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Teil 1 - Decker
1. Vorlesung:
Genexpression: = all das, was dazu fhrt, dass das, was in der DNA codiert ist, in eine Funktion
berfhrt wird.
Die Funktionen, die uns am Leben erhalten, sind zum grten Teil Proteine, knnen auch RNAs
sein, sind aber jedenfalls etwas, das im DNA-Code manifestiert ist und das man exprimieren muss,
damit es funktionell aktiv werden kann.
Dazu kann man zunchst die Transkription kontrollieren, also einfach die Frage bestimmen, ob ein
bestimmtes Gen in einer bestimmten Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt angeschaltet ist oder
nicht.
Die Transkriptionskontrolle der Genexpression ist nur der erste Schritt, bei dem diese reguliert
werden kann, das Transkript wird ja anschlieend weitergegeben und prozessiert, d.h. man muss das
Transkript so verndern, dass es erstens einmal, wenn es sich um eine eukaryotische Zelle handelt,
aus dem Kern transportiert wird, sofern es eine Exon-Intron-Struktur besitzt mssen die Introns
herausgespliced werden, es gibt also eine ganze Menge an Prozessierungs- und Transportschritten,
bevor die reife mRNA schlussendlich im Cytoplasma vorliegt. Auch diese Schritte knnen reguliert
werden.
Auch die Transkriptstabilitt, also die Geschwindigkeit, mit der ein Transkript nach der Synthese
im Cytoplasma wieder abgebaut wird, ist ein ganz wesentlicher Faktor und wird als Halbwertszeit
angegeben, da gibt es groe Unterschiede. Es ist klar, dass eine mRNA, deren Halbwertszeit 5 min
betrgt, zu weniger Genexpression fhrt als eine, deren Halbwertszeit mehrere Stunden betrgt.
Wenn es sich um eine proteincodierende RNA handelt, muss sie natrlich translatiert werden, und
auch die Translation kann reguliert werden.
Schlielich hat man ein Protein, also sozusagen die Maschine, die in der Zelle aktiv werden soll,
diese Maschine ist aber eventuell noch abschaltbar, nmlich durch posttranslationale
Modifikationen, also beispielsweise durch die Einfhrung chemischer Gruppen, z.B.
Phosphorylierung. So kann man auch bei einem fertigen Protein noch regulieren, ob es in aktivem
oder inaktivem Zustand vorliegt. Dementsprechend reguliert man natrlich wieder die
Genexpression.
Das gleiche, das fr die mRNA gilt, dass also ihre Stabilitt ein wichtiger Faktor fr die
Genexpression ist, gilt auch fr Proteine, die sehr langlebig sein knnen, aber eben auch sehr
kurzlebig. Dementsprechend entfalten sie ihre Aktivitt auch mehr oder weniger, was natrlich
wieder nur ein Synonym fr die Regulation der Genexpression ist.
Was ist Transkription?
Das ist der Prozess, bei dem ein DNA-Matrizenstrang in eine mRNA berschrieben wird und zwar
nach den Regeln der Basenkomplementaritt, also ber G-C- bzw. A-T-Paarungen.
Der Chemismus der Transkription bestimmt, dass das Ausgangssubstrat immer ein
Ribonucleotidtriphosphat ist. Das Triphosphat liefert die Energie fr die Verknpfung von
Nucleotiden. Es wird gespalten, so dass das Triphosphat an die wachsende RNA angehngt wird.
Dabei wird ein Pyrophosphat freigesetzt, das dann noch weiter in zwei Phosphate gespalten
werden kann. Daraus kommt die Energie, die man braucht, um ein Transkript herzustellen.
Das Triphosphat sitzt am 5'-Ende des Ribonucleotids, was natrlich bedeutet, dass ein Transkript
immer nur in 5'3'-Richtung wachsen kann. Das heit nmlich, dass die Verknpfung zwischen
dem 5'-Phosphat des nchsten und dem 3'-OH des vorigen Nucleotids erfolgt, wobei die Energie
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eben von dem Triphosphat, das an dem 5'-Nucleotid sitzt, stammt. Das hereinkommende Nucleotid
liefert also immer das Triphosphat zur Verknpfung an das freie OH. Das Ende der bereits
synthetisierten RNA ist demnach ein 3'-OH.
Diese Eigenschaft der unterschiedlichen 5'- und 3'-Enden der DNA wird als chemische Polaritt
bezeichnet.
Bei der Transkription hat man einen DNA-Doppelstrang und mchte einen Teil davon in eine RNA
transkribieren. Es gibt also 2 DNA-Strnge, es wird aber nur einer davon wirklich transkribiert. Das
bedeutet, dass es schon auf DNA-Ebene einen Strang gibt, der die richtige Basen-Sequenz trgt,
man nennt ihn den codierenden Strang, und einen zweiten Strang, der die zu diesem Strang
komplementre Basensequenz trgt. Die mRNA wird auch nach den Regeln der
Basenkomplementaritt gebildet (mit Uracil statt Thymin), das heit sie entspricht ihrer Sequenz
nach dem codierenden Strang, aber sie wird transkribiert durch ihre Komplementaritt zum
nichtcodierenden Strang der DNA. Der nichtcodierende Strang der DNA wird also transkribiert,
wobei eine mRNA entsteht, die in ihrer Sequenz dem codierenden Strang entspricht. Der
nichtcodierende Strang wird deshalb auch als Template- oder Matrizenstrang bezeichnet.
Wie schnell luft Transkription ab?
Dazu gab es Messungen in E. coli und auch in Eukaryoten-Zellen, bei beiden lag die
Geschwindigkeit bei ca. 40-60 Nucleotiden pro Sekunde.
Bei E. coli ist das Wachstum der RNA gut mit der Rate der Translation verbunden, weil das
Ribosom, das die RNA translatiert, etwa 15 Aminosuren pro Sekunde schafft und jede davon von
3 Nucleotiden codiert wird.
Bei Prokaryoten-Zellen sind Transkription und Translation gekoppelte Prozesse. Das
transkribierende Enzym, die RNA-Polymerase, und die translatierende Maschine, das Ribosom,
sind rumlich nicht voneinander getrennt, d.h. sobald die RNA gebildet wird und das Ribosom an
dieser RNA bestimmte Sequenzen erkennt, kann das Ribosom beginnen daran zu binden und sie zu
translatieren. Dementsprechend ist es wichtig, dass die Geschwindigkeiten der beiden Prozesse
aufeinander abgestimmt sind.
Die Transkription ist relativ langsam verglichen mit der Replikation, die DNA-Polymerasen sind
also wesentlich schnellere Enzyme, die z.B. bei E. coli ca. 50.000 Basen pro Minute synthetisieren,
bei Eukaryoten immerhin ca. 20.000 Basen pro Minute.
Transkription bedeutet zunchst, dass die RNA-Polymerase, also das Enzym, das die Transkription
bewerkstelligt, wissen muss, wo sie transkribieren soll. Es wird nicht das ganze Genom
transkribiert. Das ist vor allem bei Eukaryoten-Zellen wichtig, wo es ja deutlich mehr DNA gibt, die
fr kein Gen codiert als solche, die fr ein Gen codiert. Die RNA-Polymerase muss also wissen, wo
ein zu transkribierendes Gen ist, sie muss irgendwelche Mglichkeiten haben zu erkennen, wo
genau sie eigentlich die Transkription beginnen soll. Diese Struktur ist nichts anderes als eine
Hufung von DNA-Sequenzen, die fr kein Transkript codieren, sondern eine Art Signalwirkung
fr die RNA-Polymerase haben, also praktisch eine Bindungsstelle fr die RNA-Polymerase
darstellen und natrlich auch fr die Proteine, die hier Genregulation betreiben. Die Gesamtheit
dieser DNA-Sequenzen, die man braucht, um Gene transkribieren zu knnen, bzw. auch um diese
Gene regulieren zu knnen, nennt man den Promoter eines Gens.
Die RNA-Polymerase muss also irgendeine Mglichkeit haben diese Promotoren zu erkennen.
Wann die RNA-Polymerase einen Promoter erkennt ist einer der zentralen Punkte der
Genregulation. Es gibt zwei Sichtweisen: Man kann sagen, dass ein Promoter etwas ist, was die
RNA-Polymerase immer erkennt, oder man kann sagen, dass sie ihn von allein nicht erkennt,
sondern dafr die Hilfe anderer Proteine braucht. Diese anderen Proteine werden als
Transkriptionsfaktoren bezeichnet und knnen Gene regulieren, also wann die RNA-Polymerase
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RNA komplementr dazu paaren knnen und dass sie diese RNA enzymatisch verlngern knnen.
Grundaufbau einer solchen Polymerase in Prokaryoten (genauer gesagt in E. coli): Sie besteht aus
zwei groen Untereinheiten, - und '-Untereinheit. Diese beiden bilden das katalytische
Zentrum des Proteins aus. Sie werden in E. coli von den Genen rpoB und rpoC codiert, wobei rpo
fr RNA polymerase steht.
Es gibt auch zwei -Untereinheiten, die der RNA-Polymerase dabei helfen knnen einen Promoter
zu erkennen oder auch dazu beitragen, dass die Bindung einer RNA-Polymerase an einen Promoter
regulierbar wird. Das dafr codierende Gen heit in E. coli rpoA.
Diese - und -Untereinheiten bilden die Core-Polymerase, also die zentrale funktionelle Einheit.
Dort befindet sich das katalytische Zentrum, die Regulierbarkeit und bis zu einem gewissen Grad
die Promotererkennung sind durch die -Untereinheiten gewhrleistet. Die Minimalausstattung
einer RNA-Polymerase ist immer dieses Tetramer aus einer -, einer '- und zwei Untereinheiten.
Es gibt noch eine weitere Untereinheit, die nicht zum Core-Enzym gezhlt wird, sondern die dann
das sogenannte Holoenzym bildet. Das Core-Enzym ist also offensichtlich vor allem in seiner
Fhigkeit Promotoren zu erkennen nicht vollstndig ausgebildet. Das Core-Enzym kann zwar
transkribieren, es fehlt ihm aber die Fhigkeit zur Promotererkennung. Damit diese Eigenschaft
gewhrleistet ist, braucht man das Produkt des rpoD-Gens, die sogenannte -Untereinheit oder den
-Faktor der RNA-Polymerase.
Der Unterschied zwischen Core-Polymerase und Holoenzym ist eben die An- oder Abwesenheit des
-Faktors.
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heit, dass man im Transkript an mehreren Stellen die Translation beginnen kann. Bei den
Eukaryoten gibt es hingegen in der Regel nur einen Transkriptionsstart am Anfang des Transkripts,
man kann nicht intern ein Ribosom aufspringen und translatieren lassen. Deshalb kann es bei
Eukaryoten aus mechanistischen Grnden keine polycistronischen mRNAs geben.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der Transkription ist die DNA-Topologie. Die RNA-Polymerase
bewegt sich auf einer Helix. Durch das Erzeugen der Transcription Bubble, also durch die Trennung
der Strnge, muss man die Strnge umeinander wickeln, so dass diese entstehen kann. Dadurch
entsteht hinter dem Enzym ein Bereich von DNA, in dem die DNA unterwunden vorliegt, wo also
die Anzahl der Windungen der Strnge umeinander kleiner ist als normal, und vor dem Enzym
entsteht ein Bereich, in dem die Windungen enger sind. Das wird als negatives (unterwundene
DNA) und positives (berwundene DNA) Supercoiling bezeichnet.
Die DNA muss nach dem Transkriptionsereignis wieder in den Normalzustand zurckgebracht
werden. Das bewerkstelligen Enzyme aus der Klasse der Topoisomerasen, z.B. die DNA-Gyrase,
die dafr sorgen, dass das DNA-Supercoiling reversibel gemacht wird.
Das Supercoiling entsteht also einerseits durch die Bewegung der RNA-Polymerase und
andererseits durch das Entwinden der DNA-Strnge im Bereich der Transkriptionsblase.
Welche Konsequenzen hat das DNA-Supercoiling fr die DNA-Struktur?
Relaxierte DNA: DNA so wie sie sich, wenn sie sich in einem entsprechend physiologischen
Medium befindet, von allein windet, sie enthlt genau 10.4 bp pro 360-Windung.
Die Verwindung, also die Windung der Strnge umeinander, wird als Twist bezeichnet. Es ist der
Twist, der bei Unter- und berwindung der DNA verndert wird, so dass man eine Abweichung von
den 10.4 bp pro 360 hat.
Das Molekl versucht dann wieder in den relaxierten Zustand zurckzukehren. Dazu kann die DNA
fr sich (ohne die Einwirkung von Enzymen) Writhe durchfhren, also ein umeinander Krmmen,
wodurch der normale Twist wiederhergestellt wird, indem sich die DNA-Strnge umeinander
winden. Dadurch ist das Chromosom nicht mehr zirkulr, sondern es bildet sich eine Doppelbrezel.
Die Anzahl der Windungen des gesamten Molekls, also nicht nur der einzelnen Strnge
umeinander, wird als Writhe bezeichnet. Auch das kann quantitativ angegeben werden.
Das Ergebnis des Ganzen ist die Linkage Number. Diese misst wie oft die DNA-Strnge
umeinander gewunden sind und zwar unabhngig davon, ob man die Windungen der Einzelstrnge
umeinander (Twist) oder die des gesamten Molekls (Writhe) betrachtet. Die Linkage Number ist
also die Summe aus Twist und Writhe. Bei einem zirkulren Molekl ist der Writhe umso grer je
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kleiner der Twist ist, die Linkage Number bleibt insgesamt konstant.
Das Supercoiling kann bei Elektrophorese sichtbar gemacht werden, da die Molekle sich umso
schneller durch das elektrische Feld und die Matrix des Gels bewegen je kleiner sie sind. Die
supercoiled Form der DNA bewegt sich also schneller zum Pluspol als die relaxierte DNA.
Wenn man nun das Supercoiling sukzessive verkleinert, indem man den Writhe immer kleiner
macht, also den Twist wieder allmhlich an die 10.4 Basen fhrt, sieht man, dass die DNA bei der
Elektrophorese zunehmend langsamer wird.
Fr die Topologie von Eukaryoten-DNA ist es wichtig zu wissen, dass die Art und Weise wie sich
das Supercoiling auf die Struktur der gesamten DNA auswirken kann, unterschiedlich ist. Einerseits
gibt es das normale plektonemische Supercoiling eines zirkulren DNA-Molekls [plektonemisch =
Die Eigenschaft von 2 verdrillten Strngen sich nicht ohne Aufdrehen voneinander lsen zu lassen]
und andererseits knnen auch toroidale Strukturen entstehen, wenn man die DNA um etwas
herumwickelt. Diese toroidale Struktur ist gerade bei Eukaryoten sehr wichtig, da hier die DNA
nicht frei vorliegt, sondern sie ist um ein Nucleosom herumgewickelt.
Die plektonemische Struktur entsteht durch Einfhrung eines negativen Twists, also wenn ein
DNA-Strang so um den anderen herumgefhrt wird, dass die Linkage Number kleiner wird. Das
Molekl relaxiert dann wieder dadurch, dass ein negativer Writhe (-1) eingefhrt wird.
Die toroidale Struktur entsteht, wenn man den Twist vergrert. Auch dann kann das Molekl
relaxieren, indem es einen Wirthe einfhrt, aber in diesem Fall ist der Writhe positiv (+1).
Eine eukaryotische DNA kann man sich also als
eine toroidal verwundene DNA vorstellen, da sie
um
Nucleosomen
herumgewickelt
ist.
Nucleosomen
sind
Proteinstrukturen
aus
Histonen, um die sich die DNA zweimal windet.
Diese Windung wird erleichtert, da sie der DNA
hilft sich in einen relaxierten Zustand
zurckzubringen.
Biologisch aktive DNA ist kein relaxiertes
Molekl. Die Art der Spannung, die man in eine
biologisch aktive DNA einbringt, wird dadurch
relaxiert, dass toroidale Strukturen gebildet werden, die der Bildung von Nucleosomen
entgegenkommen.
Die Transkription ist ein topologischer Stress und damit dieser Stress nicht zu gro wird, muss man
aktiv entgegenwirken. Das machen die Topoisomerasen. Davon gibt es Typ I und Typ II
Topoisomerasen.
Die Typ II Topoisomerase oder DNA-Gyrase nimmt die Spannung aus dem DNA-Molekl mit dem
negativen Writhe, indem sie einen Doppelstrangbruch herbeifhrt und den einen Strang durch den
anderen zieht, wodurch die Spannung aus dem Molekl genommen wird.
Die Typ I Topoisomerasen bewirken nur einen Einzelstrangbruch, dann lsst man den Einzelstrang
um den anderen so lange rotieren bis wieder die normale Windungszahl (Linkage Number) gegeben
ist.
Die Topoisomerasen werden bei der Transkription bentigt, um den topologischen Stress, der durch
die Trennung der DNA-Strnge im Bereich der Transcription Bubble und durch das
Entlangwandern der RNA-Polymerase an der DNA entsteht, wieder zu relaxieren.
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Typ II:
Typ I:
An der wesentlich geringeren Geschwindigkeit der RNA-Polymerase gegenber der DNAPolymerase bei der Replikation kann man sehen, dass ein relativ intensives Proof-Reading erfolgt.
Die RNA-Polymerase prft also nach, ob ein Nucleotid, das sie komplementr zum DNA-Strang
angefgt hat, auch tatschlich korrekt war. Sollte sie feststellen, dass dem nicht so war, hat sie die
Mglichkeit dieses Nucleotid wieder zu entfernen und durch das richtige zu ersetzen. Das wird als
Proof-Reading bezeichnet.
Die Mechanismen, die hierfr greifen, sind einerseits das Pyrophosphorolytic Editing und
andererseits das Hydrolytic Editing.
Beim Pyrophosphorolytic Editing wird das letzte Nucleotid der wachsenden RNA-Kette durch ein
Pyrophosphat ersetzt. In diesem Fall bricht die RNA-Polymerase die Transkription ab, indem sie ein
Pyrophosphat am Ende anfgt und sich damit die Mglichkeit nimmt an dieses Pyrophosphat noch
ein weiteres Nucleotid anzuhngen. Es kommt zum Ende der Transkription an dieser Stelle.
