werden.
Es gibt auch den Fall, dass der zuerst bindende
Transkriptionsfaktor das Chromatin Remodeling
selbst vornimmt, ohne einen Remodeling Complex
zu rekrutieren.
Die kooperativen Aktivitten von Transkriptionsfaktoren knnen also nicht nur ber physische
Interaktion zwischen ihnen erklrt werden, sondern auch durch eine Einflussnahme auf die
Chromatinstruktur mithilfe von Chromatin Remodeling Complexes.
Ein anderes Phnomen, wie ein Transkriptionsfaktor selbst dafr sorgen kann, dass eine ganz
bestimmte nucleosomale Struktur etabliert wird, stellt das sogenannte Bookmarking von
Nucleosomen dar.
Bei der DNA-Replikation gibt es das Problem, dass die Chromatinstruktur zumindest teilweise in
die Tochterzellen berfhrt werden soll, da die Transkription in der Tochterzelle wieder genauso
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reguliert werden soll wie in der Mutterzelle. Ein Weg das zu tun ist, dass die Position von
Nucleosomen durch Transkriptionsfaktoren markiert wird. So wrden bei der replizierten DNA die
Transkriptionsfaktoren gleich wieder an diese Stellen binden und nach Bildung der Nucleosomen
wre klar wo diese eingefgt werden sollen.
Eine andere Mglichkeit ist, dass ein Transkriptionsfaktor ganz przise darauf Einfluss nimmt, wo
eine Nucleosom positioniert wird.
Nucleosomen bestimmen also nicht nur, wohin Transkriptionsfaktoren binden knnen, sondern
Transkriptionsfaktoren knnen ber das Phnomen des Bookmarkings auch bestimmen, wie
Nucleosomen nach der Replikation der DNA positioniert werden.
Variante Histone sind ihren normalen Histonen nahe verwandt, manchmal unterscheiden sie sich
nur um ein paar Aminosuren.
Histon 3.3 ist z.B. eine dem Histon 3 sehr nah verwandte Variante und wird auch benutzt, um dieses
auszutauschen. Das verndert die Eigenschaften des Nucleosoms so, dass die DNA dort besser
transkribierbar wird, dieser Austausch von H3 gegen H3.3 erfolgt also in transkriptionell aktiven
Genen.
Es gibt aber auch Varianten, die eher mit negativer Genregulation korreliert sind, z.B. die H2A.ZVariante. Diese findet man in Promotoren oder Boundary Elementen und soll dafr sorgen, dass
sich Heterochromatin nicht in die Bereiche von transkriptionell aktiven Genen erstreckt.
Dieser Austausch von herkmmlichen gegen variante Histone erfolgt durch Chromatin Remodeling
Complexes.
Eine weitere Histonvariante stellt CENP-A dar, das man in Centromer-Bereichen findet und
ermglicht die Bindung der Kinetochor-Proteine und damit das Anknpfen des Chromosoms an den
Spindelapparat.
Die varianten Histone haben also Eigenschaften, die mit der biologischen Aktivitt des jeweiligen
DNA-Abschnitts korreliert sind und diese untersttzen.
Es gibt bei Nucleosomen also eine kompakte
Grundstruktur, um die die DNA gewickelt ist,
und die N-Termini, die aus dieser Struktur
herausragen und von auen gut zugnglich sind.
Diese Zugnglichkeit der N-Termini der Histone
hat damit zu tun, dass die Histone modifiziert
werden, was ein wichtiger Teil der
Transkriptionskontrolle ist.
Die
verschiedenen
N-Termini
werden
unterschiedlich stark modifiziert, Modifikationen
treten nur sehr selten in den Bereichen des
Histone Folds auf und nicht jede Aminosure
kann modifiziert werden, sondern nur bestimmte
Arten und dabei auch nur solche an bestimmten
Stellen.
Die wichtigsten Modifikationen sind die Acetylierung von Lysinen, die Methylierung von Lysinen
und Argininen und die Phosphorylierung von Serinen.
Die am einfachsten interpretierbare Modifikation, die also eindeutig mit einer bestimmten
transkriptionellen Aktivitt korreliert ist, ist die Lysin-Acetylierung. Lysin-Acetylierung wird
durch Histon-Acetyltransferasen (HAT) bewirkt.
Die Acetylierung findet an der positiv geladenen Aminosure Lysin statt. Da Acetylierung der
Einfhrung einer negativ geladenen chemischen Gruppe entspricht, wird die positive Ladung des
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Lysins neutralisiert, was eine schlechtere Interaktion mit der negativ geladenen DNA und somit eine
Lockerung der DNA-Struktur zur Folge hat.
Es gibt Proteine, die solche modifizierten Histone erkennen, daran binden und dann ihre Funktion
ausben. Die Lockerung der DNA-Struktur ist nur eine der Konsequenzen, die wichtigere ist
wahrscheinlich, dass die acetylierten Histone durch solche Proteine erkennbar werden.
Die HAT hat Gegenspieler, die Histon-Deacetylasen (HDACs), die das genaue Gegenteil bewirken,
also die Acetylgruppen wieder von den Lysinen entfernen.
Die HATs sind also eindeutig mit positiver Genregulation assoziiert, die HDACs mit negativer
Regulation.
Die Methylierung von Histonen ist andererseits sehr schwer interpretierbar. Die Konsequenz der
Methylierung ist unterschiedlich, je nachdem, welches Lysin innerhalb eines Histons methyliert
wird. H3K4-Methylierung ist z.B. mit Transkriptionsaktivitt korreliert, H3K9-Methylierung mit
transkriptioneller Repression.
Bei der Methylierung von Lysinen kann nicht nur eine Methylgruppe eingefhrt werden, sondern
bis zu 3, jedes Lysin kann also mono-, di- oder trimethyliert sein. Dadurch knnen sehr viele
unterschiedliche Methylierungsmuster eingefhrt werden, die dann zustzlich noch mit
unterschiedlichen Acetylierungen, Arginin-Methylierungen und Phosphorylierungen kombiniert
werden knnen. Aufgrund dieser riesigen Menge an mglichen Modifikationskombinationen spricht
man hier auch von einem Histon-Code, den diese posttranslationalen Modifikationen bewirken. Sie
bilden einen Code dafr, in welcher biologischen Aktivitt sich der entsprechende DNA-Abschnitt
engagiert, was dadurch passiert, dass der Histon-Code durch Proteine ablesbar ist, die dann diese
biologischen Folgereaktionen in die Wege leiten.
Die Funktionen, die reguliert werden, sind aber natrlich nicht nur Transkription, sondern auch die
Reparatur, Replikation oder Kondensation von DNA wird durch solche Histon-Modifikationen
reguliert.
6. Vorlesung (08.05.2012):
Die Histone, die die Nucleosomen aufbauen, besitzen N-Termini, die von auen zugnglich und
dadurch von einer Vielzahl unterschiedlicher Enzyme modifizierbar sind.
Die Acetylierung von Lysinen ist mit der Aktivierung von Transkription korreliert, die Methylierung
von Lysinen kann sowohl mit der Repression also auch mit der Aktivierung der Transkription
korreliert sein.
Diese Vielzahl an Modifikationen ist nicht zufllig ber das Genom verteilt, sie passieren an
bestimmten Stellen zu bestimmten Zeiten und haben dann eine bestimmte biologische Bedeutung.
Es gibt zwei wichtige Typen von Komplexen, die die Chromatinstruktur verndern, einerseits die
Chromatin Remodeling-Komplexe, also Komplexe, die unter ATP-Verbrauch Nucleosomen
verschieben oder auflsen knnen, und andererseits solche Komplexe, die enzymatische Aktivitten
enthalten und Modifikationen an Histonen vornehmen. Es gibt z.B. Komplexe, die eine HistonAcetyltransferase (HAT) beinhalten. Diese bestehen meist aus vielen verschiedenen Untereinheiten,
die Ausnahme bilden P300 und CBP, die aus nur einer Untereinheit bestehen, die dem Protein die
HAT-Aktivitt verleiht.
Wie interagieren diese Komplexe mit dem Chromatin?
Viele dieser Komplexe enthalten Proteine mit Untereinheiten, die bereits modifiziertes Chromatin
Genexpression (Decker, Blsi)

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erkennen knnen. Die Voraussetzung, dass solche Komplexe also berhaupt mit Chromatin
wechselwirken knnen ist, dass das Chromatin bereits so modifiziert ist, dass es fr diese erkennbar
wird, im Fall der HAT-Komplexe durch Bromodomnen.
Bromodomnen sind Proteinstrukturelemente, die einem Protein oder ganzen Proteinkomplexen
die Fhigkeit verleihen, acetylierte Proteine, in diesem Fall acetylierte Histone, zu erkennen.
Chromodomnen binden an methylierte Histone.
Auch unter den HDAc-Komplexen existiert einer, der in der Lage ist Histonmodifikationen zu
erkennen, nmlich der NuRD-Komplex, der das mithilfe einer Chromodomne bewerkstelligt, es
kann also methyliertes Chromatin erkannt werden.
Das gleiche gilt fr die Histon-Methylasen, wo der SUV39-Komplex ebenfalls ber eine
Chromodomne Methylierungen am Chromatin erkennen kann.
Wie kann man feststellen, welches Chromatin an welcher Stelle wie modifiziert ist?
Die Schlsseltechnologie dabei ist die Chromatin-Immunprzipitation (ChIP), die es erlaubt, die
Interaktion von Proteinen mit Chromatin und die Modifikation von Proteinen, die Teile des
Chromatins sind, also z.B. die Histone, zu analysieren.
Der erste Schritt dabei ist die mechanische Zerkleinerung des isolierten Chromatins, damit es
experimentell handhabbar wird. Das wird meist dadurch erreicht, dass das Chromatin in ein
Ultraschallbad gegeben wird, wo es durch den Ultraschall mechanisch in Stcke zerkleinert wird,
die je nach Behandlung einige 100 bp gro sind.
Damit sich die Histone nicht von der DNA
lsen
knnen,
wird
im Vorfeld
Crosslinking durchgefhrt, also eine
chemische Quervernetzung eingebracht.
Als nchstes wird ein Antikrper
bentigt, der in der Lage ist, die gesuchte
Modifikation am untersuchten Histon zu
erkennen. Ist die gesuchte Modifikation
vorhanden, bindet der Antikrper und man
kann den Antikrper samt dem daran
gebundenen
Chromatinfragment
immunprzipitieren. Das bedeutet, dass
man den Antikrper an kleine SepharoseStckchen, also an eine relativ schwere
Matrix, so dass man dann diesen Komplex
aus Sepharose-Kgelchen, Antikrper und
Chromatinfragment
einfach
abzentrifugieren kann. So knnen die Chromatinfragmente, wo die gesuchte Modifikation
vorhanden ist, von denen, wo dies nicht der Fall ist, getrennt werden.
Der nchste Schritt ist die Reversion des Crosslinkings, die chemische Bindung, die die DNA an
das Histon koppelt, wird also aufgelst, so dass man die DNA erhlt, die mit dem modifizierten
Chromatin assoziiert war. Nun kann man mithilfe von PCR den Nachweis durchfhren, ob z.B. ein
bestimmter Bereich der DNA in diesem modifizierten Chromatin vorlag.
Dieses Verfahren kann mit Antikrpern durchgefhrt werden, die die verschiedensten HistonModifikationen erkennen.
Mit diesem Verfahren kann mittlerweile auch untersucht werden, ob ein bestimmter
Transkriptionsfaktor in einer bestimmten Situation mit dem Chromatin assoziiert vorliegt. In diesem
Fall fhrt man das Experiment nicht mit Antikrpern gegen Histon-Modifikationen durch, sondern
Genexpression (Decker, Blsi)

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mit einem gegen den gesuchten Transkriptionsfaktor.