Das Hydrolytic Editing stellt hingegen eine Mglichkeit dar einen Fehler tatschlich
wiedergutzumachen. Hierbei bewegt sich die RNA-Polymerase einige Nucleotide rckwrts und
entfernt einfach das ganze Stck, das die Fehlpaarung enthlt und fngt an der Stelle nochmal an
den Strang komplementr zum Matrizenstrang zu synthetisieren.
RNA polymerases catalyze rapid RNA chain growth. RNA polymerase II adds between 20 and 70
nucleotides per second to RNA and does this by moving forwards and backwards over at template
at each step. Transcribing RNA polymerases swap between three states: pre-translocated, reversetranslocated and post-translocated. During pre-translocation, the nucleotide that has just been
added is still within the nucleotide addition site of RNA polymerase II. During post-translocation,
RNA polymerase II has a free nucleotide addition site that is available to new nucleotides. In
addition to these two states, there is the backtracked state, when RNA polymerase II moves
backwards over the template, and the 3 end of the new RNA is extruded. The advantage of
backtracking is that it allows the RNA transcript to be checked and is the dominant state when the
template is damaged. The one-residue backtracked state is readily cleaved in the presence of the
elongation factor IIS (TFIIS) and a dinucleotide is released. This adds weight to the theory that
cleavage occurs in the RNA polymerase II active site and that it is important for removal of
misincorporated nucleotides. RNA polymerase II moves forwards and backwards on the template
until a mismatch of RNADNA causes the helix to distort and shift the polymerase into the
backtracked state. If it remains in this state for a long time, cleavage ensues. This one-residue
backtracked state is a key contributor to proofreading by RNA polymerase II.
Termination der Transkription: Man unterscheidet bei Eubakterien die rho-abhngige und die rhounabhngige Termination der Transkription. Man braucht also in einem der beiden Flle ein
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Sobald der Promoter einmal gefunden ist und die RNA-Polymerase in die Elongationsphase der
Transkription bergeht, diffundiert der -Faktor genauso schnell wieder weg und steht fr weitere
Core-Enzyme zur Verfgung, um Promotoren zu finden, den Rest des Transkriptionsvorgangs
bewerkstelligt die RNA-Polymerase aber ohne den -Faktor.
2. Vorlesung:
Wie kann eine Polymerase feststellen, dass eine falsche Basenpaarung passiert ist?
Whrend der Elongationsphase ist die Nettobewegung der RNA-Polymerase natrlich entlang des
Template-Strangs. Diese Bewegung erfolgt aber nicht kontinuierlich, sondern sie ist bei Bedarf
eigentlich eher ein Ruckeln bzw. Inchworming, was heit, dass die Polymerase bei Bedarf in der
Vorwrtsbewegung innehlt und wieder ein Stck zurckgeht. In diesem Schritt zurck ist sie in der
Lage noch einmal die Nucleotide hinter sich zu sehen und bei Bedarf zu entfernen und erst dann
die nchste Vorwrtsbewegung zu machen.
Die Ausgangslage wird hierbei als Post-Translocation bezeichnet. Nach Einfgen eines neuen
Ribonucleotidtriphosphats an der Addition site im katalytischen Zentrum der RNA-Polymerase
befindet man sich im Pre-Translocation state. Jetzt folgt der nchste Bewegungsschritt der
Polymerase. Dieser kann aber zuerst mit einem Backtracking beginnen, also damit, dass sich die
Polymerase nicht gleich weiter vorwrts bewegt, sondern erst sozusagen Anlauf nimmt, sich also
zuerst einen Schritt zurckbewegt, so dass dann nicht nur das gerade angefgte Nucleotid wieder
zugnglich ist, sondern auch das vorhergehende. Wenn nun das vorangegangene Nucleotid einen
Mismatch mit dem Template darstellt, knnte es entfernt werden.
Um so einen Mismatch zu erkennen, muss die RNA-Polymerase bestimmte strukturellen
Gegebenheiten erkennen knnen, die ihr signalisieren, ob ein Mismatch stattgefunden hat. Bei
einem Mismatch sprt die Polymerase anscheinend eine gewisse Spannung bzw. Verzerrung in der
Helix, die sich zwischen Template-Strang und RNA bildet, und diese Spannung fhrt dann dazu,
dass die Polymerase nicht gleich weiterwandert, sondern erst dieses Backtracking durchfhrt.
Der -Faktor macht den Unterschied aus zwischen einer Polymerase, die sehr gut dazu in der Lage
ist Promoter-Regionen auf der DNA zu erkennen, und einer, die das nicht kann.
Was genau an einem Promoter wird hierbei erkannt, was unterscheidet Promoter-DNA von anderer
ganz gewhnlicher DNA?
Nach Entwicklung der Methoden zur Sequenzierung von DNA in den 1970er Jahren hat man in den
1980ern damit begonnen auch Promotoren zu sequenzieren, zur Untersuchung, ob diese
Gemeinsamkeiten aufweisen. Um das machen zu knnen musste man natrlich zuerst wissen, dass
sich in dem jeweiligen sequenzierten Bereich ein Promoter befinden knnte. Schon frher konnte
man zur Bestimmung von (wahrscheinlichen) Promotoren die Bindung von RNA-Polymerasen
verwenden, also Bindungs-Assays durchfhren, mit denen man feststellen konnte welche DNA
besonders gut an einer Polymerase hngen bleibt, was eine hohe Wahrscheinlichkeit fr die
Anwesenheit eines Promoters in diesem DNA-Stck signalisiert.Es konnten dabei tatschlich
bereinstimmungen gefunden werden. Bei den Sequenzierungsexperimenten orientierte man sich
am Transkriptionsstart (+1) und entdeckte im -10-Bereich, also etwas upstream des
Transkriptionsstarts eine auffllige Hufung von A-T-Paarungen. Man hat als Consensussequenz
TATAAT festgelegt und wird als TATA-Box bezeichnet. Ein zweiter aufflliger Bereich war bei ca.
-35, bei dem die Consensussequenz TTGACAT erhalten wurde. Consensus bedeutet, dass es sich
um die Nucleotide handelt, die an dieser Position mit der hchsten Wahrscheinlichkeit auftreten, es
gibt zwar Abweichungen, die allerdings nicht so gro sind, dass die Consensussequenz nicht mehr
erkennbar ist.
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Diese Bereiche um die Positionen -10 und -35 definieren einen Promoter. Warum?
Der -Faktor wird unterteilt in die 4 Subdomnen 1-4, die wiederum in Strukturmotive unterteilt
sind, die mit 1.1, 1.2 etc. bezeichnet werden.
Domne 4 ist verantwortlich fr die Erkennung des -35Bereichs, Domne 3 fr die Erkennung des -10- bzw. des
Extended -10-Bereichs, d.h. nicht nur die TATA-Sequenz
selbst, sondern auch die Nucleotide um diese herum.
Eine weitere wichtige Funktion ist das Melting, fr das
Domne 2 verantwortlich ist. Diese befindet sich im Bereich
der Transcription Bubble. Der nchste Schritt nach der
Bindung des Promoters durch die RNA-Polymerase ist, dass die Polymerase erst einmal die beiden
DNA-Strnge voneinander trennen muss, bevor sie beginnen kann eine RNA zu polymerisieren.
Dieses Entwinden der DNA bezeichnet man als Promoter Melting. Dafr braucht man eine
enzymatische Funktion, die als Helicase bezeichnet wird. Das Suffix -ase bedeutet immer, dass eine
Struktur zerstrt wird, in diesem Fall die Helix.
Der -Faktor hat also nicht nur die Fhigkeit die -10- und -35-Bereiche zu erkennen und damit die
Erkennung eines Promoters durch die RNA-Polymerase zu vermitteln, sondern ist auch wesentlich
daran beteiligt, dass die Polymerase in der Lage ist die DNA-Strnge zu trennen.
Das kann z.B. durch Einfhren von Mutationen in die einzelnen Subdomnen des -Faktors
bewiesen werden oder durch Einfhren von Mutationen in die DNA. ber Mutationsanalyse kann
dann festgestellt werden, in welchem Bereich im Promoter kritische Nucleotide sind, die die
Bindung der Polymerase beeintrchtigt. So wurden die -10- und -35-Bereiche als kritische Bereiche
fr die Bindung der Polymerase besttigt.
Es gibt aber auch andere Bereiche, wo die RNA-Polymerase mit der DNA assoziiert ist. In diesen
Bereichen ist die DNA vor chemischen Modifikationen geschtzt. Das Verfahren, mit dem das
festgestellt wurde, wird als DNA Footprinting bezeichnet.
DNA Footprinting kann auf zwei Arten durchgefhrt werden.
Man kann die DNA mit einer Chemikalie behandeln, die eine bestimmte Base (z.B. Purin-Basen)
modifiziert. Diese Modifikation fhrt dazu, dass diese Base durch RNA-Polymerase nicht mehr
erkennbar ist.
Man kann aber auch umgekehrt vorgehen, indem man die Polymerase zuerst an die DNA binden
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lsst und erst dann die Chemikalie dazugibt. Dann kann man sich die Frage stellen, welche Basen
jetzt durch die Bindung des Enzyms vor der Attacke der Chemikalie geschtzt sind.
Interessant dabei ist, dass die Nucleotide, die durch die RNA-Polymerase-Bindung betroffen sind,
sich fast alle auf demselben DNA-Strang befinden, nmlich auf dem codierenden Strang, also
nicht auf dem, zu dem komplementr die RNA synthetisiert wird.
Der Grund dafr ist, dass die RNA-Polymerase einen Strang nicht gleichzeitig ganz fest halten und
transkribieren kann. Sie bindet deshalb an den codierenden Strang und hat dann viele
Freiheitsgrade, mit dem Matrizenstrang so umzugehen, dass sie optimal eine komplementre RNA
dazu bilden kann. Deshalb betreffen die meisten Kontakte der RNA-Polymerase mit dem Promoter
den codierenden Strang.
Welche Verfahren gibt es, mit denen man die Stelle, an der ein Enzym oder allgemein ein Protein an
die DNA bindet, feststellen kann?
Dafr gibt es eine ganze Reihe von Verfahren, die unter dem Schlagwort DNA Footprinting
bekannt sind. Das sind Verfahren, mit denen man quasi einen Fuabdruck des Enzyms auf der DNA
markieren kann.
Bsp.: DNAse I Footprinting: Die DNAse I ist ein Enzym, das die DNA vor allem in der groen
Furche schneidet, allerdings nicht an einer bestimmten Sequenz, es kann also jedes Nucleotid von
DNAse I geschnitten werden.
Der Footprint wird so erzeugt, dass man die Polymerase an die
DNA binden lsst und so die DNA durch die Polymerase
geschtzt wird, d.h. dort, wo die Polymerase an den Promoter
gebunden ist, kann die DNAse nicht schneiden.
Um das ganze sichtbar zu machen wird die DNA im Vorfeld an
einem Ende radioaktiv markiert (meistens am 5'-Ende, da es dort
am einfachsten ist).
Fr den Versuch erstellt man ein Gemisch aus der zu
untersuchenden DNA, Polymerasen und DNAse, wobei nur so
viel DNAse zugegeben wird, dass jedes DNA-Molekl im
Gemisch genau einmal geschnitten wird. Parallel wird ein zweiter
Ansatz ohne Polymerase erstellt. Stimmt das Verhltnis von DNA
zu DNAse, wird in diesem Ansatz jedes der DNA-Molekle
einmal geschnitten, wobei die Wahrscheinlichkeit eines Schnitts
nach jedem Nucleotid gleich ist. Man erhlt also eine
Fragmentleiter, in der sich die einzelnen Stcke jeweils um ein
Nucleotid unterscheiden.
Nach Binden der Polymerase an die DNA im Bereich des
Promoters kann die DNAse dort nicht mehr schneiden, so dass
man nach elektrophoretischer Auftrennung die Fragmente, die den Schnittstellen innerhalb des
Promoters entsprechen, nicht mehr erhlt. Dieses Loch in den DNA-Fragmentbanden, das
dadurch entsteht, wird als DNAse I Footprint bezeichnet. Durch parallele Sequenzierung des
verwendeten DNA-Stcks kann man auch gleich die durch die Polymerase erkannte Sequenz
bestimmen.
Das Footprinting-Verfahren kann aber auch mit Chemikalien durchgefhrt werden.
Neben den bereits besprochenen Consensussequenzen wurden mit der Zeit auch noch andere
entdeckt und in Verbindung damit auch, dass es bei E. coli nicht nur einen, sondern mehrere Faktoren gibt. Diese werden nach ihrem Molekulargewicht (in kDa) bezeichnet und erkennen
jeweils andere Consensussequenzen. Der von den meisten Genen verwendete ist 70, der genau die
schon besprochenen Sequenzen (-10: TATAAT und -35: TTGACAT) erkennt, es gibt aber auch
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andere -Faktoren, die dann auch andere Consensussequenzen erkennen und in vielen Fllen nur
unter bestimmten Bedingungen vorliegen, z.B. als Reaktion auf starke Temperaturschwankungen
(heatshock) oder wenn Bewegung im Rahmen von Chemotaxis notwendig ist. Diese speziell auf die
bestimmten Situationen abgestimmten Gene besitzen auch dem jeweiligen -Faktor entsprechende
Consensussequenzen.
Es knnen also mehrere verschiedene Holoenzyme gebildet werden, wodurch unterschiedliche
Gene exprimiert werden knnen.
Diese Regulation durch die verschiedenen -Faktoren ist z.B. auch beim Bacillus subtilisBakteriophagen SP01 wichtig. Dieser verwendet nicht wie der E. coli-Phage Lambda AntiTerminationssignale fr das Umschalten zwischen den verschiedenen Stadien der Genexpression,
sondern unterschiedliche phagencodierte -Faktoren. Die frhen Gene enthalten dabei das Gen fr
den -Faktor 28, der den Promoter fr die mittleren Gene erkennt, die wiederum das Gen fr den Faktor 34 enthalten, der den Promoter der spten Gene erkennt.
Eine
weitere
wichtige
StrukturFunktionsbeziehung zwischen RNA-Polymerase
und Promotoren betreffen die beiden kleinen Untereinheiten der Polymerase. Diese knnen die
Affinitt der Polymerase zu bestimmten
Promotoren zustzlich erhhen. Diese Promotoren
besitzen zustzlich zu den -10- und -35Consensussequenzen noch ein UP-Element (UP upstream promoter), zu dem die Untereinheiten der Polymerase Kontakt aufnehmen, was die Bindungsstrke der Polymerase an den
Promoter weiter erhht.
Wie kann man nun Gene zustzlich regulieren?
Bei jedem Gen bzw. Operon braucht man fr die Expression einen Promoter, es gibt aber viele
Gene, die man nicht immer transkribieren mchte, sondern nur in bestimmten Situationen. Deshalb
gibt es abgesehen von der RNA-Polymerase selbst (inklusive der alternativen -Faktoren) noch eine
oder mehrere weitere Ebenen der Regulation.
Was ist ein Operon?
Ein Operon ist eine fr Prokaryoten bzw. Eubakterien typische Anordnung von Genen, es
bezeichnet eine Gruppe von Genen, die in direkter Abfolge auf der DNA angeordnet sind. Die darin
codierten Gene werden gemeinsam reguliert und in einer gemeinsamen polycistronischen mRNA
transkribiert. Das heit jedes Operon hat einen Promoter, aber mehrere Gene, die am Ende alle Teil
eines polycistronischen Transkripts sind.
Wie kann ein Operon reguliert werden?
Operons knnen positiv oder negativ reguliert sein. Negative Regulation bedeutet, dass ein Gen im
Normalzustand (by default) angeschaltet ist, d.h. um es abzuschalten muss man die Transkription
aktiv verhindern. Die RNA-Polymerase kann also ungehindert an den Promoter dieses Gens binden,
um das zu verhindern muss ein Protein gebildet werden, das als Repressor wirkt. So ein
transkriptioneller Repressor verhindert, dass die RNA-Polymerase dieses Gen transkribieren
kann.
Bei der positiven Regulation ist es umgekehrt, d.h. das Gen wird im Normalzustand nicht
transkribiert, wenn man es anschalten mchte muss ein transkriptioneller Aktivator gebildet
werden.
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kann also nicht mehr ausreichend Energie erzeugen, und die Zelle beginnt cAMP zu bilden. Dieses
bindet an das CAP und aktiviert es, so dass es an die entsprechenden Promotoren binden kann.
Ohne Bindung des Aktivators CAP kann die Polymerase an den Promoter binden und es kommt
auch zur Transkription, allerdings nur in basaler Menge, also relativ wenig. Ist keine Glucose
vorhanden, Lactose aber schon, kommt es zur maximalen Transkription, da der Repressor durch die
Lactose inaktiviert wird und CAP durch Anwesenheit von greren Mengen cAMP an die CAP site
gebunden wird.
Was macht das CAP?
CAP verbiegt die DNA so, dass die Polymerase durch ihre -Untereinheiten direkt mit der CAP site
interagieren kann, was der Polymerase erlaubt mit erhhter Affinitt an den Promoter zu binden.
Warum gibt es mehr als einen Operator?
Wenn weder Glucose noch Lactose vorhanden sind gibt es keine Transkription des lac-Operons,
weil zwar positive Kontrolle durch das CAP erfolgt, aber der Repressor am Operator gebunden
bleibt.
Bei Anwesenheit von Glucose, aber Fehlen von Lactose gibt es ein wenig Transkription des lacOperons, da die Repression in Abwesenheit von Glucose noch effizienter ist als in Anwesenheit von
Glucose. Das weist darauf hin, dass das CAP bei gebundenem Repressor die Repression noch
stringenter macht.
Die Bindungsstelle fr das CAP liegt zwischen den beiden Operatoren O1 und O3. Durch Bindung
des CAPs wird die DNA verbogen. Bei der positiven Regulation bedeutet das, dass es die
Interaktion mit den -Untereinheiten der Polymerase erlaubt. Wenn die Polymerase aber eh nicht
transkribieren kann, weil der Repressor aktiv ist, fhrt es dazu, dass die Repressor-Dimere, die an
O1 und O3 gebunden sind, durch die Schlaufe miteinander interagieren knnen und so einen
besonders repressiven Zustand herstellen knnen.
Aus diesem Grund wird der Repressor in lteren Publikationen oft als Tetramer dargestellt.
Positive und negative Regulation kann auf
unterschiedliche Weise erfolgen.
Negative Regulation: Es gibt den Fall, dass es einen
aktiven Repressor gibt, der durch einen Inducer
inaktiviert wird (z.B. lac-Operon), aber auch den, dass
der Repressor von Haus aus inaktiv ist und erst durch
einen Korepressor aktiviert werden muss (z.B. trpOperon).