Dadurch hat ChIP mittlerweile viele der frher besprochenen in vitro-Verfahren ersetzt, da man
damit die tatschlich im Kern natrlich vorliegende Chromatinstruktur untersuchen kann.
Das ChIP-Verfahren kann auerdem noch zum
sogenannten ChIP-Sequencing (ChIP-Seq) erweitert
werden. Dabei wird die Immunprzipitation normal
durchgefhrt, man fragt aber nicht nach der
Anwesenheit eines bestimmten Promoters, sondern
sequenziert einfach alles, was przipitiert wurde.
Man fhrt also wieder Crosslinking durch, so dass
etwaige gebundene oder assoziierte Proteine nicht von
der DNA gelst werden knnen. Danach wird die
Immunprzipiztation
mit
dem
entsprechenden
Antikrper durchgefhrt und alle erhaltenen DNASequenzen werden Massive Parallel Sequencing
(Next Generation Sequencing) unterzogen.
Der schwierige Schritt an diesem Verfahren ist dann
schlielich das Annotieren, man muss also noch
feststellen, zu welcher genomischen Sequenz die
ganzen
kurzen
sequenzierten
DNA-Stckchen
korrespondierend sind.
Zuletzt erhlt man einen Peak, der aussagt, wie oft die
Sequenz eines bestimmten Bereichs in dem
Chromosom in dem Przipitat lesbar war.
So knnen z.B. Experimente durchgefhrt werden, mit
denen untersucht wird, welche Modifikationen mit der
Bindung eines bestimmten Proteins an die DNA
korreliert sind.
Dabei erhlt man als Resultat eine sogenannte
genomische oder Chromatin-Landschaft von HistonModifikationen und kann anhand derer dann feststellen,
mit welchen dieser Modifikationen die Bindung eines
bestimmten Transkriptionsfaktors korreliert ist.
Die unterschiedlichen Histon-modifizierenden Komplexe modifizieren nicht alle dieselben
Aminosuren, sonst bruchte die Zelle nur einen Komplex pro Art der Modifikation, sie haben
bestimmte Prferenzen, es gibt also eine Spezifitt fr bestimmte Positionen im Histon.
Allgemein gilt auch fr jede modifizierbare Aminosure, dass nicht alle davon, die in den fr
Modifikationen zugnglichen Teilen eines Histons liegen, auch tatschlich modifiziert werden
knnen.
Ubiquitinierung ist eine vergleichsweise seltene Modifikation, die ausschlielich in den Histonen
H2A und H2B vorkommen und dort auch nur an jeweils einem bestimmten Lysin (H2A: K119,
H2B: K120).
Beim Lysin, bei dem mehrere Arten der Modifikation mglich sind (Acetylierung, Methylierung,
Ubiquitinierung), ist es auerdem so, dass nicht an allen Lysinen jede dieser Modifikationsarten
vorgenommen werden knnen.
Diese Vielzahl von Modifikationen erzeugt eine unglaubliche Komplexitt von Varianzen, da je
Genexpression (Decker, Blsi)

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nach vorherrschender Situation ganz unterschiedliche Modifikationsmuster vorhanden sein. Daher


spricht man vom Histon-Code, der versucht einem bestimmten Modifikationsmuster eine bestimmte
biologische Situation zuzuordnen.
Damit eine Korrelation zwischen Modifikation und biologischer Folgereaktion existieren kann,
muss es Proteine geben, die diesen Code interpretieren knnen. Diejenigen Enzyme, die in der Lage
sind diese Modifikationsmuster zu erzeugen, knnen diese auch lesen.
Es gibt hierbei die Writers, also die Schreiber des Histon-Codes, die die Histon-Acetyltransferasen,
die Proteinkinasen, die Arginin-Methyltransferasen und die Lysin-Methyltransferasen umfassen,
und die Readers, also die Interpretierer des Histon-Codes. Die Reader umfassen Proteine, die z.B.
Bromo- oder Chromodomnen enthalten und damit die jeweiligen Modifikationen erkennen
knnen.
Dabei gibt es nicht nur eine Bromo- oder eine Chromodomne, sondern es gibt ganze Familien von
Proteinen, die solche Domnen enthalten und wieder unterschiedliche modifizierte Reste
bevorzugen, sie sind also in der Lage zu erkennen an welcher Position die jeweilige Modifikation
vorliegt.
Der Histon-Code wird von solchen Proteinkomplexen oder Proteinen interpretiert und zwar so, dass
die einzelnen Komplexe nicht wahllos an ihre Modifikationen binden, sondern nur, wenn diese
Modifikation in einem bestimmten Kontext, also an einer bestimmten Stelle des Histons vorkommt.

[HAT Histon-Acetyltransferasen; PRMT Protein-Arginin-Methyltransferasen; HKMT Histon-Lysin-Methyltransferasen]

Die Writers und Readers sind nicht immer getrennt, es knnen auch beide Funktionen in einem
Proteinkomplex vereint sein. Das bedeutet, dass die Histon-modifizierende Maschinerie auch
untereinander kommuniziert, d.h. beispielsweise, dass ein Komplex seine Modifikation nur einfhrt,
wenn eine andere, die er durch seine Reader-Domne erkennt, schon vorhanden ist.
Dieses Phnomen, dass eine Modifikation nur eingebracht werden kann, wenn eine anderen schon
vorhanden ist, bezeichnet man als Crosstalk zwischen den Histon-Modifikationen.
Wie knnen diese ersten fr diesen Crosstalk bentigten
Modifikationen eingefhrt werden?
In Bezug auf Acetylierungen ist es eine Aufgabe von
Transkriptionsaktivatoren,
die
Histon-modifizierenden
Komplexe an das Chromatin zu bringen.
Umgekehrt kann ein transkriptioneller Repressor dafr sorgen,
dass ein Gegenspieler eines solchen Komplexes an das
Chromatin gebracht wird, der die Acetylierung wieder entfernt
und
das
Chromatin
auf
diese
Weise
transkriptionsunfreundlicher macht.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Es gibt also zwei Mglichkeiten, wie man Chromatin


Remodeling Complexes und Histone Modifying Complexes
an das Chromatin bringen kann, damit sie dort ihre Funktion
ausben. Entweder es sind bereits Modifikationen
vorhanden, die von diesen Komplexen lesbar sind, dann
fungieren sie gleichzeitig als Readers und Writers, oder diese
Modifikationen liegen noch nicht vor, dann knnen solche
Komplexe durch Transkriptionsfaktoren an das Chromatin
rekrutiert werden. Dabei knnen durchaus beide Prozesse
gekoppelt auftreten.
Auch das Zusammenspiel von Chromatin Remodeling und
Chromatin-Modifikation kann auf unterschiedliche Weise
passieren. Das Chromatin Remodeling kann Voraussetzung
dafr sein, dass die Modifikation stattfinden kann, oder auch
umgekehrt. Die Abbildung links zeigt ein hypothetisches
Beispiel fr Ersteres.
Ein konkretes Beispiel fr den zweiten Fall, wo HistonModifikationen fr die Rekrutierung des Chromatin
Remodeling-Komplexes bentigt werden, stellt die
Aktivierung des Gal1-Gens der Hefe durch Gal4 dar.
Gal4 rekrutiert hier Histon-Modifikationskomplexe und
nachfolgend auch Remodeling-Komplexe an das Chromatin.
Der Promoter des Gal1-Gens liegt im Grundzustand so vor,
dass das Gal4 daran gebunden ist. Dieser ist aber auch an den
transkriptionellen Repressor Gal80 gebunden. Tritt nun
Galactose in der Hefezelle auf, sorgt diese dafr, dass Gal80
mit Gal3 interagiert, was verhindert, dass Gal80 in den
Zellkern gelangen kann. Deswegen ist dann nur noch Gal4 an den Promoter gebunden und kann
transkriptionell aktiv werden. Das bedeutet, dass zunchst der Histon-Acetyltransferase-Komplex
SAGA mit seiner GCN5-Untereinheit gebunden wird. Gleichzeitig kann Gal4 aber auch Mediator
und den sogenannten SWI/SNF Remodeling-Komplex binden.
Es werden also drei groe Proteinkomplexe ber Gal4 gebunden, die Histone modifizieren und
dafr sorgen knnen, dass die Polymerase und die generellen Transkriptionsfaktoren rekrutiert
werden.
Der Chromatin Remodeling Complex entfernt hier z.B. ein acetyliertes Nucleosom im Bereich des
Transkriptionsstarts, wodurch er die Bindung der generellen Transkriptionsfaktoren und der RNAPolymerase an den Transkriptionsstart erlaubt.
Die Voraussetzung dafr ist, dass der SAGA-Komplex dieses Nucleosom, das sich unmittelbar
oberhalb des Transkriptionsstarts befindet, acetyliert und der SWI/SNF-Remodeling-Komplex
dieses Nucleosom nachfolgend vom Transkriptionsstart entfernt (muss nicht unbedingt ganz von der
DNA entfernt werden, es kann auch verschoben werden).
Es gibt dann noch ein weiteres Zusammenspiel zwischen der Phosphorylierung der Polymerase und
einer weiteren Histon-Modifikation, nmlich der Mono-Ubiquitinierung von H2B und der H3K4Trimethylierung, was alles in einer geordneten Abfolge passiert.
Gal4 kann noch einen Enzymkomplex bestehend aus den beiden Proteinen Bre1 und Rad6
rekrutieren, der eine H2B-Ubiquitin-Ligase enthlt. Dadurch kann H2B monoubiquitiniert werden,
was in diesem Fall nicht zum Abbau des H2B-Histons fhrt, sondern es handelt sich dabei um eine
regulatorische Modifikation.
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Das Rekrutieren dieses Komplexes allein reicht aber nicht aus, um diese E3-Ligase zu aktivieren,
dazu mssen weitere Komplexe wie z.B. der PAF-Komplex gebunden werden. Der PAF-Komplex
kann jetzt die Ubiquitin-Ligase aktivieren, so dass die H2B-Ubiquitinierung stattfindet. Diese
Ubiquitinierung ist Voraussetzung dafr, dass der COMPASS-Komplex mit seiner MethylaseUntereinheit Set1 die H3K4-Trimethylierung vornehmen kann.
Erst wenn diese beiden Modifikationen stattgefunden haben, kann die Ser2-Kinase fr die RNAPolymerase rekrutiert werden und die Ser2-Phosphorylierung als Voraussetzung fr die Elongation
kann stattfinden.

Es gibt grundstzlich zwei Mglichkeiten, die Transkription zu regulieren, einerseits auf Ebene der
Initiation, also bei der Bildung des PIC und damit der Rekrutierung der RNA-Polymerase, und
andererseits kann es sein, dass der PIC immer gebildet wird und die eigentliche Regulation beim
bergang von der Initiation zur Elongation stattfindet.
Ein Beispiel dafr sind Gene, die durch den sogenannten Heat-shock Transcription Factor (HSF)
aktiviert werden.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Dabei werden die Situationen vor und


nach dem Heat-shock verglichen, der
Heat-shock selbst bewirkt, dass der
Transkriptionsfaktor HSF aktiv wird.
Vor dem Heat-shock wird das Chromatin
remodelliert,
so
dass
der
Transkriptionsstart nucleosomenfrei ist
und
die
generellen
Transkriptionsfaktoren und die RNAPolymerase, die zu diesem Zeitpunkt
bereits Ser5-phosphoryliert vorliegt,
binden knnen.
Nach der Ser5-Phosphorylierung findet
die Promoter Clearance statt, die RNAPolymerase transkribiert also die ersten
20-30 Nucleotide, nun wird aber
mithilfe der Proteine DSIF und NELF
der Elongationsblock etabliert und es
kommt zu einer Pausierung der RNAPolymerase II. Dieses Pausieren ist der
Zustand, der an diesen durch Heat-shock
aktivierbaren Genen persistiert, bis der
Heat-shock tatschlich stattfindet.
Wenn der Heat-shock stattfindet, bindet
HSF und rekrutiert die Ser2-Kinase
pTEFb, die jetzt Serin 2, DSIF und
NELF phosphorylieren kann. Dadurch
erhlt man eine elongationskompetente
Polymerase,
die
an
Serin
2
phosphoryliert ist, die pTEFb-Aktivitt
entfernt den Elongationsblock und es
kommt zur Elongation.
Nach aktuellen Erkenntnissen werden vermutlich mehr als 50% aller regulierbaren Gene nicht auf
Ebene der Initiation, sondern auf Ebene der Elongation reguliert, es handelt sich dabei also um eine
sehr hufige Situation.
Ein weiterer wichtiger Begriff im Zusammenhang mit Chromatin ist das sogenannte Enhanceosom.
Ein Enhanceosom kann man sich so vorstellen, dass dabei ein Promoter-Nucleosom durch einen
sehr komplexen und umfangreichen Komplex aus Transkriptionsfaktoren ersetzt wird.
Ein konkretes Beispiel hierfr ist das Interferon -Gen,
das ein immunologisch wichtiges Gen ist, das in viral
infizierten Zellen zur Expression kommen muss, um fr
antivirale Immunitt zu sorgen. Dass es zur Expression
kommt hngt damit zusammen, dass an seinem
Promoter ein sogenanntes Enhanceosom gebildet wird.
Das Enhanceosom besteht aus drei Typen von
Transkriptionsfaktoren:
NfB, der aus den zwei Untereinheiten p50 und
p65 besteht
Genexpression (Decker, Blsi)

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AP1, der immer aus der Untereinheit cJun und einem Protein aus der sogenannten FosFamilie besteht, im Fall des IFN- dem ATF-2
Interferon Regulatory Factors (IRF), aus denen ein Dimer gebildet wird, das entweder
aus zwei IRF3, aus zwei IRF7 oder aus einem IRF3 und einem IRF7 bestehen kann
Diese Proteine bewirken zusammen mit den High Mobility Group I (HMGI-)
-Strukturproteinen, die keine eigentlichen Transkriptionsfaktoren sind, aber dafr sorgen knnen,
dass sich die Enhanceosom-Struktur bilden kann, die Verkrmmung der DNA im entsprechenden
Bereich, so dass sich das Enhanceosom bilden kann.

Auch beim Enhanceosom erfolgt die Aktivierung des Promoters in einer Reihe von klar definierten
Schritten. Zunchst wird das Enhanceosom anstelle eines Promoter-Nucleosoms gebildet. Das
Enhanceosom kann nun den SAGA-Komplex mit seiner GCN5-Histon-Acetyltransferase
rekrutieren und das Nucleosom an der Initiationsstelle wird acetyliert und remodelliert, also von
dieser Stelle entfernt. Daraufhin kann der Initiationskomplex mit der RNA-Polymerase gebildet
werden, es bindet eine weitere HAT, nmlich CBP, und bedingt durch die weitere Acetylierung
eines benachbarten Nucleosoms auch der SWI/SNF Chromatin Remodeling Complex.
Nun ist die Voraussetzung fr die vollstndige Remodellierung des Promoters gegeben, der
vollstndige Initiationskomplex einschlielich aller basalen Transkriptionsfaktoren kann gebildet
und die Clearance und nachfolgend die Elongation knnen durchgefhrt werden.

Ein weiteres konkretes Beispiel stellt ein Gen dar, das fr eine Recombinase von S. cerevisiae
codiert, das fr das Mating-type Switching bentigt wird. In diesem Fall kommt es zunchst zur
Bindung des Transkriptionsfaktors SWI5, der dafr sorgt, dass Chromatin Remodeling Complexes
oder auch Histon-Modifikationskomplexe gebunden werden, und es kommt dazu, dass die
nucleosomale Struktur ber einer weiteren Bindungsstelle, nmlich der des Transkriptionsfaktors
SBF, vollkommen aufgelst wird, was die
Voraussetzung fr die Bildung des Initiationskomplexes
ist.
Ein weiteres Beispiel ist das Retrovirus MMTV (Mouse
Mammary Tumor Virus), das in Musen Brusttumore
hervorrufen kann. Dazu muss es allerdings aktiviert
werden. Wenn aufgrund der Lactation im Brustgewebe
Glucocorticoide gebildet werden, wird daraufhin der
Glucocorticoid-Rezeptor (GR) aktiviert, der dann dafr
Genexpression (Decker, Blsi)

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sorgt, dass ein Nucleosom so verndert wird, dass es zur Bindung von weiteren
Transkriptionsfaktoren kommen kann, nmlich OTF-1 und NF1. So wird der transkriptionell aktive
Promoter gebildet. Die NF1-Bindung kann erst erfolgen, wenn der Glucocorticoid-Rezeptor ein
Rotational Positioning am Nucleosom vorgenommen hat und dadurch die NF1-Bindungsstelle
freigelegt wurde.
Nach NF1-Bindung wird dann auch die OTF-1-Bindungsstelle im Linker-Bereich zugnglich.
Der Zusammenhang mit den Transkriptionsfaktoren ist der, dass Transkriptionsfaktoren gebraucht
werden, um diese ganze Modifikations- und Remodellierungsmaschinerie berhaupt an das
Chromatin zu bringen.
Die Histon-Modifikation bzw. das Histon-Remodeling ist aber auch ein wichtiger Teil der
epigenetischen Genregulation.
Es ist nicht alles durch den DNA-Code festgelegt, der DNA-Code codiert aber auch fr Proteine,
die dann letztlich eine Art der Regulation durchfhren knnen, die DNA-Sequenz-unabhngig ist.
Epigenetische Genregulation hat sehr viel mit Chromatinzustnden zu tun, sie bedeutet nmlich
einfach, dass man diese Chromatinzustnde vererben kann.
Epigenetik beruht zwar auf der Bildung einer bestimmten Art von vererbbarem Chromatinzustand,
aber nicht alles, was am Chromatin verndert wird, fllt unter Epigenetik. Epigenetisch bedeutet,
dass der Zustand, der durch das Chromatin festgelegt wird, tatschlich vererbbar ist, entweder von
Mutterzelle zu Tochterzelle oder von Mutterorganismus zu Tochterorganismus.
Epigenetik fhrt also dazu, dass bei identischer DNA in unterschiedlichen Zellen und Organen
unterschiedliche und mitotisch stabile Genexpression erzeugt wird. Die ursprngliche Ursache
der Existenz von unterschiedlichen Zelltypen mit ihren unterschiedlichen Expressionsmustern liegt
also in der Epigenetik.
Dabei wird eben eine Chromatinstruktur vererbt, die nicht ausschlielich, aber wesentlich durch
DNA-Methylierung bestimmt wird.
Grundbegriffe der Epigenetik sind Eu- und Heterochromatin, die Zustnde des Chromatins
bezeichnen, die aus heutiger Sicht entweder transkribierbar oder nicht transkribierbar sind.
Heterochromatin wurde erstmals 1929 beschrieben und zwar als der Teil des Chromatins, der durch
den ganzen Zellzyklus hindurch kondensiert und damit gut anfrbbar bleibt.
Der Teil, der in der Interphase lose vorlag, wurde als Euchromatin bezeichnet.
1959 wurde postuliert, dass es sich bei Eu- und Heterochromatin um unterschiedliche
biophysikalische Zustnde handelt, die sich unter anderem in der Expression ihrer Gene, aber nicht
in der grundlegenden Struktur der DNA unterscheiden.
Das Euchromatin enthlt die transkribierten Bereiche der DNA, das Heterochromatin ist der
transkriptionell inaktivere Teil des Genoms mit relativ dichter Packung des Chromatins.
Das Heterochromatin kann konstitutiv sein, d.h. das Chromatin stellt sich nie anders als
heterochromatisch dar, was z.B. in Telomer- und Centromer-Bereichen der Fall ist, es kann aber
auch induziert sein, was z.B. bei der Inaktivierung des X-Chromosoms bei Sugern oder bei der
Stilllegung eines der Mating-Types in Saccharomyces vorkommt.
Heterochromatin ist nicht wie ursprnglich angenommen immer die gleiche DNA- bzw. ChromatinKonformation.
Heterochromatin enthlt generell einen niedrigen Gehalt an acetylierten Histonen, die ja eindeutig
mit aktiven Genen korreliert sind.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Wie wird kontrolliert, welcher Bereich der DNA hetero- oder euchromatisch vorliegt? Wie werden
diese Bereiche voneinander abgegrenzt?
Dabei sind bestimmte DNA-Sequenzen wie Locus Control Regions (LCRs), Insulators oder
Boundary Elements von Bedeutung.
Locus Control Regions sind eine essentielle Voraussetzung dafr, dass bestimmte Gene in
bestimmten Bereichen berhaupt transkribierbar werden.
Insulators und Boundary Elements schaffen Grenzen zwischen eu- und heterochromatischen
Bereichen und trennen auf diese Weise solche Chromatin-Konformationen voneinander bzw.
grenzen sie auf bestimmte Bereiche ein.
Verschiedene Formen von Heterochromatin:
Konstitutives Heterochromatin: permanentes, also nicht induzierbares Chromatin in
Telomer- und Centromer-Bereichen
Fakultatives Heterochromatin: induzierbar
Durch Polycomb-Proteine reguliertes Heterochromatin: = wichtiger Teil der Transcriptional
Memory
BLACK Heterochromatin: in den Bereichen, wo das Chromatin mit der Kermatrix oder der
Kernlamina assoziiert ist

Ein wichtiges Protein bei der induzierbaren Bildung von Heterochromatin, das man auch sehr
hufig in heterochromatischen Bereichen findet, ist das Heterochromatin Protein 1 (HP1).
Liegt Chromatin in einem bestimmten Methylierungszustand vor, nmlich H3K9-di- oder
-trimethyliert, was von der SUV39H1-Methylase durchgefhrt wird, kann dieses H3K9 durch die
Chromodomne von HP1 erkannt werden. HP1 bewirkt dann ein Fortschreiten eines stillgelegten,
mit HP1 bedeckten Heterochromatins.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Es gibt mehrere verschiedene Komplexe, die mit epigenetischer Genregulation bzw. mit
Transcriptional Memory zu tun haben.
Besonders hervorzuheben sind dabei die PRC1- und PRC2-Komplexe, die von Proteinen der
sogenannten Polycomb-Gruppe gebildet werden. Bei Mutation dieser Polycomb-Gene kommt es
zur Expression von Genen in Zellen, in denen diese eigentlich nicht exprimiert werden sollten.
Polycomb-Proteine knnen allgemein mit einem epigenetischen Gene Silencing in Verbindung
gebracht werden.
Das Stilllegen von bestimmten Genen in bestimmten Geweben oder Zellen erfolgt dabei so, dass es
mitotisch stabil ist, was bedeutet, dass die Tochterzellen den gesilenceten Zustand von der
Mutterzelle bernimmt.
Die HP1-Komplexe sind bei der Bildung des Heterochromatins wichtig und es gibt noch weitere
Komplexe, die auch bestimmte Chromatin-Modifikationen erkennen und dann an der
epigenetischen Vererbung beteiligt sind.