Positive Regulation: Hier gibt es den Fall, dass ein
inaktiver Aktivator erst durch einen Inducer aktiviert
werden muss (CAP: Inducer = cAMP), aber auch den,
dass der Aktivator von Haus aus aktiv ist und durch
einen Korepressor inaktiviert werden muss.
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3. Vorlesung:
Promotoren in Eukaryotenzellen:
Ein Promoter enthlt generell eine Bindungsstelle fr eine RNA-Polymerase, einen
Transkriptionsstart und regulatorische Sequenzen, die ja nichts anderes sind als Bindungsstellen fr
regulatorische Proteine, also die Transkriptionsfaktoren auf der DNA.
Bei den Prokaryoten liegen diese Bindungsstellen in der Nhe des Transkriptionsstarts und es gibt
unter ihnen auch Flle, wo Transkriptionsfaktoren die DNA-Struktur so verndern, dass diese z.B.
gekrmmt wird, wodurch neue Proteinwechselwirkungen mglich werden. Dabei muss die
Bindungsstelle des Regulators nicht unbedingt so gelegen sein, dass der Regulator direkten Kontakt
mit der Polymerase aufnehmen knnte, das kann auch ber eine Krmmung der DNA
bewerkstelligt werden.
In eukaryotischen Zellen sind solche isolierten regulatorischen Bindungsstellen von Genen blich.
Je komplexer ein Organismus wird, desto komplexer werden auch die Promotoren von Genen, die
stark reguliert werden. Bereits bei Hefe gibt es einen Transkriptionsstart, wo die Polymerase bindet,
was den Promoter im eigentlichen Sinne darstellt, es gibt aber auch sogenannte proximale (=
benachbarte) Bindungsstellen, die noch relativ nah beim Transkriptionsstart liegen, und distale, also
relativ weit vom Transkriptionsstart entfernte Bindungsstellen fr Transkriptionsfaktoren, die
zusammen Ereignisse regulieren, die am Transkriptionsstart stattfinden.
Betrachtet man hher entwickelte Organismen, bei denen als Regulationsebene noch die
Kommunikation zwischen Zellen und Organen hinzukommt, sieht man, dass es sich dabei um ein
komplexes Kommunikationssystem handelt, was heit, dass die Information, die aus dieser
Kommunikation kommt, letztlich Genaktivitt beeinflussen muss. Dementsprechend ist es logisch,
dass die Promotoren von solchen Genen, die viele Kommunikationssignale integrieren und in eine
Genaktivitt, also eine vernderte Transkriptionsantwort, umsetzen mssen, ziemlich komplex sind
und dass sie viele proximale und distale Bindungsstellen fr Regulatoren enthalten knnen. Bei
Sugern und auch schon bei anderen Vertebraten kommt noch dazu, dass diese Regulationsstellen
gar nicht mehr alle oberhalb des Transkriptionsstarts liegen mssen, sie knnen z.B. auch in Introns
unterhalb des Transkriptionsstarts oder im 3'-Bereich des Gens, also dort, wo die codierende
Sequenz bereits beendet ist, liegen.
Es gibt also viele positionelle Mglichkeiten fr Transkriptionsfaktoren, um letztendlich auf das
Transkriptionsereignis, also dass die RNA-Polymerase bindet und sich in Bewegung setzt, Einfluss
zu nehmen.
Bei den Eukaryoten kommt auerdem noch die Komplexitt der drei unterschiedlichen
Polymerasen dazu.
Wie sehen die Promotoren fr diese 3 verschiedenen Polymerasen aus?
Fr die RNA-Polymerase I, die vor allem die ribosomalen RNAs synthetisiert, enthlt der
Promoter einen sogenannten Core-Promoter, der die Bindungsstelle fr die Polymerase enthlt, und
eine einzige Upstream Regulatory Sequence (URS). Es handelt sich also um einen relativ einfach
strukturierten Promoter.
Fr die RNA-Polymerase II, die die proteincodierenden mRNAs und damit die weitaus grte
Anzahl unterschiedlicher Gene und vor allem auch die Gene, die vorwiegend komplex reguliert
werden mssen, transkribiert, enthlt der Promoter neben der Polymerase-Bindungsstelle einige
proximale und distale regulatorische Sequenzen. Diese weit vom Transkriptionsstart entfernten
distalen regulatorischen Sequenzen werden auch als Enhancer der Transkription bezeichnet.
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Was ist der Unterschied zwischen einem Enhancer und irgendeiner Bindungsstelle fr einen
Transkriptionsfaktor?
Es gibt eine Reihe von Transkriptionsfaktoren, die unmittelbar am Transkriptionsstart binden und
der RNA-Polymerase sozusagen den Weg zum Promoter weisen, es gibt aber auch solche, deren
Aufgabe nicht ist, der Polymerase durch physischen Kontakt bei der Bindung des Promoters zu
helfen, sie regulieren die Initiation der Transkription, also die Bindung der Polymerase, oder auch
das In-Bewegung-Setzen der Polymerase. Diese Regulatoren knnen nun proximal oder distal
binden, wobei es sich eingebrgert hat die distalen regulatorischen Bindungsstellen als Enhancer zu
bezeichnen, da dort Proteine binden, die auf irgendeine Weise das Transkriptionsereignis positiv
beeinflussen knnen, also positive Regulation darauf ausben. Es handelt sich dabei um eine
historische Bezeichnung, die Effekte der proximal bindenden Transkriptionsfaktoren unterscheiden
sich nicht zwangslufig von denen der an die Enhancer bindenden Faktoren.
Die RNA-Polymerase III hat nicht nur einen, sondern drei unterschiedliche Promotoren. Dabei
gibt es welche, die sehr hnlich aussehen wie die der Polymerase II, die also auch distale EnhancerElemente und proximale Bindungsstellen fr Regulatoren neben dem Transkriptionsstart selbst
enthalten. In vielen Fllen enthalten sie wie die Promotoren der Pol II auch eine TATA-Box, die
zwar nicht wie bei Prokaryoten im -10-Bereich des Transkriptionsstarts, aber durchaus in dessen
Nhe liegen.
Die Gene fr tRNAs bzw. eine 7S RNA (wichtig fr Translation) werden durch Promotoren
reguliert, die Bindungsstellen fr Transkriptionsfaktoren haben, die mitten im codierenden Bereich
liegen. Zustzlich existiert eine Upstream Regulatory Sequence (URS) oberhalb des
Transkriptionsstarts. Das gleiche gilt fr das 5S rRNA-Gen.
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In den meisten Fllen gibt es heutzutage eine Alternative zur radioaktiven Detektionsmethode,
nmlich die RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction). Dabei wird wieder die
zellulre RNA isoliert, diese wird dann aber reverser Transkription unterzogen, sie wird also in
cDNA umgeschrieben. Mit dieser cDNA fhrt man eine PCR mit genspezifischen Primern durch
Genexpression (Decker, Blsi)
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und trennt die amplifizierten Nukleinsuren wieder auf einem Agarosegel nach Gre auf. So
knnen mithilfe von Verdnnungsreihen die Expressionslevels unterschiedlicher Gene unmittelbar
anhand des Amplifikationsprodukts der PCR bestimmt werden.
Je mehr RNA in der Zelle vorhanden ist, desto strker wird letztendlich das Signal des PCRProdukts, so dass eine Art quantitative Bestimmung der RNA-Menge in der Zelle mglich ist.
Ein groes Problem dieses Verfahrens, weswegen es auch als semi-quantitativ bezeichnet wird, ist,
dass sich die PCR irgendwann erschpft, wenn die Nucleotide ausgehen oder die Polymerase
inaktiviert wird. Je nachdem mit welcher Menge an Nukleinsure die Reaktion begonnen wird,
desto schneller erschpft sie sich und es kommt zu einer Sttigung, bei Beginn mit einem Molekl
z.B. nach etwa 30 Cyclen, bis dorthin ist die Beziehung der Cyclenanzahl zur DNA-Menge linear,
die Produktmenge korreliert linear mit der Ausgangsmenge. Innerhalb dieses Bereichs ist die RTPCR auch tatschlich quantitativ.
Das Problem dabei ist, dass man sich nie sicher sein kann, ob man sich bei Abbruch der Reaktion
noch im linearen Bereich befindet oder nicht.
Um dieses Problem zu umgehen wurde die quantitative real-time RT-PCR entwickelt, die
mittlerweile fast universell fr solche Problemstellungen verwendet wird.
Hierbei geht man prinzipiell genauso vor wie bei einer normalen RT-PCR, der Unterschied ist, dass
es hier eine Maschine gibt, die bereits whrend der Vermehrung der cDNA in der PCR feststellen
kann wie viel Nukleinsure gebildet wurde und die Kurve anzeigen kann, von der man ablesen
kann, ob man sich noch im linearen Bereich befindet.
Dazu lagert die PCR-Maschine einen fluoreszierenden Farbstoff in die DNA ein, dessen
Fluoreszenz vom Gert gemessen wird. Je mehr DNA vorhanden ist, desto mehr Fluoreszenz wird
emittiert.
Charakteristische Werte bei der Auswertung sind die Lnge des linearen Bereichs und die
halbmaximale Menge der Nukleinsure (beides bezogen auf die Anzahl der PCR-Zyklen).
Dieses Verfahren ist fr eine berschaubare Anzahl von Genen gedacht (10-20 Gene), es gibt
heutzutage aber oft die Frage nach dem gesamten Transkriptionsprofil (= Transkriptom) einer Zelle
zu einem bestimmten Zeitpunkt oder unter bestimmten Umweltbedingungen. Dazu braucht man ein
Verfahren, mit der man die Levels aller RNAs in der Zelle gleichzeitig messen kann.
In solchen Fllen, wo das gesamte Transkriptom einer Zelle bestimmt werden soll, setzt man sehr
hufig DNA Microarrays ein.
Auf ein etwa 2x2 cm groes Trgermaterial sind in regelmigem Muster verschiedene Sonden
aufgebracht, die zu allen im untersuchten Organismus vorkommenden Genen komplementr sind.
An jeder Stelle kann also eine mRNA des Organismus hybridisiert werden. Die Hybridisierung
sorgt dafr, dass die entsprechende RNA an dieser Stelle des Trgermaterials festgehalten wird.
Das Verfahren, um festzustellen, ob eine RNA hybridisiert hat und idealerweise auch wie viel
davon, besteht darin, die RNA der Zelle mit bestimmten (unterschiedlichen) Fluoreszenzfarbstoffen
zu markieren.
Der Array kann in Hinblick auf vergleichende Analysen der Genexpression unter verschiedenen
Umwelteinflssen (z.B. unterschiedliche Nahrungsquellen) noch verbessert werden, indem
verschiedenfarbige Fluoreszenzfarbstoffe fr die unterschiedlichen Einflsse verwendet werden, um
die ursprngliche RNA der Zellen zu markieren. So knnen die Transkriptome mehrerer Zellen
simultan auf einem Genchip untersucht werden.
Sowohl die qualitative Auswertung, also die Zuordnung des Hybridisierungssignals zu dem
entsprechenden Gen des untersuchten Organismus, als auch die quantitative Auswertung, also die
Korrelation der Intensitt der Fluoreszenz mit der RNA-Menge, erfolgt dabei automatisch durch das
durchfhrende Gert.
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Die Hybridisierungssignale aus einem solchen Experiment knnen dann in eine Heat map
umgeformt werden. Dazu werden zunchst die Gene entsprechend der Strke des
Hybridisierungssignals in Gruppen zusammengestellt, das nennt man Clusterbildung.
Zustzlich wird ein Farbcode eingesetzt, der die Expressionslevels der einzelnen Gene
widerspiegelt. So knnen Microarrays sehr einfach und schnell ausgewertet werden.
Dieses Verfahren spielt zum Beispiel in der Oncologie bei der Identifikation von Tumorzellen von
Metastasen eine Rolle, um deren Ursprung feststellen und dann die richtige Behandlungsmethode
einsetzen zu knnen. Dazu wurden Expressionsprofile von unterschiedlichen Tumorzellen erstellt,
mit denen das der unbekannten Probe verglichen werden konnte.
Es gibt aber noch eine andere bessere Methode solche Expressionsprofile zu erstellen. Dieses
Verfahren beruht auf der Mglichkeit zum sogenannten Massive Parallel Sequencing oder Deep
Sequencing von DNA.
Dazu wird sogenanntes technisches Pyrosequencing eingesetzt. Die Pyrosequenzierung zusammen
mit speziellen und hochkomplexen Detektionssystemen erlaubt es, gleichzeitig Millionen
unterschiedlicher DNA-Strnge zu sequenzieren, so dass man bei einem Sequenzierlauf, der einige
Stunden dauert, etwa 1 Gb an Information erhlt.
Das bedeutet, dass es heute nicht mehr unmglich ist, die Menge einer bestimmten RNA in der
Zelle einfach dadurch zu bestimmen, dass das gesamte Transkriptom sequenziert wird.
Dazu wird wieder die gesamte RNA-Menge der Zelle isoliert, in cDNA umgeschrieben und dann
sequenziert. So kann genau bestimmt werden, wie viele Molekle von jeder RNA vorhanden sind,
man erhlt also ein sehr genaues quantitatives Transkriptionsprofil einer Zelle in einer bestimmten
Situation. Dieses Verfahren wird als RNA-Seq bezeichnet.
Als nchstes stellt sich die Frage, ob die vernderte Expression eine Folge von
Transkriptionskontrolle ist.
Die eigentliche Transkriptionskontrolle reguliert die Transkriptionsrate, sie bestimmt also wie viel
RNA produziert wird.
Aber auch der Vorgang der Prozessierung der RNA, der erfolgt, um eine pre-mRNA in eine reife
Genexpression (Decker, Blsi)
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mRNA zu berfhren, der Transport aus dem Zellkern und die unterschiedliche Stabilitt der
verschiedenen Transkripte spielen in der Genregulation eine wichtige Rolle.
Die RNA-Menge in einer Zelle ist immer eine Konsequenz von Aufbau (Transkription) und Abbau.
Das heit, dass die in einer Zelle detektierte Steady-State-Menge (Gleichgewichtsmenge) einer
RNA nicht automatisch auch mit der Transkriptionsrate korrelieren muss.
Man braucht also ein Verfahren, um festzustellen, ob es sich bei der Regulation eines Gens
tatschlich um Transkriptionskontrolle handelt. Die bis jetzt beste und quantitativste Methode
dafr stellt der Nuclear Run-On Assay dar.
Dabei wird der Zellkern der zu untersuchenden Zelle isoliert und auf Eis gelegt, so dass die
Polymerasen, die gerade dabei waren ein Gen zu transkribieren, daran festfrieren und die
Transkription abgebrochen wird, die Polymerasen aber nicht von der DNA abfallen.
Die Transkriptionsrate eines Gens ist direkt damit korreliert, wie viele Polymerasen dieses Gen
gerade transkribieren, es kann also die nchste Initiation der Transkription schon erfolgen bevor die
vorige Polymerase das betreffende Gen fertig transkribiert hat. Je mehr Polymerasen nun
gleichzeitig an einem Gen sitzen und dieses transkribieren, desto hher ist die Transkriptionsrate.
Dann werden den Zellkernen radioaktive Nucleotide (in aller Regel 32P-markiertes UTP) zur
Verfgung gestellt und sie werden wieder aufgetaut. Daraufhin setzen die Polymerasen ihre
unterbrochene Transkription fort, bauen nun aber in die gebildete RNA radioaktives UTP ein. Je
hher die Transkriptionsrate, desto mehr Polymerasen sitzen auf dem betreffenden Gen und desto
mehr radioaktives UTP wird eingebaut. Dadurch erhlt man ein radioaktives Signal, das der
Transkriptionsrate proportional ist.
Dazu wird wieder ein Hybridisierungsverfahren mit (einigen wenigen) immobilisierten Sonden
(Macroarray) und im Anschluss Autoradiographie durchgefhrt.
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Die nchsten Fragen: Worauf beruht die Transkriptionskontrolle? Wie sieht der Promoter aus? Was
fr Bindungsstellen besitzt er? Welche Transkriptionsfaktoren binden dort?
Dazu muss zunchst der Promoter isoliert werden.
Historisch wurde der Promoter aus sogenannten genomischen Genbanken oder -bibliotheken
isoliert. Diese genomischen Bibliotheken wurden erstellt, indem die gesamte zellulre DNA isoliert,
mit Restriktionsenzymen verdaut und in -Phagen vermehrt wurde.
Das Restriktionsenzym wird dabei in einer nicht zu hohen Konzentration zugegeben, so dass es
nicht bei jeder seiner Schnittstellen schneidet, sondern nur ungefhr alle 20.000 Basenpaare einmal.
Da die dadurch tatschlich geschnittenen Stellen nicht festgelegt sind, entstehen dabei viele etwa 20
kb lange berlappende DNA-Fragmente ( = partieller Restriktionsverdau).
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Der nchste Schritt ist, sich zu vergewissern, dass das so amplifizierte Stck DNA auch tatschlich
den gesuchten Promoter enthlt.
Dazu kann man bei E. coli das Stck einfach sequenzieren und anhand der -10- und -35-Bereiche
relativ genau den Transkriptionsstart identifizieren, besonders bei Eukaryoten ist der
Transkriptionsstart aber weniger gut durch bestimmte Sequenzen definiert.
Fr diese Problemstellungen wurden bisher zwei Methoden entwickelt, Primer Extension und S1
Mapping.
Beide Verfahren stellen die Frage, ob eine DNA das zu einer mRNA komplementre 5'-Ende
enthlt. Das 5'-Ende der mRNA ist komplementr zum Transkriptionsstart.
Kann man nachweisen, dass die klonierte DNA die Komplementrsequenz des 5'-Endes der mRNA
enthlt, kann man sicher sein, dass es sich bei der isolierten Sequenz um den Promoter handelt.
Bei der Primer Extension wird ein Primer generiert, von dem man genau wei an welcher Stelle
des Plasmids mit der klonierten DNA die fr den Primer komplementre Sequenz liegt. Der Primer
wird aber nicht an dieses klonierte Plasmid hybridisiert, sondern an die entsprechende RNA. Dazu
Genexpression (Decker, Blsi)
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wird die gesamte zellulre RNA aus einer relevanten Zelle isoliert und mit dem Primer versetzt, der
dann an die komplementre RNA hybridisiert. Das wird so gemacht, dass der Primer nicht allzu
weit von der Stelle entfernt zu liegen kommt, an der man das 5'-Ende und damit den
Transkriptionsstart erwartet.
Nach Hybridisierung des Primers an die RNA wird Reverse Transcriptase zugegeben, die den
Primer idealerweise bis zum 5'-Ende des betreffenden Gens verlngert. Da der Primer auerdem
radioaktiv markiert wurde, erhlt man nach der Reversen Transkription ein radioaktives
Nukleinsure-Fragment, das der Lnge entspricht, die von dem Ansatz des Primers bis zum 5'-Ende
des Gens reicht.
Hat man die Lnge des Fragments, wei man genau, wie viel man upstream an die Primersequenz
anfgen muss, um an den Transkriptionsstart zu kommen.
Ein alternatives Verfahren zur Identifikation eines Promoters stellt das S1 Nuclease-Mapping dar.
Dabei wird das Fragment der klonierten DNA, von dem man vermutet, dass es den
Transkriptionsstart enthlt, isoliert, die beiden Strnge werden denaturiert und an die entsprechende
RNA der Zelle hybridisiert. So erhlt man ein Hybrid aus der S1-Probe, die man isoliert hat, und
der entsprechenden mRNA der Zelle.
Um jetzt nicht nur zu erfahren, ob ein Transkriptionsstart in der DNA-Sequenz vorhanden ist,
sondern auch wo er liegt, wird die S1-Endonuclease eingesetzt. Diese entfernt die berhngenden
einzelstrngigen Enden und lsst nur den doppelstrngigen Bereich brig. Die Lnge des
doppelstrngigen Bereichs entspricht dann genau der Lnge vom Anfang des DNA-Fragments bis
zum Transkriptionsstart.
Ist das Fragment radioaktiv markiert, kann man wieder das bliche Verfahren bestehend aus
Elektrophorese gefolgt von Autoradiographie durchfhren und erhlt so die Lnge des Fragments,
durch die man wieder genau wei wie weit der Transkriptionsstart von der radioaktiven Markierung
des Fragments entfernt liegt. Liegt dieser innerhalb des klonierten Fragments, wei man, dass in
diesem Fragment der Promoter bzw. der Transkriptionsstart liegt.
Man hat nun also einen Promoter auf einem DNA-Fragment, man wei aber nicht, wo sich die fr
den Promoter wichtigen Sequenzen befinden.
Wo sind Sequenzen, an die irgendwelche transkriptionellen Regulatoren binden?
Dazu braucht man zunchst ein Verfahren, das einem hilft, zu entscheiden, ob ein Promoter in der
klonierten DNA funktioniert oder nicht, nmlich den Reportergen-Assay.
Dabei wird der mittlerweile besttigte Promoter mit einem Gen, das einem erlaubt festzustellen, ob
der Promoter tatschlich funktioniert (= Reportergen), fusioniert. Je mehr dann von diesem
Genprodukt gebildet wird, desto besser funktioniert der Promoter.
Um die Promoter-Aktivitt zu messen, muss dieser natrlich erst zurck in eine Zelle gebracht
werden, die das betreffende Gen tatschlich transkribieren kann. Das wird mithilfe der transienten
Transfektion gemacht.
Kann die Zelle den Promoter tatschlich transkribieren, wird das Reportergen produziert, die Zelle
kann im Anschluss lysiert werden und man kann herausfinden wie viel von dem Genprodukt
entstanden ist.
Damit das einfach gemacht werden kann, muss das Genprodukt, das das Reportergen codiert, eines
sein, das in der Zelle, in der der Assay durchgefhrt wird, ursprnglich nicht vorkommt. Nimmt
man zum Beispiel ein glykolytisches Enzym als Reportergen, kann das Verfahren nicht
funktionieren, da dieses Enzym auch natrlicherweise in der Zelle vorkommt, was es natrlich
schwierig bis unmglich macht festzustellen, ob das Genprodukt vom klonierten DNA-Fragment
oder von der genomischen DNA der Zelle stammt.
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Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlnge grne Fluoreszenzstrahlung emittiert. Diese
Methode ist zwar weniger quantitativ als die mit Luciferase, kann dafr aber auch in lebenden
Zellen angewandt werden.
Eine sehr selten eingesetzte Methode ist die Verwendung der -Galactosidase als Reportergen, das
mit einer relativ einfachen Farbreaktion nachgewiesen werden kann, es ist aber dennoch
komplizierter als bei Luciferase, die heutzutage in der Regel die bevorzugte Wahl bei der Suche
nach einem Reportergen darstellt, es sei denn die Analyse soll in lebenden Zellen durchgefhrt
werden, dann benutzt man das GFP.
Mchte man ein Reportergen-Assay durchfhren, muss man das Konstrukt aus Promoter und
Reportergen in eine Zelle einbringen, in der man die Promoter-Aktivitt messen kann. Das gestaltet
sich bei Eukaryoten und vor allem bei Sugerzellen nicht so einfach wie bei E. coli, wo eine
klassische Transformation mit Heat shock ausreicht.
Der ursprngliche Weg, um Sugerzellen dazu zu zwingen, Fremd-DNA aufzunehmen, war eine
Calcium-Phosphat-Koprzipitation mit der DNA durchzufhren. Dabei wird zunchst ein
Calcium-haltiger Puffer zum Plasmid gegeben, in den dann langsam eine Phosphatlsung getropft
wird. Dadurch bilden sich kleine Calcium-Phosphat-Kristalle, die die DNA mit einschlieen. Gibt
man dieses Koprzipitat aus Calcium, Phosphat und DNA auf eine Zelle, nimmt sie diese kleinen
Kristalle und damit die DNA durch Endocytose auf.
Eine andere mgliche Methode ist die sogenannte Elektroporation. Dabei hat man einen
physiologischen Puffer, was bedeutet, dass man Zellen hineingeben kann, ohne dass diese gleich
platzen. In diesem Puffer befindet sich die DNA, die von den Zellen aufgenommen werden soll und
die Zellen selbst. Das Ganze wird in ein elektrisches Feld gebracht, das einen sehr kurzen, aber
relativ starken Strompuls erzeugt. Dadurch entstehen Poren in der Zellmembran, die sich wieder
schlieen, sobald das elektrische Feld weg ist, whrend der kurzen Zeit, wo diese Poren vorhanden
waren, kann aber DNA von auen in die Zelle gelangen. Diese Methode hat den Nachteil, dass
meistens relativ viele Zellen in dem elektrischen Feld sterben, so dass man nur relativ wenige
transfizierte Zellen erhlt.
Am hufigsten wird die sogenannte Lipofektion eingesetzt. Dabei werden kationische (positiv
geladene) Lipide verwendet, die einen Komplex mit der DNA bilden knnen, die man in die Zelle
bringen mchte, aber gleichzeitig auch mit der Zellmembran fusionieren knnen. Durch die Fusion
mit der Zellmembran kann die DNA nach innen in die Zelle gestlpt werden.
Infektion mit Viren ist auch eine mgliche Methode, man kann also die DNA, die in die Zelle
eingebracht werden soll, zunchst in einen viralen Vektor einbringen, daraus das Virus entstehen
lassen und dieses dann die Zelle infizieren lassen.
In Fllen, wo man sehen mchte wie einzelne Zellen auf die Transfektion mit Fremd-DNA
reagieren, kann man Mikroinjektion verwenden. Dabei hat man ein Mikroskop, einen sogenannten
Mikromanipulator, in den eine Pipette mit einer sehr fein ausgezogenen Spitze eingebracht wird.
Mit dieser Pipette wird nanoliterweise die zu transfizierende DNA aufgesaugt, die Pipette wird
mithilfe des Mikroskops vorsichtig in die Zelle manvriert und 1-2 nL der DNA-haltigen
Flssigkeit wird in die Zelle gebracht. Dieses Verfahren wird aber aufgrund seiner Komplexitt nur
verwendet, wenn festgestellt werden soll, wie einzelne Zellen auf die Transfektion reagieren.
Man unterscheidet beim Gentransfer in Sugerzellen zwei grundlegende Mglichkeiten.
Bei der transienten Transfektion befindet sich die transfizierte DNA nur vorbergehend in der
Genexpression (Decker, Blsi)
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Zelle, wird aber nicht mit dieser gemeinsam vermehrt, was bedeutet, dass das eingebrachte Plasmid
bei der Vermehrung der Zelle herausverdnnt wird.
Es gibt aber auch die Mglichkeit der stabilen Transfektion, die auf die sehr wenigen transfizierten
Zellen setzt, die das eingebrachte Plasmid in ihr Genom integrieren.
Mittlerweile gibt es Verfahren, die schon am Computer helfen knnen, wichtige regulatorische
Stellen zu finden und zwar durch das sogenannte Phylogenetic Footprinting. Das ist im Grunde
ein schneres Wort fr Sequenzvergleiche, bei denen man die Homologien von DNA-Sequenzen in
homologen Genen von evolutionr unterschiedlich distanten Organismen bestimmt. Die
evolutionre Distanz macht sich dabei dadurch bemerkbar, dass im Vergleich der Sequenzen
weniger Homologie anzeigende Peaks entstehen.
Auf DNA, die keine Funktion wahrnimmt, wirkt kein Selektionsdruck in der Evolution, was
bedeutet, dass mit der Diversifizierung der Organismen auch die DNA-Sequenzen diversifizieren.
Das bedeutet wiederum, dass die Abweichungen zwischen nicht-codierenden DNA-Sequenzen
proportional zu ihrer evolutionren Distanz ist.
Liegen dort aber wichtige regulatorische Sequenzen, wirkt Selektionsdruck darauf, um z.B. eine
Bindungsstelle fr ein Protein zu unterhalten, und es werden auch in nicht-codierenden Bereichen
die DNA-Sequenzen gleich bleiben.
Wo binden Transkriptionsfaktoren?
Dabei wird das sogenannte Footprinting-Verfahren
angewendet. Dazu wird das DNA-Fragment isoliert,
radioaktiv markiert und es wird ein limitierter DNaseVerdau durchgefhrt, so dass die DNase jedes Fragment
einmal schneidet und man eine Art Leiter von DNAFragmenten erhlt, die sich voneinander immer durch ein
Nucleotid unterscheiden. In einem parallelen Ansatz wird
die DNA vorher mit einem Kernextrakt gemischt, der die
wichtigsten Transkriptionsfaktoren enthlt, was bedeutet,
dass diese an ihre Bindungsstellen auf der DNA binden
und so diese Stellen vor dem Verdau durch die DNase
schtzen. Dort, wo die Bindungsstelle des Proteins ist,
entstehen
also
keine
Fragmente
und
bei
elektrophoretischer Auftrennung entstehen in diesen
Bereichen Lcher in den Banden, die als DNase
Footprint bezeichnet werden.
Ein wesentlich einfacheres Verfahren ist der sogenannte Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA). Dabei muss man schon wissen, wo die Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle ist, dann kann
man damit aber relativ leicht die Frage beantworten, ob der entsprechende Transkriptionsfaktor in
einer bestimmten Situation in der Zelle vorhanden ist bzw. wie viel davon vorhanden ist.
Man hat ein DNA-Fragment, auf dem man eine Bindungsstelle fr einen Transkriptionsfaktor schon
mittels Footprinting identifiziert hat. Davon synthetisiert man ein kleines DNA-Fragment, das
gerade diese Bindungsstelle umfasst, markiert es radioaktiv und mischt es wieder mit einem
Kernextrakt. Die Frage ist nun, wie viel von dem Transkriptionsfaktor, der dort bindet, in diesem
Kernextrakt vorhanden ist. Das DNA-Fragment wird also im berschuss zugegeben, so dass jeder
Transskriptionsfaktor, der an dieser Stelle bindet, auch ein solches Fragment findet. Dieses Gemisch
Genexpression (Decker, Blsi)
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Transkriptionsfaktor machen?
Man fhrt also als nchstes eine StrukturFunktion-Analyse durch, bei der man fragt,
welche Strukturen des Proteins ihm seine
Funktion als Transkriptionsfaktor verleihen.
Dazu macht man sich zunutze, dass der
Transkriptionsfaktor
bereits
gencloniert
vorliegt. Dadurch kann man gezielt Deletionen
in die cDNA einfhren und erhlt so
verstmmelte (truncated) Proteine. Diese
deletierten cDNA-Mutationen knnen wieder
unter Kotransfektion in Zellen eingebracht
werden und man kann so die Funktion des
Transkriptionsfaktors
berprfen.
Die
Funktionsfhigkeit wird nach zweierlei Kriterien gemessen, zum einen anhand seiner Fhigkeit
seine spezifische Bindungsstelle auf dem Promoter zu erkennen und zu binden ( EMSA), zum
anderen anhand seiner Fhigkeit als Transkriptionsfaktor die Expression des betreffenden Gens zu
stimulieren ( Reportergen-Assay). Auf diese Weise kann man eine Kartierung durchfhren, die
es einem erlaubt Aussagen darber zu machen, wo in dem Protein funktionell wichtige Domnen
liegen.
Die Domne, die dafr verantwortlich ist, dass ein Transkriptionsfaktor nach seiner Bindung an die
DNA in der Lage ist ein Transkriptionsereignis zu regulieren, wird als die Transaktivierende
Domne (TAD) bezeichnet, die Domne, die fr die Bindung der DNA verantwortlich ist, nennt
man DNA-bindende Domne (DBD).
Durch solche Kartierungen von Transkriptionsfaktoren nach deren funktionellen Domnen konnte
festgestellt werden, dass es keine Regeln gibt, wo diese Domnen innerhalb des Proteins liegen.
Die letzte Frage, die es zu beantworten gibt, ist nun, mit welchen anderen Proteinen der
Transkriptionsfaktor interagiert.
Ein Transkriptionsfaktor muss ja immer auf irgendeine Weise die Aktivitt der Polymerase
verndern. Er kann z.B. die DNA-Bindung der RNA-Polymerase beeinflussen, er kann
beeinflussen, ob eine bereits an die DNA gebundene RNA-Polymerase anfngt zu transkribieren
oder auch deren Fhigkeit zur Elongation.
All diese Funktionen liegen nicht in dem einen Transkriptionsfaktor, er ist nur ein wichtiges
Strukturelement in einem groen Spielfeld, das insgesamt die Genexpression reguliert.
Man muss nun also diesen Transkriptionsfaktor irgendwie in den Kontext anderer Proteine und
Proteinkomplexe stellen, die einem letztlich ein Verstndnis darber vermitteln, wie er eigentlich
funktioniert.
Es gibt zwei grundlegende Verfahren zur Identifikation von interagierenden Proteinen.
Das erste, das heutzutage eigentlich kaum noch verwendet wird, ist das Yeast Two-Hybrid System
(Y2H-System). Das Ganze beruht darauf, dass in einen Hefestamm zunchst ein Gen des HistidinStoffwechsels als Reportergen eingebracht wird, das es den Hefezellen erlaubt, ohne Zugabe von
Histidin zum Medium zu berleben, sie sind dann also prototroph fr Histidin. Dieses Histidin-Gen
wird an einen Promoter fusioniert, der der Kontrolle eines Transkriptionsfaktors untersteht. Bei
Transkriptionsfaktoren wie GAL4, wo die funktionell wichtigen Domnen weit auseinander liegen,
knnen diese Teile des Proteins leicht voneinander getrennt werden. Diese Eigenschaft macht man
sich bei dem Y2H-System zunutze, man teilt das Gen in eine cDNA, die die TAD codiert, und eine
Genexpression (Decker, Blsi)
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von den positiv geladenen Aminogruppen an den N-Termini oder binden an die negativ geladenen
Hydroxylgruppen an den C-Termini, so dass es einen pH-Wert gibt, bei dem die Moleklladung
genau ausgeglichen ist, dass also alle Hydroxylgruppen mit H + gesttigt sind, die Aminogruppen
aber noch keine Protonen aufgenommen haben.
Nach dieser 2D-Elektrophorese isoliert man die erhaltenen Proteine und fhrt einen Proteaseverdau
durch, in der Regel mit Trypsin (= Gemisch dreier Verdauungsenzyme, die im Dnndarm Proteine
zersetzen: Trypsin-1, -2 und -4). Dadurch erhlt man Peptide der einzelnen Proteine, deren Masse
man durch Massenspektrometrie bestimmt. Das Massenspektrometer trennt diese Peptide nach
ihrem Masse-Ladung-Verhltnis auf, so dass man einen sogenannten Fingerprint des Proteins erhlt,
gemessen an den Peptiden, die der Trypsinverdau erzeugt hat.
Da jedes Protein nach so einem Proteaseverdau mit Trypsin einen charakteristischen Fingerprint
zeigt, kann man den erhaltenen Fingerprint wieder ber bestimmte Datenbanken einem bestimmten
Protein zuordnen.
Transkriptionsfaktoren:
Was ist die einheitliche Grundstruktur eines Transkriptionsfaktors?
Ein Transkriptionsfaktor hat immer eine DNA-bindende Domne (DBD), da jeder
Transkriptionsfaktor an DNA binden knnen muss, und eine Transaktivierende Domne (TAD), die
den Teil des Transkriptionsfaktor darstellt, die es ihm erlaubt mit der brigen Maschinerie, die in die
Regulation von Transkriptionsereignissen involviert ist, zu kommunizieren.
Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass sowohl bei Prokaryoten als auch bei Eukaryoten die meisten
Transkriptionsfaktoren nicht als Monomere aktiv sind, sondern als Dimere. Das bedeutet, dass
Transkriptionsfaktoren in der Regel noch eine dritte funktionelle Domne besitzen, die
Genexpression (Decker, Blsi)
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Funktionelle Klassifikation:
Ein Transkriptionsfaktor kann also entweder immer in der Zelle vorhanden sein, oder er kann nur zu
bestimmten Zeitpunkten der Entwicklung gebildet werden, ist dann aber aktiv, oder er wird zwar
immer gebildet, braucht aber ein bestimmtes Signal, um aktiv zu werden.
Strukturelle Klassifikation:
Die Basic region kommt immer in Zusammenhang mit einer Dimerisierungsdomne vor, die die
Leucine-Zipper- bzw. die Helix-Loop-Helix-Domne darstellt.
Bei dieser ersten Superklasse gibt es also zwei verschiedene Arten von Dimerisierungsdomnen,
den Leucine-Zipper und die Helix-Loop-Helix-Domne, in beiden Fllen ist die DNA-bindende
Domne aber eine sogenannte Basic Region.