Wie erkennen solche Komplexe, wo das Chromatin gesilenced werden soll?


Dabei ist wichtig, dass auch diese Komplexe bereits einen bestimmten Modifikationszustand des
Chromatins erkennen, was bedeutet, dass das Chromatin schon auf bestimmte Weise chemisch
modifiziert sein, damit es durch diese Komplexe erkennbar ist.
Der PRC1-Komplex erkennt z.B. trimethyliertes H3K9 oder H3K27, der PRC2-Komplex kann
nicht nur trimethyliertes H3K27 erkennen, sondern diese H3K27-Methylierung auch selbst
durchfhren. Der PRC2-Komplex ist also sowohl ein Reader als auch ein Writer dieser
Modifikation.
Chromosomale Domnen entstehen durch die Bildung von Bereichen, die transkribierbar sind, und
solchen, die gesilencet sind.
Was braucht man, um solche chromosomalen Domnen voneinander abzutrennen?
Dabei gibt es die sogenannten Insulator-Regionen, die als Isolatoren wichtig sind und relativ oft
eine Bindungsstelle fr das CTCF-Protein enthalten.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Das Stilllegen von chromosomalen Bereichen kann auch damit verbunden sein, dass diese Bereiche
an die Kernmatrix assoziiert sind, wofr Matrix-Attachment Regions (MARs) bentigt werden.
Auerdem braucht man Locus Control Regions (LCRs), die auch innerhalb eines euchromatischen
Bereichs festlegen, welche Gene dort tatschlich transkribiert werden knnen und welche nicht.
Von diesen Bereichen wird verlangt, dass sie eine chromosomale Domne definieren, bei der der
Insulator dafr sorgt, dass sie nicht heterochromatisch wird, weil er verhindert, dass sich das
Heterochromatin in diese Domne hinein ausbreitet. Auerdem bentigt man dafr Locus Control
Regions, damit innerhalb dieser Domne Proteine oder Enhancer wirksam und die Gene exprimiert
werden knnen.
Hat man also einen DNA-Bereich, der LCR und Insulator enthlt, knnen diese Bereiche
gemeinsam dafr sorgen, dass die Gene, die durch diese chromosomale Domne definiert werden,
positionsunabhngig exprimiert werden knnen.
Sehr oft bringt man in Zellen Transgene ein und zwar in der Regel dadurch, dass man das
gewnschte Gen zunchst Gen-cloniert und dann in eine befruchtete Eizelle einer Maus injiziert
und diese dann implantiert. Mit etwas Glck bildet sich daraufhin ein Embryo, der das gewnschte
Transgen in sein Genom integriert hat.
Sehr oft kam es dabei dazu, dass das Transgen zwar im Organismus nachgewiesen werden konnte,
es aber nicht exprimiert wurde, es landete also sehr oft in einem heterochromatischen Bereich, was
seine Stilllegung zur Folge hatte.
Koppelt man das Transgen an einen Insulator und eine Locus Control Region, sorgen diese beiden
Elemente dafr, dass Heterochromatin nicht in den Bereich des Transgens hinein kann. Das
bedeutet, egal wo das Transgen ins Genom integriert, es ist exprimierbar.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Das Vorhandensein von solchen LCRs und Insulator-Elementen hat auch sehr viel mit der
Modifikation des Chromatins zu tun. Das heit, man kann diese Bereiche nicht an ihrer Sequenz
erkennen, sie knnen viel besser durch eine Chromatin-Landschaft definiert werden.
Ein Insulator ist z.B. relativ oft eine Bindungsstelle fr das Protein CTCF.
Eine LCR enthlt sehr oft ein variantes Histon, nmlich H3.3 oder H2A.Z, sie hat auerdem sehr oft
ein mono- oder dimethyliertes H3K4.
Das ChIP-Seq-Verfahren, mit dem man genomweit Landschaften von Modifikationen und
Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen erstellen kann, kann auch dabei helfen, im Genom
aufzufinden, welches Stck Chromatin die Voraussetzungen dafr trgt, dass es beispielsweise als
LCR, als Enhancer, als Silencer oder als Insulator-Element fungieren kann.
Was bedeutet Locus Control?
Hat man eine chromosomale Domne, die durch
Insulators abgegrenzt ist, bedeutet das oft, dass
sogenannte Chromatin Hubs gebildet werden. Diese
sind oft einfach Verteiler, durch die ein Signal auf
viele weitere Stellen verteilt werden kann. Auch hier
wird ein Hub gebildet, wo unterschiedliche Bereiche
die unterschiedlichen Signale integrieren.
Durch die Silencer- oder Insulator-Aktivitt dieser
Proteine kommt es dann zum Silencing der
umgebenden DNA-Bereiche. Gleichzeitig sorgt die
LCR dafr, dass bestimmte Gene in diesen Bereichen
aktiviert werden knnen, indem sie festlegt, mit
welchem Enhancer in diesem Bereich sie interagiert.
Diese Interaktion mit den Enhancern dieses Bereichs
legt fest, welche Gene aktivierbar sind.
Ein Beispiel hierfr sind die Hmoglobin-Gene, bei
denen es je nach Entwicklungsstadium des
Organismus unterschiedliche Arten gibt. In den
jeweiligen Entwicklungsstadien werden durch solche
Hubs und LCR-Interaktionen nur die dafr bentigten
Gene aktiviert, die anderen sind stillgelegt.
Dabei halten spezielle Proteine den Hub der inaktiven
Gene zusammen, nmlich CTCF.
Die Silencer bilden durch Vernetzung mit CTCF einen
Hub, wodurch die LCR jetzt im aktiven Hub durch die Bindung eines Proteinkomplexes, der die
LCR mit dem Enhancer vernetzt, fr die Aktivierung des jeweiligen Gens sorgen kann.
Wie interagieren diese Hubs miteinander?
Bei dieser Interaktion, also der Bildung der Hubs mit ihren DNA-Schlaufen, sind offenbar
Cohesine wichtig, die eine Gruppe von Proteinen darstellen, die whrend der Mitose bentigt
werden, um die Schwesterchromatiden zusammenzuhalten.
Diese Cohesine knne auch dafr sorgen, dass die entsprechenden Stellen der Hubs miteinander
interagieren und die Schlaufen bilden knnen.
Bei der Differenzierung von T-Zellen mssen auch unterschiedliche Gene aktiviert werden, was
dadurch bewerkstelligt wird, dass diese Gene unter gemeinsame Kontrolle durch eine Locus
Control Region gebracht werden. Damit hier ein aktives Chromatin gebildet werden kann, helfen
die Cohesine durch Interaktion mit dem CTCF-Protein dabei, die entsprechenden Chromatin Hubs
zu bilden.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Um solche Hubs stillzulegen


oder zu aktivieren, ist es also
notwendig, dass entweder die
Silencing-Elemente
miteinander interagieren oder
die Locus Control Region mit
den
im
aktiven
Hub
vorhandenen Enhancern.
Damit diese Hubs gebildet
werden knnen, sind zwei
Proteine wichtig, CTCF durch
Bindung an die SilencingElemente und die Cohesine
(mglicherweise)
durch
direkte Interaktion mit CTCF.
Beim
Isolieren
von
stillgelegten und aktiven
Chromatin-Bereichen ist es
sehr wichtig, dass InsulatorElemente
auf
bestimmte
Weise modifiziert sind bzw.
bestimmte Proteine gebunden
haben, die insgesamt eine Art
Barrier Complex bilden. Der
Insulator-Bereich selbst ist
durch bestimmte Histon-Modifikationen charakterisiert. Der aktive Euchromatin-Bereich, der
dadurch abgetrennt wird, ist relativ stark acetyliert (an H3K4, 36 und 79). Der davon abgetrennte
Bereich ist z.B. durch H3K9-Methylierung und HP1-Bindung charakterisiert. Der Barrier-Komplex
des Isolator-Elements muss nun dafr sorgen, dass diese Modifikationsstrukturen einander nicht
invadieren.

Transcriptional
Memory
bedeutet,
dass
eine
epigenetische
Vererbung
eines
Transkriptionszustands erfolgt.
An dem Phnomen der Vererbung von negativen Transkriptionszustnden sind die PolycombGenexpression (Decker, Blsi)

79/97

Proteine (Pc-G) beteiligt, an der Vererbung von positiven Transkriptionszustnden die sogenannten
Trithorax-Proteine (Trx).
Trithorax assoziiert also mit stabil vererbbarer Genaktivitt, Polycomb mit stabil vererbbarer
Repression von Genen.
Was sind diese Polycomb-Proteine?
Aus ihnen werden PRC1- und PRC2-Komplexe
gebildet, die beide Reader-Proteine fr die H3K27Methylierung enthalten, der PRC2-Komplex enthlt
auerdem die Methylase Enhancer of Zest. Diese
Methylase kann selbst diese H3K27-Methylierung
vornehmen,
sie
kann
diesen
repressiven
Chromatinzustand also auch propagieren und dafr
sorgen, dass sich dieser weiter fortsetzt.
Das PRC2 erkennt zunchst das H3K27 und methyliert
es, das PRC1 erkennt dann mit seiner Chromodomne
diesen Zustand und bindet daran- Daraufhin fhren beide
Komplexe zusammen, wenn sie ber das trimethylierte
K27 gebunden sind, weitere Chromatin-Modifikationen
wie z.B. die Ubiquitinierung von H2 ein, die insgesamt
den reprimierten Zustand des in der Nachbarschaft
liegenden Chromatins bewirken.
Zelldifferenzierung bedeutet nichts anderes als dass es
eine totipotente Stammzelle gibt, von der aus alle
Differenzierungsrichtungen mglich sind. Wenn diese
Stammzelle
differenziert,
bedeutet
das,
dass
fortschreitend immer mehr Gene permanent abgeschaltet
und andere permanent angeschaltet werden. Es handelt
sich dabei also genau um diese epigenetische Vererbung
eines transkriptionellen Zustands.

Auch bei den Trithorax-Proteinen ist es so, dass sie eher an permissives Chromatin binden und
diesen an sich schon permissiven Zustand fixieren.
Genexpression (Decker, Blsi)

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In aller Regel erfolgt der bergang von restriktivem zu permissivem Chromatin nicht schlagartig,
die zuerst vorherrschende Situation muss allmhlich aufgegeben werden, so dass das Chromatin so
modifiziert wird, dass die fr den jeweils anderen Zustand zustndigen Proteine binden und dafr
sorgen knnen, dass der neue Zustand fixiert wird.
Es gibt Ereignisse, auf die alle Zellen reagieren knnen mssen wie z.B. Infektionen oder
bestimmte metabolische Zustnde, das muss aber nicht permanent mglich sein.
Wie macht man in der DNA eine Sequenz erkennbar, die spter einmal als Enhancer agieren soll?
Bereits bei der Differenzierung der Stammzellen wird das Chromatin im Bereich von Enhancern,
die spter Genaktivitt vermitteln sollen (z.B. der fr das Dihydrotestosteron-Gen), anders
modifiziert als in den benachbarten Bereichen, es bekommt eine Enahncer-Signatur. Diese Signatur
besteht daraus, dass dort sehr oft die varianten Histone H3.3 und H2A.Z vorkommen und dass das
Nucleosom auch modifiziert ist, nmlich vor allem durch die Mono- oder Dimethylierung von
H3K4.
Der nchste Schritt fr die Aktivierung des Enhancers ist, dass der an den Enhancer bindende
Transkriptionsfaktor tatschlich aktiviert wird und dass die Nucleosomen in diesem Bereich
modelliert werden, so dass alle dafr bentigten Transkriptionsfaktoren auch wirklich binden
knnen.
Voraussetzung dafr ist aber eben, dass der Enhancer bereits whrend der Differenzierung der Zelle
epigenetisch durch eine Chromatin-Signatur markiert wird.
Was knnen Transkriptionsfaktoren?
Sie knnen direkten Einfluss auf die Initiation nehmen, indem sie mit den TFIID- und MediatorKomplexen interagieren und so direkten Einfluss auf die Rekrutierung der RNA-Polymerase
nehmen.
Sie knnen auch die Elongation regulieren, z.B. der Heat-shock Stimulating Factor (HSF), wobei
der Initiationskomplex am Promoter bereits gebildet ist, aber die RNA-Polymerase pausiert. Hier
sorgt der Transkriptionsfaktor fr die Rekrutierung von pTEFb, damit fr die Ser2Phosphorylierung und die Aufhebung des Elongationsblocks durch DSIF und NELF.
Sie knnen auch Einfluss auf die DNA-Struktur nehmen, wobei diese Proteine nicht mehr die
klassische Zusammensetzung aus DNA-bindender und Transaktivierender Domne besitzen, hier
werden Transkriptionsfaktoren etwas allgemeiner als mit der DNA oder dem Chromatin
interagierende Proteine, die dadurch Einfluss auf die Transkription nehmen knnen, definiert. In
diesem Fall gehren auch die HMG-Proteine (HMG high mobility group) dazu, die fr die
Krmmung von DNA und die Bildung von Enhanceosomen wichtig sein knnen, aber auch die
Proteine, die fr die Bildung von Chromatin Hubs verantwortlich sind, also CTCF und Cohesine.
Sie knnen auch das Chromatin verndern, sie knnen durch Assoziation mit Komplexen von
Histon-modifizierenden oder -demodifizierenden Enzymen Einfluss auf die Modifikation von
Histonen nehmen, sie knnen Histon-Remodeling-Komplexe rekrutieren, sie knnen
Aktivatorkomplexe bilden oder auch Silencing-Komplexe.
Ein klassischer Transkriptionsfaktor muss eine DNA-bindende Domne (DBD) und in der Regel
eine Dimerisierungsdomne besitzen, was ihn aber eigentlich zum Transkriptionsfaktor im engeren
Sinne macht, ist die Transaktivierenden Domne (TAD).
Was ist die Aufgabe der Transaktivierenden Domne?
Sie kann mit TAFs (TBP-associated Factors), sie kann bei der Rekrutierung von pTEFb helfen, sie
kann aber auch mit Komplexen, die Einfluss auf die Chromatinstruktur nehmen, interagieren, sie
kann nmlich dafr sorgen, dass die Modifikation der Histone einem transkriptionell aktiven
Bereich entspricht oder auch einem transkriptionell inaktiven Bereich.
Genexpression (Decker, Blsi)

81/97

Repressoren sind die Umkehr der Aktivatoren, man kann sie


sich als Proteine vorstellen, die einfach die Bindung eines
Aktivators verhindern und zwar dadurch, dass sie mit diesen
um die DNA-Bindungsstelle kompetitieren. Es kann aber auch
sein, dass Repressor und Aktivator gleichzeitig gebunden sind,
der Repressor aber mit dem Aktivator auf eine Weise
interagiert, dass der Aktivator inaktiv wird.
Repressoren knnen auch mit Mediator interagieren und zwar
so, dass der Mediator dann die Initiation der Transkription
inhibiert.
Der Repressor kann natrlich auch die Modifikation der
Histone, die der Aktivator positiv beeinflusst, negativ
beeinflussen. An Stellen, wo der Aktivator z.B. eine HistonAcetyltransferase an das Chromatin bringt und es dadurch
permissiv macht, bringt der Repressor Histon-Deacetylasen
ans Chromatin und macht diese Permissivitt wieder
rckgngig.

7. Vorlesung (11.05.2012):
Genregulation durch DNA-Methylierung:
DNA-Methylierung bei Sugerzellen betrifft ausschlielich Cytosine und erfolgt an C5. Es wird
dabei auch wieder nicht jede beliebige Cytosin-Base
methyliert, das passiert nur, wenn auf dieses Cytosin ein
Guanin folgt (CpG).
Die meisten dieser C-Nucleotide in Sugergenomen in CpGAbfolgen sind methyliert, eine Ausnahme hierzu sind die
sogenannten CpG-Islands. Das sind am Promoter und
allgemein am 5'-Ende eines Gens gelegene Hufungen dieser
CpG-Nucleotide. Diese sind sehr oft nicht methyliert.
Die Methylierung korreliert oft, aber nicht immer mit transkriptionell inaktiver DNA und stellt eine
Mglichkeit zum Silencing von Genen dar.
Die DNA-Methylierung ist meistens epigenetisch, wird also verwendet, wenn ein Gen dauerhaft, oft
fr immer und grundstzlich, abgeschaltet werden soll.
Eine Gruppe von Genen, bei denen DNA-Methylierung eine wichtige Rolle spielt, sind Imprinted
Genes.
Imprinted Genes sind Gene, deren Expression entweder auf das maternale oder das paternale
Genom beschrnkt ist.
Jeder diploide Organismus besitzt eine Kopie des maternalen und eine des paternalen Genoms,
wobei es in aller Regel so ist, dass Allele unabhngig von ihrer elterlichen Herkunft exprimiert
werden.
Bei den Imprinted Genes wird hingegen immer nur eines der beiden Allele abgelesen, wobei es je
nach Gen unterschiedlich ist, ob es sich dabei um das maternale oder das paternale Gen handelt.
Es gibt also eine Gruppe von Genen, bei denen festgelegt wird, ob im entstehenden Organismus die
Genexpression (Decker, Blsi)

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vterliche oder die mtterliche Kopie des Gens exprimiert wird. Dabei spielt die DNAMethylierung eine wesentliche Rolle.
Eine andere wichtige Funktion der DNA-Methylierung stellt die Stilllegung von Fremd-DNA im
Genom dar.
Fremd-DNA kann z.B. retrovirale DNA, retrotransposale DNA, also mobile Elemente im Genom,
oder auch transgene DNA sein und wird sehr oft durch DNA-Methylierung stillgelegt, was
besonders bei mobilen Elementen, die in den meisten Sugergenomen vorkommen, wichtig ist. Bei
Knock-out-Musen der entsprechenden Methylase konnte beobachtet werden, dass es bei
Verhinderung der DNA-Methylierung zu einem gehuften Herumspringen dieser Elemente kommt.
Ist die DNA-Methylierung reversibel?
Methylierungen werden im groen Mastab nur einmal rckgngig gemacht, nmlich in der
Keimbahn bei der Entstehung neuer Gonaden (Keimzellen) im Embryo. Hier wird das
Methylierungsmuster der DNA gelscht, ansonsten ist DNA-Methylierung ein relativ stabiles
regulatorisches Prinzip, es gibt nur wenige Ausnahmen, bei denen die DNA-Methylierung zum
reversiblen Gene Silencing bei Differenzierungsvorgngen dient (z.B. beim IL-2-Gen bei TLymphocyten).
Die Enzyme, die die DNA-Methylierungen vornehmen, heien DNA-Methyltransferasen
(DNMT).
Man unterscheidet zwei Arten von Methylasen zur DNAMethylierung:
De novo-Methylasen: sind dafr verantwortlich, dass
ein Methylierungsmuster auf der DNA etabliert wird, sie
methylieren also dort, wo auch am Gegenstrang noch
keine Methylierung vorhanden ist
Maintenance-Methylasen: sorgen bei Vorhandensein
eines Methylierungsmusters dafr, dass dieses auf
Tochterzellen bertragen wird, wobei sie stark von der
semikonservativen Replikation der DNA profitieren

Genexpression (Decker, Blsi)