Die Basic Region ist eine rein helikale Domne von Proteinen, die miteinander dimerisieren
mssen. Die Basic Region enthlt eine Reihe von Aminosuren, die bei physiologischem pH-Wert
positiv geladen sind. Das bedeutet, dass sie mit der bei physiologischem pH-Wert negativ geladenen
DNA gut interagieren kann, die Affinitt der Interaktion wird hier ganz wesentlich durch
elektrostatische Wechselwirkungen charakterisiert.
Die Dimerisierungsdomne ist z.B. der Leucine Zipper. Der Leucine Zipper ist ein ebenfalls
helikaler Bereich, der aber eine amphipathische Helix bildet.
Amphipathisch bedeutet, dass die Aminosuren in dieser Helix so
angeordnet sind, dass auf der einen Seite hydrophile Aminosurereste zu
liegen kommen und auf der anderen Seite der Helix hydrophobe
Aminosuren, klassischerweise Leucine. Das bedeutet, dass die
Dimerisierung dieser Proteine dadurch zustande kommt, dass die
hydrophoben Aminosuren, die auf der Innenseite der amphipathischen
Helix liegen, miteinander interagieren und zwar getrieben durch Entropie
( hydrophobe Wechselwirkungen).
Leucine Zipper-Proteine knnen sowohl Homodimere (2 gleiche Partner) als auch Heterodimere (2
unterschiedliche Partner) bilden, wenn die beteiligten Proteine kompatible Leucine ZipperDomnen besitzen.
Leucine Zipper sind eine Unterkategorie der Coiled-coil-Domnen. Das sind Domnen, bei denen
Helices Interaktionen mit anderen Helices bilden.
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Die historisch erste DBD, die man kannte, ist die sogenannte Helix-TurnHelix-Struktur, die vor allem in vielen entwicklungsbiologisch wichtigen
Transkriptionsfaktoren vorkommt, dazu gehren z.B. Homodomnen,
Paired Box- oder Fork head- bzw. Winged helix-Strukturen.
Die Struktur besteht grundstzlich aus drei Helices, zwischen Helix 1 und 2 befindet sich
ein sogenannter -Turn, also eine Schlaufe, bei
der die Aminosuresequenz ihre Richtung
ndert. Diese beiden Helices kontaktieren dann
eine dritte Helix, die Helix 3, die die
eigentliche Recognition Helix darstellt, die sich also in die groe
Furche der DNA einlagert und die basenspezifischen Kontakte knpft.
Der N-Terminus dieser Struktur greift zustzlich von der anderen Seite
um die Helix herum und stellt auch auf der anderen Seite der Helix, in
der kleinen Furche der DNA, basenspezifische Kontakte her.
Zu guter Letzt gibt es noch die -Scaffoldproteine. Diese Proteine stellen eine Besonderheit dar, da
sie nicht wie die anderen Transkriptionsfaktoren hauptschlich die leichter zugngliche groe
Furche der DNA kontaktieren, sondern die kleine DNA-Furche.
Sie sind charakterisiert durch eine ausgedehnte -Faltblattstruktur der DBD, dazu gehren z.B.
Proteine der NF-B-Familie, die STAT-Proteine, das Antioncogen oder Tumorsuppressorgen p53
oder der generelle Transkriptionsfaktor TATA-binding Protein (TBP).
Transkriptionsfaktoren knnen aber auch anhand ihrer Dimerisierungsdomnen klassifiziert werden.
Da gibt es z.B. den Leucine Zipper, die Helix-Loop-Helix-Domne, die beide Beispiele fr Coiledcoil-Domnen sind.
Es gibt eine Familie von Transkriptionsfaktoren, nmlich die STAT-Proteine, die zur Dimerisierung
eine SH2-Domne benutzen. SH2-Domnen sind Proteinmodule, die in der Lage sind ber ein
bestimmtes kritisches Arginin an Phosphotyrosinreste von Partnerproteinen zu binden. Mit nicht
phosphoryliertem Tyrosin findet keine Interaktion statt.
Transaktivierende Domnen (TADs) knnen prinzipiell auch zur Klassifikation herangezogen
werden, das gestaltet sich aber schwierig, weil sie keine klar ausgeprgten Strukturen bilden. Sie
zeichnen sich in aller Regel vor allem dadurch aus, dass sie keine ausgeprgten Sekundrstrukturen
bilden und sind deshalb auch sehr schwer zu kristallisieren, da die Fhigkeit eines Proteins Kristalle
zu bilden, die man dann mittels Rntgenstrukturanalyse bestimmen kann, beruht darauf, dass stabile
Sekundrstrukturen gebildet werden, die man dann in den Kristallen wiederfindet.
In unterschiedlichen Transaktivierenden Domnen findet man aber Hufungen bestimmter
Aminosuren, wodurch diese Domnen gekennzeichnet sind:
Saure TADs (Glu, Asp)
Gln-reiche TADs
Pro-reiche TADs
Ser/Thr-reiche TADs
Der Unterschied zwischen diesen einzelnen Klassen an TADs ist, dass sie vermutlich
unterschiedliche Arten aufweisen, mit der Transkriptionsmaschinerie zu interagieren, also mit den
anderen Proteinen, die gebraucht werden, um das Transkriptionsereignis in Gang zu setzen.
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Die tiefgestellte rmische Ziffer im Namen eines generellen Transkriptionsfaktors gibt an, fr
welche der drei RNA-Polymerasen der jeweilige Transkriptionsfaktor zustndig ist.
Diese generellen Transkriptionsfaktoren sind oft kleine Proteinkomplexe, TF IIA ist z.B. ein Dimer,
TFIIB ist ein Proteinkomplex, der ein sogenanntes TATA-binding Protein (TBP) enthlt, das ihm
erlaubt die TATA-Box zu erkennen, sofern es eine gibt, und 11 sogenannte TBP-associated Factors
(TAFs), TFIIH besteht aus 9 Untereinheiten.
Wie erfolgt die Bildung des Initiationskomplexes?
Das erste, das stattfinden muss, ist die Bindung von TFIID
an den Initiationsstart, dabei ist die TATA-Box nur eine
von mehreren Mglichkeiten TFIID an de Promoter zu
bringen.
Wenn TFIID an die TATA-Box bindet, tut er dies mithilfe
seiner Untereinheit TBP.
Das nchste, das gebunden werden muss, ist das TFIIA,
das die Bindung von TFIID an die DNA stabilisiert, dann
folgt TFIIB, der sozusagen die Brcke zur RNAPolymerase schlgt, da er auf der einen Seite mit TF IID
und auf der anderen Seite mit der RNA-Pol interagieren
kann.
An die RNA-Polymerase ist ein weiterer genereller
Transkriptionsfaktor permanent assoziiert, nmlich das
TFIIF. Wenn das gebunden ist, binden TFIIE und TFIIH,
was den Initiationskomplex komplettiert.
Welche
Funktion
haben
die
einzelnen
Transkriptionsfaktoren?
TFIID erkennt den Promoter, die mit TFIID assoziierten
TAFs haben die Funktion die Bindung von TF IID
regulierbar zu machen, sie kommunizieren mit
Transkriptionsfaktoren, die die TFIID-Bindung regulieren.
TBP hat noch eine weitere Funktion, es fhrt eine
Krmmung in die DNA ein,die offenbar wichtig fr die
Bindung der Polymerase ist.
TFIIB kontaktiert die Polymerase selbst und TF IIH phosphoryliert die carboxyterminale Domne
(CTD) der Polymerase, diese posttranslationale Modifikation der RNA-Polymerase II ist offenbar
ebenfalls ein wichtiger Bestandteil des Transkriptionszyklus.
Es gibt eine klar definierte Reihenfolge wie diese generellen oder basalen Transkriptionsfaktoren an
die DNA binden mssen.
Woher ist diese Reihenfolge und auch erstmal ihre Existenz bekannt?
Dafr wurde EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) eingesetzt. Dabei hat man ein kleines
Stck DNA, das einerseits radioaktiv markiert ist, um es durch Autoradiographie leicht sichtbar
machen zu knnen, und andererseits Bindungsstellen fr einen oder mehrere Transkriptionsfaktoren
enthlt. Dieses Stck DNA enthlt eine Transkriptionsinitiationsstelle, die man auch als minimaler
oder basaler Promoter bezeichnet. Ein solcher minimaler Promoter enthlt die Initiationsstelle und
den Teil, der bentigt wird, um den Initiationskomplex zu bilden.
Jedes Protein, das nun an diese Sonde bindet, erhht das Molekulargewicht und macht die Sonde in
der Gelelektrophorese langsamer. Der Unterschied zwischen der Migrationsweite der freien
ungebundenen Sonde und der der proteingebundenen Sonde wird als Electrophoretic Mobility Shift
Genexpression (Decker, Blsi)
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bezeichnet.
Durch einzelne Zugabe der verschiedenen aufgereinigten generellen Transkriptionsfaktoren konnte
festgestellt werden, dass nur TFIID wirklich zur Bindung an die freie Sonde gebracht werden konnte
und so weiter.
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Der nchste Schritt ist die Bildung des TFIIB-TFIID-Komplexes. TFIIB ist in der Lage, das TBP
direkt zu kontaktieren, wodurch das TFIIB in den Initiationskomplex gebracht wird.
Die sogenannte Linker-Domne von TFIIB bindet dann die Rudder-Domne der Polymerase, die
spter bei der Trennung der Nucleotidstrnge wichtig ist, und der N-Terminus von TF IIB reicht bis
in das aktive Zentrum der Polymerase hinein.
Das TFIIB hilft jetzt im Zuge der Bildung des offenen Promoterkomplexes bei der Erkennung des
Transkriptionsstarts, weil die sogenannte Reader-Domne des TFIIBs in der Lage ist, diesen zu
erkennen und der Polymerase vermittelt, wo sie die DNA-Strnge trennen soll.
TFIIB wird dann wieder verdrngt, wenn die RNA-Polymerase anfngt zu transkribieren, da die
gebildete RNA das TFIIB aus dem aktiven Zentrum des Enzyms verdrngt, wodurch die Bindung
von TFIIB an die Polymerase allgemein so geschwcht wird, dass diese schlielich verloren geht.
TFIIB hat also eine sehr wichtige passive Funktion beim Rekrutieren der Polymerase und beim
Brckenschlag zwischen TBP und der Polymerase, andererseits aber auch eine aktive Funktion
beim Auffinden des Transkriptionsstarts und bei der Strangtrennung im Bereich des
Transkriptionsstarts.
Der Transkriptionszyklus ist auch ein Phosphorylierungszyklus. Das heit, die RNA-Polymerase
II existiert immer in zwei Formen bezogen auf ihren Phosphorylierungsstatus, nmlich in der
sogenannten II0-Form oder der IIA-Form. Die IIA-Form ist die nicht-phosphorylierte Form und
diejenige, die an der Initiation beteiligt ist.
Im Zuge der Initiation wird nun aber eine bestimmte Domne der RNA-Polymerase II, nmlich die
sogenannte carboxyterminale Domne (CTD), phosphoryliert. Das transkribierende Enzym ist
dann stark phosphoryliert und erst nach Beendigung der Transkription und dem Abfallen vom
Template findet eine Dephosphorylierung der Polymerase statt, so dass aus der II0-Form wieder die
IIA-Form gebildet wird, die dann wieder in der Lage ist, ein Initiationsereignis zu durchlaufen.
Fr diese Phosphorylierung sind zwei Proteinkomplexe verantwortlich, der erste ist einer, der selbst
ein genereller Transkriptionsfaktor ist, nmlich TFIIH. TFIIH enthlt also eine enzymatische
Aktivitt, nmlich die einer Proteinkinase, genauer gesagt einer Serin/Threonin-Kinase.
TFIIH existiert in zwei strukturell unterschiedlichen Formen, einer, die fr die Initiation der
Transkription bzw. die Promoter Clearance wichtig ist, und einer, die wichtig fr die DNAReparaturfunktion ist.
Den beiden Komplexen ist das sogenannte Core, also die zentrale Einheit, gemeinsam. Diese
zentrale Einheit besteht aus den Proteinen XPB und XPD sowie
4 weiteren nach ihrem Molekulargewicht benannten
Untereinheiten (p34, p44, p52, p62). Der Grund warum diese
so hervorgehoben werden ist, dass sie eine zweite wichtige
enzymatische Funktion bernehmen, die in diesem TFIIHKomplex beinhaltet ist, nmlich die einer DNA-Helicase, d.h.
TFIIH ist nicht nur fr die Phosphorylierung der RNAPolymerase, sondern durch seine Helicase-Funktion auch bei
der Strangtrennung im Initiationsbereich wichtig.
Das Core beinhaltet also die Helicase-Funktion, die sowohl bei
der Promoter Clearance als auch bei der DNA-Reparatur
bentigt wird, bei der Clearance braucht man aber auch die
Kinasefunktion, die spezifisch zum Core hinzukommt.
Diese Kinasefunktion liegt in zwei Proteinen, in einer Kinase,
die einer Zellzyklus-Kinase hnlich ist und deshalb CDK7 genannt wird und in dem diese
regulierenden Cyclin, dem Cyclin H.
Die Core-Untereinheit assoziiert mit der Kinasefunktion, um den Clearance-Komplex zu bilden.
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Die Kinasefunktion besteht aus den drei Proteinen CDK7, Cyclin H und MAT1.
Wenn bei der Transkription eine Schdigung der DNA auftritt und die RNA-Polymerase deshalb
pausieren muss, bindet der TFIIH-Reparaturkomplex und hilft bei der Reparatur.
Man kann den Phosphorylierungszustand der RNAPolymerase an den polytnen Riesenchromosomen von
Drosophila mikroskopisch sichtbar machen. Dazu wurden die
Chromosomen mit zwei unterschiedlich fluoreszierenden
Antikrpern gefrbt, wovon einer nur das phosphorylierte
Enzym erkennt und der andere nur das nicht-phosphorylierte
Enzym.
Phosphorylierte
RNA-Polymerase
findet
sich vor allem in den
sogenannten Puffs der
Chromosomen. Puffs sind
die Bereiche, die stark
transkribiert werden. Das
nicht-phosphorylierte
Enzym ist mit Bereichen
assoziiert, wo es keine
ausgeprgten Puffs gibt,
d.h. es handelt sich dabei
vermutlich um eine eher
unspezifische Assoziation
mit der DNA.
5. Vorlesung (24.04.2012):
Die Initiation der Transkription ist derjenige Schritt, der am Transkriptionsstart einen Komplex
aufbaut, innerhalb dessen die RNA-Polymerase an den Promoter rekrutiert wird. Die Initiation geht
damit einher, dass zunchst eine Reihe von sogenannten generellen Transkriptionsfaktoren einen
solchen Komplex bilden. Zu diesem Komplex gehrt auch der generelle Transkriptionsfaktor TF IIH,
der unter anderem die Aufgabe hat, die RNA-Polymerase zu phosphorylieren.
Der Transkriptionszyklus ist auch ein Phosphorylierung/Dephosphorylierungszyklus, der zwischen
der IIA- und der II0-Form der Polymerase unterscheidet. Die phosphorylierte Form ist diejenige,
die elongiert, die Phosphorylierung geschieht im Rahmen der Initiation. Die RNA-Polymerase
bleibt phosphoryliert bis sie wieder vom DNA-Templatestrang abfllt und wird dann von der
Phosphatase FCP1 dephosphoryliert. Die dephosphorylierte Form kann den Transkriptionszyklus
wieder neu beginnen.
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Ein Transkriptionsfaktor, der an der Phosphorylierung beteiligt ist, ist TF IIH, der aus einem Core
besteht, der an den Promoter bzw. an DNA bindet. Er kann zwei Zusatzmodule haben, eines, das als
Cyclin-dependent Kinase (CDK) 7 an der Initiation beteiligt ist und vom Cyclin H reguliert wird,
und ein alternatives Modul, das an der DNA-Reparatur beteiligt ist, wobei das Kinasemodul dann
durch andere Proteine ersetzt wird, die bei der DNA-Reparatur zum Einsatz kommen.
Bei der RNA-Polymerase gibt es von E. coli bis hin zu den Sugern die zwei groen
Untereinheiten, die bei E. coli und ' genannt werden und zusammen die wichtigen
Grundbausteine der Polymerase bilden, nmlich das katalytische Zentrum, die Stelle, wo die DNA
eingefdelt wird und die Stelle, wo die RNA gebildet und wieder aus dem Enzym herausgefhrt
wird.
Diese - und '-Untereinheiten sind in allen drei RNA-Polymerasen, die in Eukaryoten vorkommen,
sehr hnlich.
Allerdings hat die RNA-Polymerase II, also diejenige, die im Wesentlichen fr die Bildung von
mRNAs verantwortlich ist, an der '-Untereinheit eine sogenannte carboxyterminale Domne
(CTD), die aus dem Molekl herausragt. Diese ist wenig strukturiert und bildet wahrscheinlich eine
lang ausgedehnte Struktureinheit, die relativ leicht von auen zugnglich ist.
Betrachtet man die Aminosuresequenz dieser carboxyterminalen Domne, fllt auf, dass sie aus
Wiederholungen einer immer gleichen Aminosuresequenz besteht. Diese Sequenz besteht aus 7
Aminosuren, die sich also immer wieder wiederholen, bei Mensch und Maus besteht die CTD aus
insgesamt 52 Wiederholungen dieser kurzen Sequenz aus 7 Aminosuren, man spricht von einem
Heptad Repeat. Die Sequenz lautet Y S P T S P S, sie besteht also zu einem groen Teil (5/7) aus
den 3 Aminosuren, die phosphorylierbare Hydroxylgruppen tragen. Von diesen 5
phosphorylierbaren Aminosuren werden zwei tatschlich phosphoryliert, nmlich das Serin an
Position 2 und das Serin an Position 5.
Die Phosphorylierung ist nicht beliebig, je nachdem ob Serin 2 oder Serin 5 phosphoryliert werden,
gibt es unterschiedliche Konsequenzen fr den Transkriptionszyklus.
Dieser Heptad Repeat kann sich also bis zu 50-mal in der CTD wiederholen, d.h. wenn man z.B.
von einer am Serin 2 phosphorylierten CTD spricht existieren auch bis zu 50 phosphorylierte Serine
in dem Molekl, meist sind aber nicht alle entsprechenden Serine in allen Wiederholungen
phosphoryliert. Das gilt analog natrlich auch fr Serin 5.