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Im Bereich des Transkriptionsstarts (kann oberhalb oder unterhalb des Transkriptionsstarts oder
auch im ersten Intron des Gens sein) gibt es vor allem in den sogenannten Housekeeping Genes
CpG-Islands. Diese CpG-Islands sind wichtig fr eine relativ permanente Transkription dieser
Gene, die allgemein relativ wenig reguliert werden. Die Islands werden dabei fr die Assoziation
von Transkriptionsfaktoren, die dafr sorgen, dass diese Gene permanent angeschaltet sind.
Man kann solche Gene mit CpG-Islands aber auch stilllegen, indem man diese methyliert. Die
Methylierung von CpG-Islands ist ein relativ seltener Prozess, wenn er stattfindet, bedeutet das aber
meist ein permanentes Silencing des betreffenden Gens.
Wie wird ein Gen durch DNA-Methylierung stillgelegt?
Es gibt Flle, wo Transkriptionsfaktoren einfach nicht mehr an die DNA binden knnen, wenn die
Cytosine in der Bindungsstelle methyliert sind.
Die andere Mglichkeit ist, dass Methyl-Cytosine durch die Methyl-Cytosin-bindenden Proteine
MeCP1 und MeCP2 erkannt werden knnen.
MeCP2 ist in der Lage, den Sin3A-Komplex an das Chromatin zu bringen, der eine HistonDeacetylase (HDAC) enthlt. Dadurch werden die umgebenden Histone deacetyliert, was das
Chromatin an dieser Stelle transkriptionsunfreundlich macht.
Die Funktion von MeCP1 ist nicht die Rekrutierung von Histon-modifizierenden
Proteinkomplexen, sondern es blockiert wichtige Bindungsstellen z.B. im Bereich der
Initiationsstelle eines Gens.
Technisch fhrt die DNA-Methylierung auerdem sehr oft dazu, dass ein kompakteres Chromatin
gebildet wird, was durch DNAseI-Verdau getestet werden kann.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Dort, wo das Chromatin stark aufgelockert vorliegt oder in Bereichen von aktiven Enhancern gibt
es teilweise gar keine Nucleosomen mehr.
Bei Zugabe von DNAseI zu Zellkernextrakten schneidet diese vorwiegend in solchen
aufgelockerten Bereichen des Chromatins, weshalb diese auch DNAseI-hypersensitive Sites
genannt werden.
Der Effekt der DNA-Methylierung kann an solchen Stellen dadurch beobachtet werden, dass das
Chromatin an dieser Stelle kompakt wird und die DNA dort aufhrt, hypersensitiv gegenber dem
Verdau durch DNAseI zu sein.
Das Verfahren, mit dem das untersucht wird, nennt man DNAseI Hypersensitivity Mapping.
Genetic Imprinting wurde durch Experimente entdeckt, wo die beiden Zellkerne einer fertilisierten
Eizelle vor deren Verschmelzung entfernt und durch Kerne, die
entweder aus einer nicht fertilisierten Eizelle oder einem
Spermium gewonnen wurden, ersetzt wurden. Das wurde so
durchgefhrt, dass einmal zwei Eizellenkerne, einmal zwei
Spermienkerne und einmal je einer in diese leere Eizellenhlle
eingebracht wurden. Diese rekonstruierte Eizelle mit den zwei
Genomen wurde in Muse implantiert und die Entwicklung der
Embryos abgewartet. Dabei wurde festgestellt, dass nie
Embryonen erhalten werden knnen, wenn die Eizelle
gynogenetisch
(2
weibliche Zellkerne)
oder androgenetisch
(2
mnnliche
Zellkerne) ist.
So wurde festgestellt, dass mnnliche und weibliche
Genome also nicht vollstndig quivalent sind, sie haben
einen Abdruck (Imprint), der sie eindeutig als mnnlich
oder weiblich erkennbar macht. DNA-Methylierung
wurde dann spter als wichtiger Faktor dabei erkannt.
Mittlerweile sind mehrere Hundert solcher Imprinted
Genes bekannt, wobei eine relativ groe Gruppe solcher
Gene mit Wachstumsregulation zu tun haben.
Wachstumsregulation ist etwas, das in der richtigen
Gendosis reguliert werden muss, sowohl fehlende als
auch zu hohe Aktivitt bewirkt hier in der Regel eine
Strung der Homostase des Organismus und es kommt
zu Abnormalitten.
Wann geschieht das Imprinting?
Der Imprint wird bei der Fertilisation etabliert, also
schon in der Eizelle kommen zwei Genome zusammen,
die imprinted sind. Nun gibt es also ein mnnliches und
ein weibliches Genom, aus dem Keimzellen gebildet
werden knnen, es soll aber nur der jeweils auf das
eigene Geschlecht des Organismus bezogene Imprint
weitergegeben werden, da ja immer nur eine Art von
Gameten gebildet wird, entweder Spermien oder
Eizellen. Kurz vor der Bildung der Keimzellen, was ja
Genexpression (Decker, Blsi)

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bereits whrend der Embryogenese erfolgt, muss der existierende, von den Eltern weitergegebene
1st Generation Imprint gezielt nur in den Gonaden entfernt werden. Die Gonaden erhalten
schlielich explizite Signale, entweder nur weibliche oder nur mnnliche 2 nd Generation Imprints zu
etablieren. Dabei kommen die De-novo-Methylasen zum Einsatz.
Was ist der Zusammenhang zwischen DNA-Methylierung und Genexpression?
Dieser Zusammenhang ist bei dem Locus, der die beiden Imprinted Genes H19 und Igf2 (Igf
Insulin-like Growth Factor).
H19 ist kein protein-codierendes Gen, sondern codiert fr eine non-coding RNA (ncRNA), deren
Funktion bisher nicht bekannt ist, Igf2 hat eindeutig eine wachstumsregulierende Funktion.
H19 wird nur vom weiblichen Allel, Igf2 nur vom mnnlichen Allel abgelesen.
Fr die Expression sind zwei regulatorische Stellen wichtig, einerseits das Imprinting Control
Element (ICE) und andererseits ein Enhancer, der unterhalb beider Gene liegt, aber beide Gene
aktivieren kann.
Ist die DNA im Bereich des ICE methyliert, kann der Enhancer nicht auf das H19-Gen wirken,
sondern nur auf das Igf2-Gen. Ist das ICE nicht methyliert, bindet dort das CTCF-Protein, das
besonders fr sogenannte Long-range Interactions wichtig ist. Ist CTCF am ICE gebunden,
blockiert es die Fhigkeit des Enhancers, auf das Igf2-Gen zu wirken und das H19-Gen wird
exprimiert. Es gibt also eine paternal-spezifische Methylierung des Kontrollelements.
Hierzu existiert allerdings ein zweites Modell, das besagt, dass bei der Regulation von Imprinted
Genes auch eine ncRNA wichtig ist, nmlich die Air-ncRNA, die von diesem Kontrollelement aus
gebildet werden kann. Man vermutet, dass diese Air-ncRNA im paternalen Genom fr das Silencing
von nur maternal exprimierten Genen verantwortlich ist.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Diesen Wechsel zwischen der Expression des Igf2-Gens


und der des H19-Gens erklrt man sich zur Zeit so, dass
dabei die Bildung dreidimensionaler Chromatin Hubs
eine Rolle spielen.
Ist CTCF nicht an die Imprinting Control Region (ICR
=ICE) gebunden, kommt es zur Bildung einer DNASchlaufe, durch die die Enhancer der Gene in die Nhe
des Igf2-Gens gebracht werden und dieses zur Expression
bringen.
Ist nun CTCF an die ICR gebunden, wird diese EnhancerSchlaufe so verschoben, dass die Enhancer mit dem H19Gen interagieren und dieses zur Expression bringen.
Gleichzeitig wird durch diese Interaktion verhindert, dass
Igf2 exprimiert werden kann.
Dass CTCF (nach neuesten Erkenntnissen gemeinsam mit
Cohesinen) ein sehr wichtiger Faktor bei der Interaktion
relativ entfernt liegender DNA-Bereiche ist und zwischen
alternativen Mglichkeiten der Bildung solcher DNASchlaufen unterscheiden kann, wird mittlerweile als
relativ gesichert angenommen.
Man kann in Sugern knstlich eine Art Parthenogenese
betreiben.
Parthenogenese bedeutet, dass sich eine Eizelle ohne mnnliches Zutun entwickeln kann. Das kann
in Musen knstlich erzeugt werden, indem man zunchst einer normalen Eizelle einen Nucleus
einer unreifen Eizelle hinzufgt. In dieser unreifen Eizelle mssen zwei Voraussetzungen erfllt
sein: sie darf noch nicht imprinted sein und die ICEs von mindestens zwei paternal imprintierten
Genen mssen entfernt werden, um zu verhindern, dass diese Gene abgeschaltet werden knnen.
Diese Gene werden dann auch im weiblichen Organismus exprimiert.
So erhlt man eine sich entwickelnde Eizelle, die zwei maternale Genomkopien enthlt, woraus
eine sogenannte bi-maternale Maus entsteht.
Aktivierung von Transkriptionsfaktoren:
Wie regulieren Zellen, ob und wann solche bisher besprochenen Proteine, die die DNA-Struktur
beeinflussen, vorhanden sind?
Grundstzlich gibt es dabei folgende Mechanismen:
Transkriptionsfaktoren werden erst synthetisiert, wenn sie gebraucht werden, und sind dann
auch sofort aktiv
In den meisten Fllen ist es so, dass die Transkriptionsfaktoren immer vorhanden, aber nicht
immer aktiv sind. In diesem Fall wird eine Mglichkeit bentigt, zwischen aktiven und
inaktiven Zustnden zu unterscheiden, was sehr hufig durch Phosphorylierung
bewerkstelligt wird. Meistens ist dabei die phosphorylierte Form die aktive Form, es gibt
aber durchaus auch den umgekehrten Fall.
Auch Proteolyse spielt bei der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle.
Dabei gibt es 3 Mglichkeiten:
die Stabilitt des Transkriptionsfaktors wird proteolytisch reguliert
ein zunchst vorhandener Inhibitor des Transkriptionsfaktors wird proteolytisch
abgebaut, wenn der Transkriptionsfaktor gebraucht wird
Genexpression (Decker, Blsi)

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der Transkriptionsfaktor wird zunchst als inaktive Vorstufe gebildet, aus der durch
Proteolyse die aktive Form generiert wird.
Ein weiterer wichtiger Begriff beim Regulieren von Transkriptionsfaktor-Aktivitten ist
Partnertausch bzw. das Gewinnen oder Verlieren von Partnern.
Auerdem gibt es die sogenannten Nuclear Hormone Receptors, die intrazellulre Liganden
binden, und gleichzeitig auch Transkriptionsfaktoren sind.
Das Gal1-Gen in Hefe, das durch den Gal4-Transkriptionsfaktor reguliert wird, ist ein Beispiel fr
die Bedeutung von Partnern.
In diesem Gal1-Gen knnen drei Zustnde unterschieden werden:
Das Gen ist permanent abgeschaltet, was dadurch geschieht, dass der Transkriptionsfaktor
Mig1 an seine Bindungsstelle bindet und dann einen Tup1-Histon-Deacetylase-Komplex
rekrutiert, woraufhin das Chromatin deacetyliert und damit transkriptionsunfreundlicher
wird.
Gal4 ist gebunden, kann aber seine Aktivitt nicht entfalten, weil das Partnerprotein Gal80
daran bindet, wodurch die Transaktivierende Domne von Gal4 maskiert wird. Bei
Vorhandensein von Galactose sorgt diese dafr, dass Gal80 im Cytoplasma festgehalten
wird und Gal4 kann seine Funktion als Transkriptionsfaktor ausben.
Gal4 ist gebunden und aktiv
Eine weitere Mglichkeit ist, dass Partnertausch wichtig ist, das findet man oft bei Proteinen der
basic Helix-Loop-Helix (bHLH) Familie.
Die Basic Region ist eine Ansammlung von basischen, also positiv geladenen Aminosuren, die zur
Bindung an die DNA bentigt wird, das Helix-Loop-Helix-Motiv ist fr die Dimerisierung
verantwortlich.
Die Mitglieder dieser Proteinfamilie knnen sowohl Homodimere als auch Heterodimere bilden,
was oft darber entscheidet, ob dieses Dimer transkriptionell aktiv ist oder nicht.
Ein Beispiel fr diesen Mechanismus ist
der Transkriptionsfaktor MyoD, der fr die
Differenzierung
von
Muskelzellen
gebraucht wird. Dieser muss also weder vor
noch nach der Differenzierung aktiv sein,
sondern nur whrenddessen.
Das kann dadurch reguliert werden, dass
aktive Dimere gebildet werden, also solche,
bei dem MyoD mit einem Protein aus der
gleichen Familie interagiert, nmlich
entweder E12 oder Ac-S. Wichtig dabei ist,
dass beide Komponenten des dabei
gebildeten Heterodimers sowohl die HelixLoop-Helix-Struktur fr die Dimerisierung
als auch eine Basic Region als DNAbindende Domne besitzen, es knnen also
beide Partner zur DNA-Bindung beitragen.
Wenn die Differenzierung abgeschlossen
ist, wird in den differenzierten Zellen das Id-Protein hochreguliert, wobei Id fr Inhibitor of MyoD
steht. Id bildet mit MyoD Heterodimere, bei denen zwar auch beide Partner die Helix-Loop-HelixRegion fr die Dimerisierung besitzen, dem Id fehlt aber die Basic Region fr die DNA-Bindung.
Dadurch wird das Heterodimer inkompetent fr DNA-Bindung, weil diese nur dann mit
ausreichender Affinitt erfolgt, wenn beide Dimerisierungspartner ber eine Basic Region verfgen.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Die prominenteste Phosphorylierungskaskade ist die sogenannte MAP-Kinase-Kaskade, die


dadurch gestartet wird, dass Rezeptor-Tyrosinkinasen, die in aller Regel irgendwelche
Wachstumsfaktoren binden, in die Lage versetzt werden, mithilfe der Proteine Grb2 und SOS die
Ras-GTPase zu binden. Durch die Aktivitt von SOS wird dafr gesorgt, dass das Ras-Protein
durch Austausch von GDP gegen GTP aktiviert wird.
Ist Ras aktiv, hat es die Fhigkeit, den MAP-Kinase-Pathway zu starten, der klassischerweise aus
der MAP3-Kinase Raf, der MAP2-Kinase Mek und der MAP-Kinase besteht.
Bei dieser Kaskade wird also erst die MAP3-Kinase Raf von der aktiven Ras-GTPase rekrutiert,
gebunden und dadurch aktiviert, worauf zwei Phosphorylierungsschritte folgen, die die MAP2Kinase und die MAP-Kinase konstitutiv aktivieren.