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Die Polymerase II wurde mittels TFIIB an den Transkriptionsstart gebunden, es wurde also der
TFIID/A/B-Komplex gebildet. Als nchstes kommt TFIIH dazu, das die CDK7 enthlt, die durch
das Cyclin H reguliert wird. CDK7 nimmt die erste Phosphorylierung vor, nmlich am Serin 5, was
das Signal fr die Assoziation von Capping-Komplexen und in geringerem Mae fr die
Assoziation von Komplexen, die mit der Elongation zu tun haben, also dann spter bewirken sollen,
dass das Pausieren am Transkriptionsstart beendet werden soll.
Die Serin 5-phosphorylierte RNA-Polymerase kann nun die Promoter Clearance vornehmen, es
wird also das 5'-Ende der mRNA gebildet und sie kommt aus der Polymerase heraus, wird durch die
Capping-Komplexe erkannt und die Capping-Reaktion kann durchgefhrt werden. Whrenddessen
pausiert die Polymerase.
Wenn die Capping-Reaktion durchgefhrt ist, assoziiert die nchste Proteinkinase, nmlich der
Proteinkomplex pTEFb (TEF Transcription Elongation Factor). Dieser enthlt wiederum ein
Modul aus einer Zellzyklus-hnlichen Kinase, die CDK9, die auch durch ein Cyclin, das Cyclin T,
reguliert wird. Die CDK9 phosphoryliert das Serin 2, die Polymerase ist nun an Ser-5 und Ser-2
phosphoryliert, kann dadurch Splicing-Komplexe binden und dafr sorgen, dass die Polymerase
elongieren kann und schon whrend der Elongation Transkript-Splicing und am Schluss auch
Transkript-Termination stattfinden kann.
PTEFb phosphoryliert nicht nur das Ser-2 der Polymerase, sondern auch die Proteine, die die RNAPolymerase zum Pausieren zwingen, die also einen Elongationsblock bilden, und das sind DSIF
und NELF, wobei DSIF mit einer zweiten Untereinheit, SPT5, assoziiert ist.
PTEFb muss also zwei Dinge bewerkstelligen, es muss Serin 5 phosphorylieren, damit Transkriptprozessierende Proteine gebunden werden knnen, und es muss auerdem dafr sorgen, dass der
Elongationsblock inaktiviert wird. Zweiteres macht CDK9, indem es NELF phosphoryliert,
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woraufhin dieses von der DNA verschwindet. DSIF bindet seinerseits an die Polymerase und
wandert einfach mit dieser mit.
Die Phosphorylierungen am Serin 5 werden im Laufe der Elongation immer mehr entfernt, so dass
die CTD dieser Polymerase am Schluss des Transkriptionszyklus berwiegend am Serin 2
phosphoryliert ist, strittig ist hier noch eine Phosphorylierung am Serin 7. In diesem Zustand kann
sie von den Proteinen, die am Prozessieren des 3'-Endes beteiligt sind, erkannt werden.
Die pTEFb-Kinase wird durch Transkriptionsfaktoren rekrutiert, sie stimuliert die Elongation durch
CTD-Phosphorylierung am Serin 2 und die Phosphorylierung der Proteine DSIF und NELF,
wodurch der Elongationsblock inaktiviert wird. Dieses Verlassen des Elongationsblocks ist dann
Voraussetzung fr kontinuierliche Elongation, zustzlich sorgt die Serin 2-Phosphorylierung fr die
Assoziation von allen mglichen Proteinen, die mit der Transkript-Prozessierung, aber auch mit der
Elongation korreliert sind.
Bildung des 5'-Caps:
Am 5'-Ende der mRNA sitzt natrlicherweise ein Triphosphat,
was das erste Nucleotid reprsentiert, bei dem es sich meist um
ein Adenin handelt.
Von diesem Triphosphat wird zunchst durch eine RNATriphosphatase das -Phosphat entfernt, woraufhin es zu einer
nucleophilen Attacke des -Phosphats der mRNA an das Phosphat eines freien Guanin-Nucleotids kommt. Diese
Reaktion wird durch die Guanylyl-Transferase katalysiert.
Zuletzt wird durch eine Methyl-Transferase das angefgte
Guanin an Position 7 methyliert, so dass schlussendlich ein 7Methylguanin
ber
eine
eigentlich
atypische
Phosphotriesterbindung an das 5'-Ende der mRNA gebunden
ist. Diese Struktur kann von RNAsen nicht gespalten werden,
man erhlt also einen Schutz gegen den 5'3'-Abbau der
mRNA.
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Wie nimmt ein Transkriptionsfaktor Einfluss auf die Elongation oder die Initiation?
Dabei gibt es verschiedene Mglichkeiten.
Er kann z.B. ganz direkt Kontakt mit Komponenten des IC aufnehmen und so die Bindung
des IC frdern oder verhindern.
Er kann auch andere Faktoren, die dann Cofaktoren oder Coaktivatoren genannt werden,
oder auch weitere Transkriptionsfaktoren dazu bentzen, Kontakt herzustellen. In diesem
Fall findet der entscheidende Kontakt mit der Elongations- oder Initiationsmaschinerie nicht
durch den Transkriptionsfaktor selbst statt, sondern ber Cofaktoren oder weitere
Transkriptionsfaktoren.
Es kann auch die CTD-Phosphorylierung und damit die Elongation beeinflusst werden.
Transkriptionsfaktoren knnen auerdem sehr indirekt auf diese Vorgnge Einfluss nehmen,
indem sie die Chromatinstruktur eines Promoters so verndern, dass dieses Chromatin
entweder
transkriptionsfreundlich
oder
transkriptionsunfreundlich
wird.
Transkriptionsaktivatoren
regulieren
es
zur
Transkriptionsfreundlichkeit,
Transkriptionsrepressoren zur Transkriptionsunfreundlichkeit.
Die Chromatinstruktur ist ein sehr wichtiger Spieler bei der Regulation der Transkription.
Es gibt Proteine, die vor allem dafr verantwortlich sind, dass Transkriptionsfaktoren mittelbar oder
unmittelbar die Initiation beeinflussen knnen. Einer dieser Komplexe, die mit
Transkriptionsfaktoren Kontakt aufnehmen knnen, ist der TFIID-Komplex. Dieser ist der erste
generelle Transkriptionsfaktor, der bei der Initiation an einen Promoter bindet, er stellt also so etwas
wie einen rate-limiting step (geschwindigkeitsbestimmenden Schritt) dar, was sich allgemein immer
fr Regulation anbietet.
Der TFIID-Komplex besteht aus der TBP-Untereinheit und den sogenannten TBP-associated factors
(TAFs).
Ein weiterer Komplex, der sich anbietet, um Kontakt zwischen Transkriptionsfaktoren und der
Polymerase herzustellen, ist der Mediatorkomplex.
TFIID enthlt also TBP und 13-14 TAFs (je nach vorliegender Form), die die Bindung an den
Promoter, die Bindung von TBP (und damit die Erkennung einer TATA-Box und die Krmmung der
DNA) und den Kontakt zu Transkriptionsfaktoren und Coaktivatoren regulieren. Auerdem sind sie
in der Lage, eine Chromatinmodifikation vorzunehmen, die fr die Transkription auch wichtig ist.
Die TAFs knnen unterschiedliche Transkriptionsfaktoren binden, die dadurch dann dafr sorgen,
dass TFIID an die DNA rekrutiert werden kann.
Es gibt 3 Mglichkeiten, wie TF IID die Bindung an die
Initiationsstelle vermitteln kann:
Eine TATA-Box wird von TBP erkannt und
gebunden
Initiatorelemente (Inr) werden durch TAF1
und TAF2 erkannt
TFIID Promoter Elements (DPEs) werden
durch TAF6 und TAF9 erkannt
TFIID kann also ber mehrere Untereinheiten die
Bindung an den Transkriptionsstart vermitteln, kann
durch viele unterschiedliche TAFs den Kontakt mit
Transkriptionsfaktoren vermitteln und kann durch die
Histon-Acetylase-Funktion von TAF4 auf die
Chromatinstruktur Einfluss nehmen.
Die komplexe Struktur mit den vielen Untereinheiten
bedeutet eben, dass nicht nur die eine Funktion, an
Genexpression (Decker, Blsi)
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DNA zu binden und die Initiationsstellen zu erkennen, wahrgenommen werden kann, sondern diese
Bindung dann auch noch davon abhngig gemacht werden kann, ob andere TAFs mit
Transkriptionsfaktoren, Cofaktoren oder Coaktivatoren interagieren.
Der Mediatorkomplex wird strukturell in eine Kopfstruktur, eine Mittelstruktur, eine
Schwanzstruktur und eine Kinasestruktur eingeteilt.
Genau wie TFIIH oder TFIIB enthlt er eine
Proteinkinase, kann also phosphorylieren und auch
hier handelt es sich um eine Cyclin-dependent
Kinase, CDK8, die durch das Cyclin C reguliert
wird. Es wird deshalb angenommen, dass er auch an
der Phosphorylierung der CTD der RNAPolymerase beteiligt ist, es ist aber bisher nicht klar,
wo er diese phosphoryliert und was das fr
Konsequenzen hat, bei manchen Genen bewirkt es
negative Regulation, bei anderen positive.
Generell sind aber die vielen MediatorUntereinheiten wie bei TFIID deswegen vorhanden,
weil sie den Kontakt zu sehr vielen
unterschiedlichen
Transkriptionsfaktoren
und
Cofaktoren und zur Polymerase aufbauen. Den
Kontakt zur RNA-Polymerase stellt z.B. Med17 her.
Bei einigen Untereinheiten ist schon geklrt, mit
welchen Transkriptionsfaktoren sie unmittelbar
Kontakt aufnehmen knnen.
Ein nucleosomaler Promoter wird zunchst von
Transkriptionsfaktoren erkannt und mithilfe von
Coaktivatoren die Nucleosomenstruktur verndert. An
diesem Punkt wird durch den direkten Kontakt mit den
Transkriptionsfaktoren der Mediator rekrutiert. Bei den
meisten Promotoren, deren Transkription stimuliert
werden soll, verschwindet jetzt das Kinasemodul des
Mediators und es bleibt nur der Core-Mediator PC2
brig. PC2 tritt in Kontakt mit der Polymerase und dem
Initiationskomplex, z.B. auch mit TFIIH. Es gibt hier
allgemein viele Interaktionen, die dazu fhren, dass der
Mediator den Kontakt zum Initiationskomplex herstellt.
Jetzt kann Elongation stattfinden, in dem Fall kme es
noch zu den Regulationsereignissen, die bentigt
werden, um den Elongationsblock aufzuheben. Nach der
Clearance verschwindet Mediator nicht unmittelbar vom
Promoter, sondern bleibt als Gerststruktur (Scaffold)
am Promoter hngen. Dieses Gerst sorgt dafr, dass das
zweite Initiationsereignis (Reinitiation) viel einfacher
und schneller stattfinden kann. Zu diesem Gerst
gehren neben dem Core-Mediator auerdem einige
generelle Transkriptionsfaktoren wie z.B. TFIID und
TFIIA.
Mediator muss nicht sofort zur Elongation fhren,
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sondern kann alternativ auch zunchst einmal nur zur Clearance fhren, dann wren noch weitere
Schritte ntig, um die Clearance in die Elongation zu berfhren.
In jedem Fall ist Mediator aber an der Rekrutierung der Polymerase beteiligt und bleibt nach der
Clearance Teil der Scaffold-Struktur am Promoter, die die Reinitiation erleichtert.
Die Funktion von Mediator ist also einerseits das Rekrutieren des Initiationskomplexes (IC) und der
RNA-Polymerase, andererseits aber auch eine Regulation der Cofaktoren, die die Histone
modifizieren.
Mediator muss nicht immer mit einem positiven Transkriptionsereignis korreliert sein, es gibt
Promotoren, wo Mediator darin involviert ist, die Enzyme REST und G9a zu rekrutieren, die durch
Methylierung von Histonen eine Chromatinstruktur erzeugen, die transkriptionsunfreundlich ist. In
diesem Fall ist Mediator also mit seinem Kinasemodul daran beteiligt, einen Promoter zu
reprimieren.
Je nachdem, welcher Mediatorkomplex vorhanden ist (nur Core-Mediator oder Mediator mit
Kinasemodul), kommt es zu unterschiedlichen Einflussnahmen auf die Transkription.
Der Core-Mediator PC2 stimuliert also die Bildung des Initiationskomplexes, aber auch der CoreKomplex muss nicht immer gleich beschaffen sein, die Untereinheitstruktur kann variieren. Je
nachdem wie diese Variation aussieht, knnen unterschiedliche Transkriptionsaktivatoren
kontaktiert werden.
Auch die Reihenfolge der Bindung ist nicht vollstndig geklrt, da es auch Flle gibt, wo Mediator
bereits an die RNA-Polymerase gebunden ist und dann im Komplex mit dieser an den Promoter
bindet.
Das Kinasemodul interagiert wahrscheinlich nicht mit der RNA-Polymerase, sehr oft ist die
Aufgabe dieses Moduls die Promoter Clearance zu inhibieren, in manchen Fllen ein repressives
Chromatin zu erzeugen, es gibt aber auch Flle, in denen das Kinasemodul mit positiven
Transkriptionsereignissen korreliert ist.
Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen knnen weit vom Transkriptionsstart entfernt liegen. Mediator
und TFIID helfen auch dabei DNA-Schleifen zu bilden, die es erlauben, dass die Bindungsstelle fr
den Transkriptionsfaktor mit Mediator und dem IC in Kontakt kommt.
Mediator ist also ein groer Integrator vieler Funktionen, nmlich RNA-Polymerase-Bindung,
Initiation und Elongation der Transkription, Kontakt zu Transkriptionsfaktoren, aber auch Kontakt
zu und Regulation von Enzymen, die die Chromatinstruktur verndern.
Der Einfluss von Transkriptionsfaktoren auf die Initiation oder Elongation kann also sehr direkt
sein, weil die Distanz ihrer Bindungsstellen durch die Schlaufenbildung der DNA keine Rolle spielt.
Nicht jeder Transkriptionsfaktor hat die Funktion mit Mediator oder TF IID zu interagieren, es gibt
auch Transkriptionsfaktoren, deren Funktion eher darin liegt, die Chromatinstruktur fr
Transkriptionsfaktoren vorzubereiten, die dann diese Funktionen des direkten Kontakts zur
Initiations- und Elongationsmaschinerie bernehmen.
Die dritte Funktion, die Transkriptionsfaktoren ausben knnen, ist die Beeinflussung der
Chromatinstruktur, sie helfen Proteinen zu binden, die die Nucleosomen modifizieren, also
chemisch verndern, oder diese verschieben, umlagern oder auflsen (Chromatin Remodelling).
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enthlt aber eine ATPase-Domne bestehend aus DExx und HELICc. Zwischen diesen beiden
Teilen der Domne liegt immer eine Insertion von Aminosuren, die kurz oder lang sein kann.
Die ATPasen haben auch Domnen bzw. Module, die mit Histonen interagieren knnen.
Die Funktion der ATPasen wird dadurch reguliert, dass sie selbst posttranslational modifiziert, z.B.
acetyliert werden, dass sie aber auch mit anderen Proteinen interagieren, die wichtig sind fr die
Regulation ihrer Funktion.
Die Chromatin Remodeling Complexes sind evolutionr konserviert, es wurden homologe
Komplexe in Hefe, Drosophila und Mensch gefunden.
Bindungsstellen fr Transkriptionsfaktoren sind in nucleosomaler DNA in der Regel dem
Nucleosom so zugewandt, dass sie unzugnglich sind. Durch das Nucleosome Sliding wird das
Nucleosom ein Stck an der DNA entlang verschoben und DNA, die vorher nucleosomal war, wird
zur Linker-DNA, wodurch die Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen zugnglich werden.
Eine Alternative hierzu wre, ein Nucleosom von einem Stck DNA auf ein anderes zu bertragen
(Nucleosome Transfer?). Das konnte aber bisher nur im Reagenzglas beobachtet werden und es ist
deshalb nach wie vor ungeklrt, ob das in Zellen berhaupt stattfindet.
Die dritte Mglichkeit stellt das Rotational Positioning, was bedeutet, dass die DNA nur so weit
verndert wird, dass eine Rotation relativ zum Nucleosom stattfindet, so dass eine
Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle, die zunchst zum Nucleosom hingewandt ist, dann vom
Nucleosom abgewandt wird und deshalb fr Transkriptionsfaktoren zugnglich ist.
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reguliert werden soll wie in der Mutterzelle. Ein Weg das zu tun ist, dass die Position von
Nucleosomen durch Transkriptionsfaktoren markiert wird. So wrden bei der replizierten DNA die
Transkriptionsfaktoren gleich wieder an diese Stellen binden und nach Bildung der Nucleosomen
wre klar wo diese eingefgt werden sollen.
Eine andere Mglichkeit ist, dass ein Transkriptionsfaktor ganz przise darauf Einfluss nimmt, wo
eine Nucleosom positioniert wird.
Nucleosomen bestimmen also nicht nur, wohin Transkriptionsfaktoren binden knnen, sondern
Transkriptionsfaktoren knnen ber das Phnomen des Bookmarkings auch bestimmen, wie
Nucleosomen nach der Replikation der DNA positioniert werden.
Variante Histone sind ihren normalen Histonen nahe verwandt, manchmal unterscheiden sie sich
nur um ein paar Aminosuren.
Histon 3.3 ist z.B. eine dem Histon 3 sehr nah verwandte Variante und wird auch benutzt, um dieses
auszutauschen. Das verndert die Eigenschaften des Nucleosoms so, dass die DNA dort besser
transkribierbar wird, dieser Austausch von H3 gegen H3.3 erfolgt also in transkriptionell aktiven
Genen.
Es gibt aber auch Varianten, die eher mit negativer Genregulation korreliert sind, z.B. die H2A.ZVariante. Diese findet man in Promotoren oder Boundary Elementen und soll dafr sorgen, dass
sich Heterochromatin nicht in die Bereiche von transkriptionell aktiven Genen erstreckt.
Dieser Austausch von herkmmlichen gegen variante Histone erfolgt durch Chromatin Remodeling
Complexes.