Hat man nun ein Gen, das durch Wachstumsfaktoren reguliert wird,
sind dort die zwei Transkriptionsfaktoren gebunden, der Serum
Response Factor (Srf) und Elk1.
Ist die Transaktivierende Domne (TAD) von Elk1 nicht
phosphoryliert, knnen an den Promoter des Gens zwar TFIID und
TFIIA binden, der Rest des Initiationskomplexes nicht.
Das entscheidende Ereignis ist jetzt also die Phosphorylierung der
TAD von Elk1, wodurch Elk1 die Fhigkeit erhlt, mit Mediator zu
interagieren, was zur vollstndigen Assemblierung des
Initiationskomplexes fhrt.
Die hier aktiven MAP-Kinasen werden als Extracellular-signal
Regulated Kinases (ERK) bezeichnet.
Es gibt mehrere MAP-Kinase-Wege, die bei der Transkription auch
kooperieren knnen.
Eines der Gene, die durch Srf und Elk1 angeschaltet werden, ist das
cFos-Gen. CFos ist ein Leucine-Zipper-Protein, also eine
Untereinheit eines Transkriptionsfaktors, die gebraucht wird, um
den dimeren Transkriptionsfaktor AP-1 zu bilden.
AP-1 ist immer ein Heterodimer aus einem Protein der Fos-Familie
und cJun. Beide sind Leucine-Zipper-Proteine mit Basic Region
und beide sind nur als Heterodimer aktiv.
Das aktive cJun kommt durch einen kooperierenden
Signaltransduktionsweg, nmlich den sogenannten Stressaktivierten MAP-Kinase-Weg, zustande. Dabei sind die cJunGenexpression (Decker, Blsi)

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Kinasen aktiv, die aktiviert werden, wenn die Zelle Stress ausgesetzt ist. Daraufhin wird cJun von
diesen phosphoryliert, das dadurch dann in der Lage ist, mit Fos-Proteinen zu interagieren und man
erhlt den aktiven AP-1-Transkriptionsfaktor.
Die hier aktiven MAP-Kinasen werden als cJun N-terminal Kinases (JNK) oder Stress-activated
Phosphokinases (SAPK) bezeichnet.
Die Genregulation durch cAMP ist ein weiteres Beispiel dafr, dass letztlich ein
Transkriptionsfaktor durch Phosphorylierung die Fhigkeit erhlt, Chromatin-modifizierende
Enzyme an den Promoter zu bringen.
Cyclo-AMP ist ein zyklisches 3'-5'-Phosphat von ATP, das durch das
Enzym Adenylylcyclase gebildet wird. Adenylylcyclase wird sehr oft
unter dem Einfluss von sogenannten Seven-Transmembrane-Receptors
(7TM receptors) aktiviert. Diese 7TM-Rezeptoren gehen mit jeweils
einem helikalen Bereich 7-mal durch die Membran hindurch und werden
auch als G-coupled Receptors bezeichnet. Das liegt daran, dass die
Signaltransduktion dadurch erfolgt, dass diese Rezeptoren sogenannte
trimere G-Proteine binden, die groe GTPasen darstellen. Das Resultat
davon ist, dass bei den sogenannten stimulatorischen Rezeptoren dieser
Familie das G-Protein die Fhigkeit erhlt, an die Adenylylcyclase zu
binden, die dadurch aktiviert wird und beginnt, cAMP zu synthetisieren. Das cAMP bindet dann an
die sogenannte regulatorische Untereinheit der Proteinkinase A (PKA), die manchmal auch als
cAMP-stimulierte Proteinkinase (cAPK) bezeichnet wird.
PKA hat zwei katalytische und zwei regulatorische Untereinheiten, wobei die regulatorischen
jeweils zwei cAMP-Molekle binden knnen. Die Bindung des cAMPs fhrt dazu, dass die
katalytischen Untereinheiten abdissoziieren, in den Zellkern wandern und dort den
Transkriptionsfaktor
CREB
(cAMP-responsive
element
(CRE)-binding
protein)
phosphorylieren.
CREB ist wie Elk1 permanent an die DNA gebunden, erhlt aber erst durch die Phosphorylierung
seiner TAD die Fhigkeit, den Coaktivator CBP (CREB-binding protein) oder P300 (haben
quivalente Funktion) zu binden. Bei diesen Coaktivatoren handelt es sich um HistonAcetyltransferasen (HATs), die dann ber Histon-Modifikation und eventuell auch andere
Aktivitten fr das Transkriptionsereignis sorgen.

Genexpression (Decker, Blsi)

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Eine etwas andere Konsequenz der Phosphorylierung kann beim sogenannten JAK/STATSignaltransduktionsweg beobachtet werden.
Hier sind die Rezeptoren selbst keine Enzyme, sie sind aber mit Tyrosin-Proteinkinasen, den
sogenannten Janus-Kinasen (JAKs) assoziiert.
Wenn ein Cytokin-Rezeptor ein Cytokin bindet, wird ein Komplex aus den Rezeptorketten und den
Janus-Kinasen gebildet. Die JAKs knnen in dieser Konformation des Rezeptors die Rezeptorketten
an Tyrosin phosphorylieren. Diese Tyrosin-phosphorylierten Rezeptoren knnen jetzt durch STATTranskriptionsfaktoren erkannt werden, da die STATs eine SH2-Domne besitzen, mit der eben
Tyrosin-phosphorylierte Proteine gebunden werden knnen (STAT Signal Transducers and
Activators of Transcription).
Als nchstes werden die STATs von den JAKs selbst Tyrosin-phosphoryliert, woraufhin sie sich
vom Rezeptor ablsen und Dimere bilden, indem das Phosphotyrosin des einen Partners von der
SH2-Domne des anderen Partners erkannt wird und umgekehrt.
Im aktiven Dimer eines STAT-Transkriptionsfaktors gibt es also zwei Phosphotyrosin-SH2Domne-Interaktionen, die es zusammenhalten.
Nur das STAT-Dimer kann in den Zellkern gelangen und an die DNA binden.
Die STAT-Transkriptionsfaktoren sind die einzigen Transkriptionsfaktoren, die durch TyrosinPhosphorylierung aktiviert werden. Die Konsequenz der Tyrosin-Phosphorylierung ist in diesem
Fall keine nderung des transaktivierenden Potentials dieser Transkriptionsfaktoren, sondern die
Dimerisierung und damit die Fhigkeit in den Zellkern zu gelangen.

Eine gewisse Variation dieses Systems zeigt der SMAD-Signaltransduktionsweg, wo es im


Endeffekt zur Aktivierung von SMAD-Transkriptionsfaktoren kommt (SMAD Kombination aus
den Namen der homologen Gene in C. Elegans (Sma) und Drosophila (Mad = Mothers Against
Decapentaplegic)).
Dieser Signaltransduktionsweg ist wichtig fr Rezeptoren der TGF-Familie, die eine Familie von
Proteinliganden darstellen, die man eigentlich auch als Cytokine bezeichnen kann, die aber sehr
unterschiedliche Vorgnge regulieren wie z.B. Zellwachstum, Zellaktivierung oder
Immunsuppression, sie sind aber auch wichtige Morphogene whrend der Entwicklung, also
Regulatoren der Differenzierung von Zellen und Geweben whrend der Embryonalentwicklung. Es
handelt sich bei ihnen um eine sehr weit verbreitete und funktionell sehr heterogene Proteinfamilie.
Alle TGF-Familienmitglieder binden an einen Zelloberflchenrezeptor, der aus zwei Ketten
besteht, die als Typ I- und Typ II-TGF-Rezeptoren bezeichnet werden.
Der Signaltransduktionsweg erfolgt so, dass TGF an den Typ II-Rezeptor bindet, der dadurch die
Fhigkeit erhlt, an den Typ I-Rezeptor zu binden. Im Komplex erhlt der Typ I-Rezeptor dann die
Fhigkeit, ein SMAD-Protein an einem Serin zu phosphorylieren.

Genexpression (Decker, Blsi)

91/97

Man unterscheidet bei den SMADProteinen zwei Typen, die R-SMADs


und die S- bzw. C-SMADs.
Die R-SMADs (R Regulatory)
sind
diejenigen
SMADs,
die
tatschlich an den Rezeptorkomplex
binden und dort phosphoryliert
werden.
SMAD4 ist das sogenannte Common
SMAD und wird immer als
Dimerisierungspartner
gebraucht.
Auch hier ist es letztlich die
Dimerisierung, die reguliert wird,
nmlich durch die Phosphorylierung
des R-SMADs.
Wie kann man NFB aktivieren?
Der Transkriptionsfaktor selbst besteht aus zwei Untereinheiten mit den Molekulargewichten von
50 und 65 kDa, die als p50 und p65 bezeichnet werden und gemeinsam das aktive Heterodimer
bilden.
In ruhenden Zellen, also solchen,
die keinen Stimulus fr die
Aktivierung von NFB erhalten
haben,
ist
dieses
p50/p65Heterodimer mit der inhibitorischen
Untereinheit Inhibitory B (IB)
verbunden.
Zur Aktivierung von NFB muss
ein
sogenannter
IBKinasekomplex (IKK) aktiviert
werden. Die Stimuli, die NFB
aktivieren, tun das zunchst durch
die Aktivierung dieses IBKinasekomplexes.
Dieser
phosphoryliert daraufhin IB, was
zur Ubiquitinierung von IB und
somit zum Abbau von IB durch
das Proteasom fhrt. Dadurch liegt
nun ein freies p50/p65-Heterodimer
vor,
in
dem
eine
Kerntranslokationssequenz
(Nuclear Localisation Signal)
enthalten
ist,
was
eine
Aminosuresequenz darstellt, die bentigt wird, damit ein Protein in den Nucleus einwandern kann.
Diese wird im Normalfall durch IB maskiert. Bei Abbau von IB wird die Tranlokationssequenz
frei und NFB kann in den Zellkern gebracht werden und wird dort transkriptionell aktiv.
Es gibt auch einen alternativen NFB-Pathway, wo die eine Untereinheit mit der Vorstufe der
anderen Untereinheit komplexiert ist, IB fehlt. In diesem Fall erfolgt die Aktivierung durch
proteolytischen Verdau, durch den wiederum das Nuclear Localisation Signal freigelegt wird.
Rezeptoren knnen den einen oder den anderen Pathway bevorzugen.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Die
Abschaltung
dieses
Signaltransduktionswegs
erfolgt
durch
klassisches Feedback. Feedback bedeutet
immer, dass ein Signal selbst etwas tut, was
dafr sorgt, dass es zur Verstrkung oder zur
Abschwchung des Signals kommt.
Im Fall des NFB-Pathways kommt es zu
negativem
Feedback,
also
zur
Abschwchung des Signals. Eines der
NFB-Zielgene ist IB, dieses wird also
zuerst abgebaut, damit NFB in den Zellkern
gelangen kann, wird dann aber durch die
Aktivitt von NFB wieder neu gebildet.
Sobald wieder genug IB vorhanden ist,
wird NFB durch dieses wieder inaktiviert.

Ein anderer Signaltransduktionsweg, der vor allem fr Zellwachstum und Entwicklung wichtig ist,
ist der sogenannte Wnt-Pathway.
In der Abbildung sind die roten Komponenten diejenigen, die aktiv sind, wenn der Pathway
abgeschaltet sind und die grnen diejenigen, die aktiv sind, wenn der Pathway angeschaltet ist.
Hier geht es darum , dass
eine
Familie
von
Rezeptoren, die als Frizzle
bezeichnet werden und die
sogenannten Wnt-Liganden
binden,
letztlich
den
TranskriptionsfaktorKomplex TCF (T-cell
Factor) aktivieren.
Um TCF aktivieren zu
knnen, bentigt man ein
Protein, das in diesem
Signaltransduktionsweg
eine zentrale Rolle spielt,
nmlich das -Catenin.
Dieses
-Catenin
ist
inhrent, wenn der Pathway
abgedreht ist, was bedeutet,
dass es zwar gebildet, aber
sofort wieder zerstrt wird. Zum Zerstren wird die Proteinkinase GSK3 bentigt, die als Komplex
mit mehreren anderen Proteinen vorliegt. GSK3 ist normalerweise aktiv und phosphoryliert Catenin, das daraufhin ubiquitiniert und in weiterer Folge durch das Proteasom abgebaut wird.
Sobald Frizzle seinen Liganden bindet, wird ein Komplex aktiviert, der das Protein Dishevelled
(Dsh) enthlt. Dieser Dsh-Komplex bindet an den GSK3-Komplex und inaktiviert ihn, wodurch Catenin nicht mehr phosphoryliert wird, sondern stabil bleibt und im Zellkern an einen Komplex,
der den Transkriptionsfaktor TCF enthlt, bindet. Das wiederum fhrt dazu, dass die negativen
Regulatoren der Transkription wie z.B. Groucho, also Proteine, die HDAC-Komplexe rekrutieren,
durch positive Cofaktoren ausgetauscht werden, die acetylierend wirken.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Ein weiteres Beispiel fr Proteolyse ist der Notch-Pathway, der


auch fr entwicklungsbiologische Prozesse, also die
Determinierung von Geweben und Organen, und im adulten
Organismus fr die Zelldifferenzierung wichtig ist.
Notch wurde erstmals bei der lateralen Inhibition von Zellen in
der Epidermis von Drosophila entdeckt. Drosophila besitzt in der
Epidermis Sinneszellen, die Borsten ausbilden. Nicht alle Zellen
in der Epidermis besitzen diese Borsten, sondern nur bestimmte,
nmlich die Neuroblasten. Da also nicht jede Zelle diese Borsten
bilden soll, sorgen die Neuroblasten dafr, dass die Zellen in ihrer
unmittelbaren Umgebung nicht zu Neuroblasten werden. Das tun
sie dadurch, dass sie einen Liganden fr den Notch-Rezeptor
bilden, der Delta genannt wird. Bindet Delta an den NotchRezeptor einer epidermalen Zelle, wird dort die Transformation
zum Neuroblasten verhindert.
Notch aktiviert also Gene, die die Neuroblasten-Differenzierung
verhindern,
wobei
die
wichtigste
Komponente
der
Transkriptionsfaktor Suppressor of Hairless (Su(H), humanes
Homolog = RBPj) ist, der einen Repressor der neuronalen Gene
aktiviert.
Unter dem Einfluss der Interaktion mit Delta wird im NotchRezeptor ein cytoplasmatisches Stck durch Proteolyse
abgeschnitten wird, das als NotchIC (IC intracellular)
bezeichnet wird. Dieses NotchIC
fungiert nun als
transkriptioneller Coaktivator fr Su(H), der daraufhin die
Expression eines neuronalen Repressors stimuliert.
Ein Beispiel fr Proteolyse, wo tatschlich die inaktive Vorstufe eines Transkriptionsfaktors
aktiviert wird, ist das Protein SREBP (Steroid Response Element (SRE)-binding Protein), das in
der Membran des Endoplasmatischen Reticulums sitzt.
Der biologische Kontext dieses Proteins ist die Regulation der Cholesterol-Synthese. Dafr gibt es
die ER-Sensorproteine, die die intrazellulre Menge an Cholesterol messen.
Diese Information wird dann auf Proteasen bertragen, die das Vorluferprotein von SREBP spalten
knnen. Ist wenig Cholesterol in der Zelle vorhanden, werden diese Proteasen aktiv und spalten
SREBP, wodurch aus dem membrangebundenen SREBPVorlufer ein SREBP-Transkriptionsfaktor (= bHLH-Protein)
freigesetzt wird, der in den Zellkern wandern und dort an
Steroid-Response Elements (SREs) binden kann. Diese liegen
in Promotoren von Genen, die dann sowohl die Aufnahme als
auch die Biosynthese von Cholesterol anschalten.
Ist viel Cholesterol in der Zelle vorhanden, bindet SREBP an
den Inhibitor SCAP (SREBP Cleavage Activating Protein),
der die Proteasen inhibiert. Ist wenig Cholesterol vorhanden,
interagiert SCAP nicht mehr mit SREBP und die Proteasen
knnen aktiv werden und den Transkriptionsfaktor freisetzen.
Es gibt hier zwei proteolytische Schritte, zuerst schneidet S1P
und trennt die beiden Transmembrandomnen voneinander,
danach schneidet S2P innerhalb der Transmembrandomne,
an der der eigentliche Transkriptionsfaktor hngt, und setzt
diesen frei.
Genexpression (Decker, Blsi)

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Nuclear Hormone Receptors:


Dabei handelt es sich um Transkriptionsfaktoren, die dadurch reguliert werden, dass sie selbst einen
Liganden binden. Diese Liganden sind lipophile Hormone, meistens Steroidhormone wie z.B.
Glucocorticoide ( GR), aber z.B. auch Vitamin D ( VDR) oder Retinsure ( RAR), die durch
die Zellmembran direkt in die Zelle gelangen und dort an ihre Nuclear Hormone Receptors binden.
Nuclear Hormone Receptors gehren zur Familie der Zinkfingerproteine, die als Homo- oder
Heterodimere an die DNA binden knnen, was je nach Rezeptor unterschiedlich ist. Wird ein
Heterodimer gebildet, ist der Partner immer das Familienmitglied RXR.
Die Interaktion mit dem Liganden kann im Cytoplasma erfolgen und sorgt dann erst dafr, dass der
Rezeptor in den Zellkern gelangt, es wird also die Kerntranslokation reguliert, in den meisten Fllen
ist der Rezeptor allerdings schon an die DNA gebunden, erhlt aber erst durch die Bindung seines
Liganden die Fhigkeit, die Transkription zu aktivieren.
Cholesterol (= Cholesterin), also ein stark lipophiles Molekl, stellt die
Grundstruktur der Steroidhormone dar.
Einige Beispiele fr Liganden von Nuclear Hormone Receptors:

Unter den Familienmitgliedern


dieser
Nuclear
Hormone
Receptors zeigen vor allem die
DNA-bindenden
Domnen
(Zinkfinger)
eine
hohe
Sequenzbereinstimmung von
42-94%, aber auch die
Hormon-bindenden Domnen
(LBD
=
Ligand-binding
Domain) sind untereinander
relativ hnlich mit einer
Sequenzidentitt von 15-57%.
Am N-Terminus existiert
zustzlich eine stark variable Region, wo keine bereinstimmungen in der Aminosuresequenz
beobachtet werden knnen und wo unter anderem auch eine Transaktivierende Domne liegt.
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Die Bindungsstellen fr heterodimere Nuclear Hormone


Receptors sind keine Inverted Repeats (Palindrome), sondern
Direct Repeats, die beiden Bindungsstellen der
Dimerisierungspartner liegen in einer direkten Abfolge vor
und nicht als rotationssymmetrische Sequenzen, wie es bei
Bindungsstellen fr Homodimere der Fall ist. Dadurch binden
die beiden Partner eines Heterodimers an dieselbe Seite der
DNA, whrend die von Homodimeren an die jeweils
gegenberliegenden Seiten der DNA gebunden werden.
Die Bindungsstellen fr Heterodimere besitzen alle die
gleiche DNA-Sequenz AGGTCA. Der entscheidende
Unterschied zwischen den Bindungsstellen der verschiedenen
Rezeptoren liegt in der Anzahl der Nucleotide, die zwischen
den beiden Bindungsstellen liegen.
Bei den Rezeptoren, die als Homodimere binden, ist dieses
sogenannte Spacing, also der Raum zwischen den
Bindungsstellen gleich, hier wird die Spezifitt durch die
Sequenz der Bindungsstellen festgelegt.
Ein Beispiel fr plasmatische Aktivierung ist der
Glucocorticoid-Rezeptor (GR).
Glucocorticoide sind wichtige Regulatoren des
Glucose-Stoffwechsels, aber z.B. auch von
Entzndungsreaktionen.
Der Rezeptor liegt in Abwesenheit von
Corticosteroiden (= Glucocorticoide) als
Komplex mit dem Heat-shock Protein 90
(Hsp90) vor.
Die Bindung eines Glucocorticoids an die
Liganden-bindende Domne (LBD) des
Rezeptors fhrt nun dazu, dass das Hsp90
wegdissoziiert. Dadurch erhlt der Rezeptor die Fhigkeit, in den Zellkern zu gelangen und dort an
sein Response Element zu binden.
Hufiger ist aber die Situation, dass die Rezeptoren bereits im Kern an die DNA gebunden
vorliegen, was vermutlich fr alle Heterodimere gilt.
In Abwesenheit seines Liganden hat der Rezeptor Komplexe gebunden, die Histon-Deacetylasen
(HDACs) enthalten und fr repressives Chromatin sorgen.
Der Ligand sorgt nun dafr, dass diese HDAC-Komplexe losgelassen werden und stattdessen HATKomplexe gebunden werden, die mit Chromatin Remodeling-Komplexen zusammenwirken und so
die Initiationsstelle des Gens freilegen. Interaktion mit Mediator sorgt zustzlich dafr, dass der
Kontakt zu den Initiationsfaktoren hergestellt wird und man erhlt letztlich einen aktiven Promoter.

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