Eine weitere Histonvariante stellt CENP-A dar, das man in Centromer-Bereichen findet und
ermglicht die Bindung der Kinetochor-Proteine und damit das Anknpfen des Chromosoms an den
Spindelapparat.
Die varianten Histone haben also Eigenschaften, die mit der biologischen Aktivitt des jeweiligen
DNA-Abschnitts korreliert sind und diese untersttzen.
Es gibt bei Nucleosomen also eine kompakte
Grundstruktur, um die die DNA gewickelt ist,
und die N-Termini, die aus dieser Struktur
herausragen und von auen gut zugnglich sind.
Diese Zugnglichkeit der N-Termini der Histone
hat damit zu tun, dass die Histone modifiziert
werden, was ein wichtiger Teil der
Transkriptionskontrolle ist.
Die
verschiedenen
N-Termini
werden
unterschiedlich stark modifiziert, Modifikationen
treten nur sehr selten in den Bereichen des
Histone Folds auf und nicht jede Aminosure
kann modifiziert werden, sondern nur bestimmte
Arten und dabei auch nur solche an bestimmten
Stellen.
Die wichtigsten Modifikationen sind die Acetylierung von Lysinen, die Methylierung von Lysinen
und Argininen und die Phosphorylierung von Serinen.
Die am einfachsten interpretierbare Modifikation, die also eindeutig mit einer bestimmten
transkriptionellen Aktivitt korreliert ist, ist die Lysin-Acetylierung. Lysin-Acetylierung wird
durch Histon-Acetyltransferasen (HAT) bewirkt.
Die Acetylierung findet an der positiv geladenen Aminosure Lysin statt. Da Acetylierung der
Einfhrung einer negativ geladenen chemischen Gruppe entspricht, wird die positive Ladung des
Genexpression (Decker, Blsi)
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Lysins neutralisiert, was eine schlechtere Interaktion mit der negativ geladenen DNA und somit eine
Lockerung der DNA-Struktur zur Folge hat.
Es gibt Proteine, die solche modifizierten Histone erkennen, daran binden und dann ihre Funktion
ausben. Die Lockerung der DNA-Struktur ist nur eine der Konsequenzen, die wichtigere ist
wahrscheinlich, dass die acetylierten Histone durch solche Proteine erkennbar werden.
Die HAT hat Gegenspieler, die Histon-Deacetylasen (HDACs), die das genaue Gegenteil bewirken,
also die Acetylgruppen wieder von den Lysinen entfernen.
Die HATs sind also eindeutig mit positiver Genregulation assoziiert, die HDACs mit negativer
Regulation.
Die Methylierung von Histonen ist andererseits sehr schwer interpretierbar. Die Konsequenz der
Methylierung ist unterschiedlich, je nachdem, welches Lysin innerhalb eines Histons methyliert
wird. H3K4-Methylierung ist z.B. mit Transkriptionsaktivitt korreliert, H3K9-Methylierung mit
transkriptioneller Repression.
Bei der Methylierung von Lysinen kann nicht nur eine Methylgruppe eingefhrt werden, sondern
bis zu 3, jedes Lysin kann also mono-, di- oder trimethyliert sein. Dadurch knnen sehr viele
unterschiedliche Methylierungsmuster eingefhrt werden, die dann zustzlich noch mit
unterschiedlichen Acetylierungen, Arginin-Methylierungen und Phosphorylierungen kombiniert
werden knnen. Aufgrund dieser riesigen Menge an mglichen Modifikationskombinationen spricht
man hier auch von einem Histon-Code, den diese posttranslationalen Modifikationen bewirken. Sie
bilden einen Code dafr, in welcher biologischen Aktivitt sich der entsprechende DNA-Abschnitt
engagiert, was dadurch passiert, dass der Histon-Code durch Proteine ablesbar ist, die dann diese
biologischen Folgereaktionen in die Wege leiten.
Die Funktionen, die reguliert werden, sind aber natrlich nicht nur Transkription, sondern auch die
Reparatur, Replikation oder Kondensation von DNA wird durch solche Histon-Modifikationen
reguliert.
6. Vorlesung (08.05.2012):
Die Histone, die die Nucleosomen aufbauen, besitzen N-Termini, die von auen zugnglich und
dadurch von einer Vielzahl unterschiedlicher Enzyme modifizierbar sind.
Die Acetylierung von Lysinen ist mit der Aktivierung von Transkription korreliert, die Methylierung
von Lysinen kann sowohl mit der Repression also auch mit der Aktivierung der Transkription
korreliert sein.
Diese Vielzahl an Modifikationen ist nicht zufllig ber das Genom verteilt, sie passieren an
bestimmten Stellen zu bestimmten Zeiten und haben dann eine bestimmte biologische Bedeutung.
Es gibt zwei wichtige Typen von Komplexen, die die Chromatinstruktur verndern, einerseits die
Chromatin Remodeling-Komplexe, also Komplexe, die unter ATP-Verbrauch Nucleosomen
verschieben oder auflsen knnen, und andererseits solche Komplexe, die enzymatische Aktivitten
enthalten und Modifikationen an Histonen vornehmen. Es gibt z.B. Komplexe, die eine HistonAcetyltransferase (HAT) beinhalten. Diese bestehen meist aus vielen verschiedenen Untereinheiten,
die Ausnahme bilden P300 und CBP, die aus nur einer Untereinheit bestehen, die dem Protein die
HAT-Aktivitt verleiht.
Wie interagieren diese Komplexe mit dem Chromatin?
Viele dieser Komplexe enthalten Proteine mit Untereinheiten, die bereits modifiziertes Chromatin
Genexpression (Decker, Blsi)
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erkennen knnen. Die Voraussetzung, dass solche Komplexe also berhaupt mit Chromatin
wechselwirken knnen ist, dass das Chromatin bereits so modifiziert ist, dass es fr diese erkennbar
wird, im Fall der HAT-Komplexe durch Bromodomnen.
Bromodomnen sind Proteinstrukturelemente, die einem Protein oder ganzen Proteinkomplexen
die Fhigkeit verleihen, acetylierte Proteine, in diesem Fall acetylierte Histone, zu erkennen.
Chromodomnen binden an methylierte Histone.
Auch unter den HDAc-Komplexen existiert einer, der in der Lage ist Histonmodifikationen zu
erkennen, nmlich der NuRD-Komplex, der das mithilfe einer Chromodomne bewerkstelligt, es
kann also methyliertes Chromatin erkannt werden.
Das gleiche gilt fr die Histon-Methylasen, wo der SUV39-Komplex ebenfalls ber eine
Chromodomne Methylierungen am Chromatin erkennen kann.
Wie kann man feststellen, welches Chromatin an welcher Stelle wie modifiziert ist?
Die Schlsseltechnologie dabei ist die Chromatin-Immunprzipitation (ChIP), die es erlaubt, die
Interaktion von Proteinen mit Chromatin und die Modifikation von Proteinen, die Teile des
Chromatins sind, also z.B. die Histone, zu analysieren.
Der erste Schritt dabei ist die mechanische Zerkleinerung des isolierten Chromatins, damit es
experimentell handhabbar wird. Das wird meist dadurch erreicht, dass das Chromatin in ein
Ultraschallbad gegeben wird, wo es durch den Ultraschall mechanisch in Stcke zerkleinert wird,
die je nach Behandlung einige 100 bp gro sind.
Damit sich die Histone nicht von der DNA
lsen
knnen,
wird
im Vorfeld
Crosslinking durchgefhrt, also eine
chemische Quervernetzung eingebracht.
Als nchstes wird ein Antikrper
bentigt, der in der Lage ist, die gesuchte
Modifikation am untersuchten Histon zu
erkennen. Ist die gesuchte Modifikation
vorhanden, bindet der Antikrper und man
kann den Antikrper samt dem daran
gebundenen
Chromatinfragment
immunprzipitieren. Das bedeutet, dass
man den Antikrper an kleine SepharoseStckchen, also an eine relativ schwere
Matrix, so dass man dann diesen Komplex
aus Sepharose-Kgelchen, Antikrper und
Chromatinfragment
einfach
abzentrifugieren kann. So knnen die Chromatinfragmente, wo die gesuchte Modifikation
vorhanden ist, von denen, wo dies nicht der Fall ist, getrennt werden.
Der nchste Schritt ist die Reversion des Crosslinkings, die chemische Bindung, die die DNA an
das Histon koppelt, wird also aufgelst, so dass man die DNA erhlt, die mit dem modifizierten
Chromatin assoziiert war. Nun kann man mithilfe von PCR den Nachweis durchfhren, ob z.B. ein
bestimmter Bereich der DNA in diesem modifizierten Chromatin vorlag.
Dieses Verfahren kann mit Antikrpern durchgefhrt werden, die die verschiedensten HistonModifikationen erkennen.
Mit diesem Verfahren kann mittlerweile auch untersucht werden, ob ein bestimmter
Transkriptionsfaktor in einer bestimmten Situation mit dem Chromatin assoziiert vorliegt. In diesem
Fall fhrt man das Experiment nicht mit Antikrpern gegen Histon-Modifikationen durch, sondern
Genexpression (Decker, Blsi)
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Die Writers und Readers sind nicht immer getrennt, es knnen auch beide Funktionen in einem
Proteinkomplex vereint sein. Das bedeutet, dass die Histon-modifizierende Maschinerie auch
untereinander kommuniziert, d.h. beispielsweise, dass ein Komplex seine Modifikation nur einfhrt,
wenn eine andere, die er durch seine Reader-Domne erkennt, schon vorhanden ist.
Dieses Phnomen, dass eine Modifikation nur eingebracht werden kann, wenn eine anderen schon
vorhanden ist, bezeichnet man als Crosstalk zwischen den Histon-Modifikationen.
Wie knnen diese ersten fr diesen Crosstalk bentigten
Modifikationen eingefhrt werden?
In Bezug auf Acetylierungen ist es eine Aufgabe von
Transkriptionsaktivatoren,
die
Histon-modifizierenden
Komplexe an das Chromatin zu bringen.
Umgekehrt kann ein transkriptioneller Repressor dafr sorgen,
dass ein Gegenspieler eines solchen Komplexes an das
Chromatin gebracht wird, der die Acetylierung wieder entfernt
und
das
Chromatin
auf
diese
Weise
transkriptionsunfreundlicher macht.
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Das Rekrutieren dieses Komplexes allein reicht aber nicht aus, um diese E3-Ligase zu aktivieren,
dazu mssen weitere Komplexe wie z.B. der PAF-Komplex gebunden werden. Der PAF-Komplex
kann jetzt die Ubiquitin-Ligase aktivieren, so dass die H2B-Ubiquitinierung stattfindet. Diese
Ubiquitinierung ist Voraussetzung dafr, dass der COMPASS-Komplex mit seiner MethylaseUntereinheit Set1 die H3K4-Trimethylierung vornehmen kann.
Erst wenn diese beiden Modifikationen stattgefunden haben, kann die Ser2-Kinase fr die RNAPolymerase rekrutiert werden und die Ser2-Phosphorylierung als Voraussetzung fr die Elongation
kann stattfinden.
Es gibt grundstzlich zwei Mglichkeiten, die Transkription zu regulieren, einerseits auf Ebene der
Initiation, also bei der Bildung des PIC und damit der Rekrutierung der RNA-Polymerase, und
andererseits kann es sein, dass der PIC immer gebildet wird und die eigentliche Regulation beim
bergang von der Initiation zur Elongation stattfindet.
Ein Beispiel dafr sind Gene, die durch den sogenannten Heat-shock Transcription Factor (HSF)
aktiviert werden.
Genexpression (Decker, Blsi)
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AP1, der immer aus der Untereinheit cJun und einem Protein aus der sogenannten FosFamilie besteht, im Fall des IFN- dem ATF-2
Interferon Regulatory Factors (IRF), aus denen ein Dimer gebildet wird, das entweder
aus zwei IRF3, aus zwei IRF7 oder aus einem IRF3 und einem IRF7 bestehen kann
Diese Proteine bewirken zusammen mit den High Mobility Group I (HMGI-)
-Strukturproteinen, die keine eigentlichen Transkriptionsfaktoren sind, aber dafr sorgen knnen,
dass sich die Enhanceosom-Struktur bilden kann, die Verkrmmung der DNA im entsprechenden
Bereich, so dass sich das Enhanceosom bilden kann.
Auch beim Enhanceosom erfolgt die Aktivierung des Promoters in einer Reihe von klar definierten
Schritten. Zunchst wird das Enhanceosom anstelle eines Promoter-Nucleosoms gebildet. Das
Enhanceosom kann nun den SAGA-Komplex mit seiner GCN5-Histon-Acetyltransferase
rekrutieren und das Nucleosom an der Initiationsstelle wird acetyliert und remodelliert, also von
dieser Stelle entfernt. Daraufhin kann der Initiationskomplex mit der RNA-Polymerase gebildet
werden, es bindet eine weitere HAT, nmlich CBP, und bedingt durch die weitere Acetylierung
eines benachbarten Nucleosoms auch der SWI/SNF Chromatin Remodeling Complex.
Nun ist die Voraussetzung fr die vollstndige Remodellierung des Promoters gegeben, der
vollstndige Initiationskomplex einschlielich aller basalen Transkriptionsfaktoren kann gebildet
und die Clearance und nachfolgend die Elongation knnen durchgefhrt werden.
Ein weiteres konkretes Beispiel stellt ein Gen dar, das fr eine Recombinase von S. cerevisiae
codiert, das fr das Mating-type Switching bentigt wird. In diesem Fall kommt es zunchst zur
Bindung des Transkriptionsfaktors SWI5, der dafr sorgt, dass Chromatin Remodeling Complexes
oder auch Histon-Modifikationskomplexe gebunden werden, und es kommt dazu, dass die
nucleosomale Struktur ber einer weiteren Bindungsstelle, nmlich der des Transkriptionsfaktors
SBF, vollkommen aufgelst wird, was die
Voraussetzung fr die Bildung des Initiationskomplexes
ist.
Ein weiteres Beispiel ist das Retrovirus MMTV (Mouse
Mammary Tumor Virus), das in Musen Brusttumore
hervorrufen kann. Dazu muss es allerdings aktiviert
werden. Wenn aufgrund der Lactation im Brustgewebe
Glucocorticoide gebildet werden, wird daraufhin der
Glucocorticoid-Rezeptor (GR) aktiviert, der dann dafr
Genexpression (Decker, Blsi)
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sorgt, dass ein Nucleosom so verndert wird, dass es zur Bindung von weiteren
Transkriptionsfaktoren kommen kann, nmlich OTF-1 und NF1. So wird der transkriptionell aktive
Promoter gebildet. Die NF1-Bindung kann erst erfolgen, wenn der Glucocorticoid-Rezeptor ein
Rotational Positioning am Nucleosom vorgenommen hat und dadurch die NF1-Bindungsstelle
freigelegt wurde.
Nach NF1-Bindung wird dann auch die OTF-1-Bindungsstelle im Linker-Bereich zugnglich.
Der Zusammenhang mit den Transkriptionsfaktoren ist der, dass Transkriptionsfaktoren gebraucht
werden, um diese ganze Modifikations- und Remodellierungsmaschinerie berhaupt an das
Chromatin zu bringen.
Die Histon-Modifikation bzw. das Histon-Remodeling ist aber auch ein wichtiger Teil der
epigenetischen Genregulation.
Es ist nicht alles durch den DNA-Code festgelegt, der DNA-Code codiert aber auch fr Proteine,
die dann letztlich eine Art der Regulation durchfhren knnen, die DNA-Sequenz-unabhngig ist.
Epigenetische Genregulation hat sehr viel mit Chromatinzustnden zu tun, sie bedeutet nmlich
einfach, dass man diese Chromatinzustnde vererben kann.
Epigenetik beruht zwar auf der Bildung einer bestimmten Art von vererbbarem Chromatinzustand,
aber nicht alles, was am Chromatin verndert wird, fllt unter Epigenetik. Epigenetisch bedeutet,
dass der Zustand, der durch das Chromatin festgelegt wird, tatschlich vererbbar ist, entweder von
Mutterzelle zu Tochterzelle oder von Mutterorganismus zu Tochterorganismus.
Epigenetik fhrt also dazu, dass bei identischer DNA in unterschiedlichen Zellen und Organen
unterschiedliche und mitotisch stabile Genexpression erzeugt wird. Die ursprngliche Ursache
der Existenz von unterschiedlichen Zelltypen mit ihren unterschiedlichen Expressionsmustern liegt
also in der Epigenetik.
Dabei wird eben eine Chromatinstruktur vererbt, die nicht ausschlielich, aber wesentlich durch
DNA-Methylierung bestimmt wird.
Grundbegriffe der Epigenetik sind Eu- und Heterochromatin, die Zustnde des Chromatins
bezeichnen, die aus heutiger Sicht entweder transkribierbar oder nicht transkribierbar sind.
Heterochromatin wurde erstmals 1929 beschrieben und zwar als der Teil des Chromatins, der durch
den ganzen Zellzyklus hindurch kondensiert und damit gut anfrbbar bleibt.
Der Teil, der in der Interphase lose vorlag, wurde als Euchromatin bezeichnet.
1959 wurde postuliert, dass es sich bei Eu- und Heterochromatin um unterschiedliche
biophysikalische Zustnde handelt, die sich unter anderem in der Expression ihrer Gene, aber nicht
in der grundlegenden Struktur der DNA unterscheiden.
Das Euchromatin enthlt die transkribierten Bereiche der DNA, das Heterochromatin ist der
transkriptionell inaktivere Teil des Genoms mit relativ dichter Packung des Chromatins.
Das Heterochromatin kann konstitutiv sein, d.h. das Chromatin stellt sich nie anders als
heterochromatisch dar, was z.B. in Telomer- und Centromer-Bereichen der Fall ist, es kann aber
auch induziert sein, was z.B. bei der Inaktivierung des X-Chromosoms bei Sugern oder bei der
Stilllegung eines der Mating-Types in Saccharomyces vorkommt.
Heterochromatin ist nicht wie ursprnglich angenommen immer die gleiche DNA- bzw. ChromatinKonformation.
Heterochromatin enthlt generell einen niedrigen Gehalt an acetylierten Histonen, die ja eindeutig
mit aktiven Genen korreliert sind.
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Wie wird kontrolliert, welcher Bereich der DNA hetero- oder euchromatisch vorliegt? Wie werden
diese Bereiche voneinander abgegrenzt?
Dabei sind bestimmte DNA-Sequenzen wie Locus Control Regions (LCRs), Insulators oder
Boundary Elements von Bedeutung.
Locus Control Regions sind eine essentielle Voraussetzung dafr, dass bestimmte Gene in
bestimmten Bereichen berhaupt transkribierbar werden.
Insulators und Boundary Elements schaffen Grenzen zwischen eu- und heterochromatischen
Bereichen und trennen auf diese Weise solche Chromatin-Konformationen voneinander bzw.
grenzen sie auf bestimmte Bereiche ein.
Verschiedene Formen von Heterochromatin:
Konstitutives Heterochromatin: permanentes, also nicht induzierbares Chromatin in
Telomer- und Centromer-Bereichen
Fakultatives Heterochromatin: induzierbar
Durch Polycomb-Proteine reguliertes Heterochromatin: = wichtiger Teil der Transcriptional
Memory
BLACK Heterochromatin: in den Bereichen, wo das Chromatin mit der Kermatrix oder der
Kernlamina assoziiert ist
Ein wichtiges Protein bei der induzierbaren Bildung von Heterochromatin, das man auch sehr
hufig in heterochromatischen Bereichen findet, ist das Heterochromatin Protein 1 (HP1).
Liegt Chromatin in einem bestimmten Methylierungszustand vor, nmlich H3K9-di- oder
-trimethyliert, was von der SUV39H1-Methylase durchgefhrt wird, kann dieses H3K9 durch die
Chromodomne von HP1 erkannt werden. HP1 bewirkt dann ein Fortschreiten eines stillgelegten,
mit HP1 bedeckten Heterochromatins.
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Es gibt mehrere verschiedene Komplexe, die mit epigenetischer Genregulation bzw. mit
Transcriptional Memory zu tun haben.
Besonders hervorzuheben sind dabei die PRC1- und PRC2-Komplexe, die von Proteinen der
sogenannten Polycomb-Gruppe gebildet werden. Bei Mutation dieser Polycomb-Gene kommt es
zur Expression von Genen in Zellen, in denen diese eigentlich nicht exprimiert werden sollten.
Polycomb-Proteine knnen allgemein mit einem epigenetischen Gene Silencing in Verbindung
gebracht werden.
Das Stilllegen von bestimmten Genen in bestimmten Geweben oder Zellen erfolgt dabei so, dass es
mitotisch stabil ist, was bedeutet, dass die Tochterzellen den gesilenceten Zustand von der
Mutterzelle bernimmt.
Die HP1-Komplexe sind bei der Bildung des Heterochromatins wichtig und es gibt noch weitere
Komplexe, die auch bestimmte Chromatin-Modifikationen erkennen und dann an der
epigenetischen Vererbung beteiligt sind.
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Das Stilllegen von chromosomalen Bereichen kann auch damit verbunden sein, dass diese Bereiche
an die Kernmatrix assoziiert sind, wofr Matrix-Attachment Regions (MARs) bentigt werden.
Auerdem braucht man Locus Control Regions (LCRs), die auch innerhalb eines euchromatischen
Bereichs festlegen, welche Gene dort tatschlich transkribiert werden knnen und welche nicht.
Von diesen Bereichen wird verlangt, dass sie eine chromosomale Domne definieren, bei der der
Insulator dafr sorgt, dass sie nicht heterochromatisch wird, weil er verhindert, dass sich das
Heterochromatin in diese Domne hinein ausbreitet. Auerdem bentigt man dafr Locus Control
Regions, damit innerhalb dieser Domne Proteine oder Enhancer wirksam und die Gene exprimiert
werden knnen.
Hat man also einen DNA-Bereich, der LCR und Insulator enthlt, knnen diese Bereiche
gemeinsam dafr sorgen, dass die Gene, die durch diese chromosomale Domne definiert werden,
positionsunabhngig exprimiert werden knnen.
Sehr oft bringt man in Zellen Transgene ein und zwar in der Regel dadurch, dass man das
gewnschte Gen zunchst Gen-cloniert und dann in eine befruchtete Eizelle einer Maus injiziert
und diese dann implantiert. Mit etwas Glck bildet sich daraufhin ein Embryo, der das gewnschte
Transgen in sein Genom integriert hat.
Sehr oft kam es dabei dazu, dass das Transgen zwar im Organismus nachgewiesen werden konnte,
es aber nicht exprimiert wurde, es landete also sehr oft in einem heterochromatischen Bereich, was
seine Stilllegung zur Folge hatte.
Koppelt man das Transgen an einen Insulator und eine Locus Control Region, sorgen diese beiden
Elemente dafr, dass Heterochromatin nicht in den Bereich des Transgens hinein kann. Das
bedeutet, egal wo das Transgen ins Genom integriert, es ist exprimierbar.
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Das Vorhandensein von solchen LCRs und Insulator-Elementen hat auch sehr viel mit der
Modifikation des Chromatins zu tun. Das heit, man kann diese Bereiche nicht an ihrer Sequenz
erkennen, sie knnen viel besser durch eine Chromatin-Landschaft definiert werden.
Ein Insulator ist z.B. relativ oft eine Bindungsstelle fr das Protein CTCF.
Eine LCR enthlt sehr oft ein variantes Histon, nmlich H3.3 oder H2A.Z, sie hat auerdem sehr oft
ein mono- oder dimethyliertes H3K4.
Das ChIP-Seq-Verfahren, mit dem man genomweit Landschaften von Modifikationen und
Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen erstellen kann, kann auch dabei helfen, im Genom
aufzufinden, welches Stck Chromatin die Voraussetzungen dafr trgt, dass es beispielsweise als
LCR, als Enhancer, als Silencer oder als Insulator-Element fungieren kann.
Was bedeutet Locus Control?
Hat man eine chromosomale Domne, die durch
Insulators abgegrenzt ist, bedeutet das oft, dass
sogenannte Chromatin Hubs gebildet werden. Diese
sind oft einfach Verteiler, durch die ein Signal auf
viele weitere Stellen verteilt werden kann. Auch hier
wird ein Hub gebildet, wo unterschiedliche Bereiche
die unterschiedlichen Signale integrieren.
Durch die Silencer- oder Insulator-Aktivitt dieser
Proteine kommt es dann zum Silencing der
umgebenden DNA-Bereiche. Gleichzeitig sorgt die
LCR dafr, dass bestimmte Gene in diesen Bereichen
aktiviert werden knnen, indem sie festlegt, mit
welchem Enhancer in diesem Bereich sie interagiert.
Diese Interaktion mit den Enhancern dieses Bereichs
legt fest, welche Gene aktivierbar sind.
Ein Beispiel hierfr sind die Hmoglobin-Gene, bei
denen es je nach Entwicklungsstadium des
Organismus unterschiedliche Arten gibt. In den
jeweiligen Entwicklungsstadien werden durch solche
Hubs und LCR-Interaktionen nur die dafr bentigten
Gene aktiviert, die anderen sind stillgelegt.
Dabei halten spezielle Proteine den Hub der inaktiven
Gene zusammen, nmlich CTCF.
Die Silencer bilden durch Vernetzung mit CTCF einen
Hub, wodurch die LCR jetzt im aktiven Hub durch die Bindung eines Proteinkomplexes, der die
LCR mit dem Enhancer vernetzt, fr die Aktivierung des jeweiligen Gens sorgen kann.
Wie interagieren diese Hubs miteinander?
Bei dieser Interaktion, also der Bildung der Hubs mit ihren DNA-Schlaufen, sind offenbar
Cohesine wichtig, die eine Gruppe von Proteinen darstellen, die whrend der Mitose bentigt
werden, um die Schwesterchromatiden zusammenzuhalten.
Diese Cohesine knne auch dafr sorgen, dass die entsprechenden Stellen der Hubs miteinander
interagieren und die Schlaufen bilden knnen.
Bei der Differenzierung von T-Zellen mssen auch unterschiedliche Gene aktiviert werden, was
dadurch bewerkstelligt wird, dass diese Gene unter gemeinsame Kontrolle durch eine Locus
Control Region gebracht werden. Damit hier ein aktives Chromatin gebildet werden kann, helfen
die Cohesine durch Interaktion mit dem CTCF-Protein dabei, die entsprechenden Chromatin Hubs
zu bilden.
Genexpression (Decker, Blsi)
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Transcriptional
Memory
bedeutet,
dass
eine
epigenetische
Vererbung
eines
Transkriptionszustands erfolgt.
An dem Phnomen der Vererbung von negativen Transkriptionszustnden sind die PolycombGenexpression (Decker, Blsi)
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Proteine (Pc-G) beteiligt, an der Vererbung von positiven Transkriptionszustnden die sogenannten
Trithorax-Proteine (Trx).
Trithorax assoziiert also mit stabil vererbbarer Genaktivitt, Polycomb mit stabil vererbbarer
Repression von Genen.
Was sind diese Polycomb-Proteine?
Aus ihnen werden PRC1- und PRC2-Komplexe
gebildet, die beide Reader-Proteine fr die H3K27Methylierung enthalten, der PRC2-Komplex enthlt
auerdem die Methylase Enhancer of Zest. Diese
Methylase kann selbst diese H3K27-Methylierung
vornehmen,
sie
kann
diesen
repressiven
Chromatinzustand also auch propagieren und dafr
sorgen, dass sich dieser weiter fortsetzt.
Das PRC2 erkennt zunchst das H3K27 und methyliert
es, das PRC1 erkennt dann mit seiner Chromodomne
diesen Zustand und bindet daran- Daraufhin fhren beide
Komplexe zusammen, wenn sie ber das trimethylierte
K27 gebunden sind, weitere Chromatin-Modifikationen
wie z.B. die Ubiquitinierung von H2 ein, die insgesamt
den reprimierten Zustand des in der Nachbarschaft
liegenden Chromatins bewirken.
Zelldifferenzierung bedeutet nichts anderes als dass es
eine totipotente Stammzelle gibt, von der aus alle
Differenzierungsrichtungen mglich sind. Wenn diese
Stammzelle
differenziert,
bedeutet
das,
dass
fortschreitend immer mehr Gene permanent abgeschaltet
und andere permanent angeschaltet werden. Es handelt
sich dabei also genau um diese epigenetische Vererbung
eines transkriptionellen Zustands.
Auch bei den Trithorax-Proteinen ist es so, dass sie eher an permissives Chromatin binden und
diesen an sich schon permissiven Zustand fixieren.
Genexpression (Decker, Blsi)
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In aller Regel erfolgt der bergang von restriktivem zu permissivem Chromatin nicht schlagartig,
die zuerst vorherrschende Situation muss allmhlich aufgegeben werden, so dass das Chromatin so
modifiziert wird, dass die fr den jeweils anderen Zustand zustndigen Proteine binden und dafr
sorgen knnen, dass der neue Zustand fixiert wird.
Es gibt Ereignisse, auf die alle Zellen reagieren knnen mssen wie z.B. Infektionen oder
bestimmte metabolische Zustnde, das muss aber nicht permanent mglich sein.
Wie macht man in der DNA eine Sequenz erkennbar, die spter einmal als Enhancer agieren soll?
Bereits bei der Differenzierung der Stammzellen wird das Chromatin im Bereich von Enhancern,
die spter Genaktivitt vermitteln sollen (z.B. der fr das Dihydrotestosteron-Gen), anders
modifiziert als in den benachbarten Bereichen, es bekommt eine Enahncer-Signatur. Diese Signatur
besteht daraus, dass dort sehr oft die varianten Histone H3.3 und H2A.Z vorkommen und dass das
Nucleosom auch modifiziert ist, nmlich vor allem durch die Mono- oder Dimethylierung von
H3K4.
Der nchste Schritt fr die Aktivierung des Enhancers ist, dass der an den Enhancer bindende
Transkriptionsfaktor tatschlich aktiviert wird und dass die Nucleosomen in diesem Bereich
modelliert werden, so dass alle dafr bentigten Transkriptionsfaktoren auch wirklich binden
knnen.
Voraussetzung dafr ist aber eben, dass der Enhancer bereits whrend der Differenzierung der Zelle
epigenetisch durch eine Chromatin-Signatur markiert wird.
Was knnen Transkriptionsfaktoren?
Sie knnen direkten Einfluss auf die Initiation nehmen, indem sie mit den TFIID- und MediatorKomplexen interagieren und so direkten Einfluss auf die Rekrutierung der RNA-Polymerase
nehmen.
Sie knnen auch die Elongation regulieren, z.B. der Heat-shock Stimulating Factor (HSF), wobei
der Initiationskomplex am Promoter bereits gebildet ist, aber die RNA-Polymerase pausiert. Hier
sorgt der Transkriptionsfaktor fr die Rekrutierung von pTEFb, damit fr die Ser2Phosphorylierung und die Aufhebung des Elongationsblocks durch DSIF und NELF.
Sie knnen auch Einfluss auf die DNA-Struktur nehmen, wobei diese Proteine nicht mehr die
klassische Zusammensetzung aus DNA-bindender und Transaktivierender Domne besitzen, hier
werden Transkriptionsfaktoren etwas allgemeiner als mit der DNA oder dem Chromatin
interagierende Proteine, die dadurch Einfluss auf die Transkription nehmen knnen, definiert. In
diesem Fall gehren auch die HMG-Proteine (HMG high mobility group) dazu, die fr die
Krmmung von DNA und die Bildung von Enhanceosomen wichtig sein knnen, aber auch die
Proteine, die fr die Bildung von Chromatin Hubs verantwortlich sind, also CTCF und Cohesine.
Sie knnen auch das Chromatin verndern, sie knnen durch Assoziation mit Komplexen von
Histon-modifizierenden oder -demodifizierenden Enzymen Einfluss auf die Modifikation von
Histonen nehmen, sie knnen Histon-Remodeling-Komplexe rekrutieren, sie knnen
Aktivatorkomplexe bilden oder auch Silencing-Komplexe.
Ein klassischer Transkriptionsfaktor muss eine DNA-bindende Domne (DBD) und in der Regel
eine Dimerisierungsdomne besitzen, was ihn aber eigentlich zum Transkriptionsfaktor im engeren
Sinne macht, ist die Transaktivierenden Domne (TAD).
Was ist die Aufgabe der Transaktivierenden Domne?
Sie kann mit TAFs (TBP-associated Factors), sie kann bei der Rekrutierung von pTEFb helfen, sie
kann aber auch mit Komplexen, die Einfluss auf die Chromatinstruktur nehmen, interagieren, sie
kann nmlich dafr sorgen, dass die Modifikation der Histone einem transkriptionell aktiven
Bereich entspricht oder auch einem transkriptionell inaktiven Bereich.
Genexpression (Decker, Blsi)
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7. Vorlesung (11.05.2012):
Genregulation durch DNA-Methylierung:
DNA-Methylierung bei Sugerzellen betrifft ausschlielich Cytosine und erfolgt an C5. Es wird
dabei auch wieder nicht jede beliebige Cytosin-Base
methyliert, das passiert nur, wenn auf dieses Cytosin ein
Guanin folgt (CpG).
Die meisten dieser C-Nucleotide in Sugergenomen in CpGAbfolgen sind methyliert, eine Ausnahme hierzu sind die
sogenannten CpG-Islands. Das sind am Promoter und
allgemein am 5'-Ende eines Gens gelegene Hufungen dieser
CpG-Nucleotide. Diese sind sehr oft nicht methyliert.
Die Methylierung korreliert oft, aber nicht immer mit transkriptionell inaktiver DNA und stellt eine
Mglichkeit zum Silencing von Genen dar.
Die DNA-Methylierung ist meistens epigenetisch, wird also verwendet, wenn ein Gen dauerhaft, oft
fr immer und grundstzlich, abgeschaltet werden soll.
Eine Gruppe von Genen, bei denen DNA-Methylierung eine wichtige Rolle spielt, sind Imprinted
Genes.
Imprinted Genes sind Gene, deren Expression entweder auf das maternale oder das paternale
Genom beschrnkt ist.
Jeder diploide Organismus besitzt eine Kopie des maternalen und eine des paternalen Genoms,
wobei es in aller Regel so ist, dass Allele unabhngig von ihrer elterlichen Herkunft exprimiert
werden.
Bei den Imprinted Genes wird hingegen immer nur eines der beiden Allele abgelesen, wobei es je
nach Gen unterschiedlich ist, ob es sich dabei um das maternale oder das paternale Gen handelt.
Es gibt also eine Gruppe von Genen, bei denen festgelegt wird, ob im entstehenden Organismus die
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vterliche oder die mtterliche Kopie des Gens exprimiert wird. Dabei spielt die DNAMethylierung eine wesentliche Rolle.
Eine andere wichtige Funktion der DNA-Methylierung stellt die Stilllegung von Fremd-DNA im
Genom dar.
Fremd-DNA kann z.B. retrovirale DNA, retrotransposale DNA, also mobile Elemente im Genom,
oder auch transgene DNA sein und wird sehr oft durch DNA-Methylierung stillgelegt, was
besonders bei mobilen Elementen, die in den meisten Sugergenomen vorkommen, wichtig ist. Bei
Knock-out-Musen der entsprechenden Methylase konnte beobachtet werden, dass es bei
Verhinderung der DNA-Methylierung zu einem gehuften Herumspringen dieser Elemente kommt.
Ist die DNA-Methylierung reversibel?
Methylierungen werden im groen Mastab nur einmal rckgngig gemacht, nmlich in der
Keimbahn bei der Entstehung neuer Gonaden (Keimzellen) im Embryo. Hier wird das
Methylierungsmuster der DNA gelscht, ansonsten ist DNA-Methylierung ein relativ stabiles
regulatorisches Prinzip, es gibt nur wenige Ausnahmen, bei denen die DNA-Methylierung zum
reversiblen Gene Silencing bei Differenzierungsvorgngen dient (z.B. beim IL-2-Gen bei TLymphocyten).
Die Enzyme, die die DNA-Methylierungen vornehmen, heien DNA-Methyltransferasen
(DNMT).
Man unterscheidet zwei Arten von Methylasen zur DNAMethylierung:
De novo-Methylasen: sind dafr verantwortlich, dass
ein Methylierungsmuster auf der DNA etabliert wird, sie
methylieren also dort, wo auch am Gegenstrang noch
keine Methylierung vorhanden ist
Maintenance-Methylasen: sorgen bei Vorhandensein
eines Methylierungsmusters dafr, dass dieses auf
Tochterzellen bertragen wird, wobei sie stark von der
semikonservativen Replikation der DNA profitieren
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Im Bereich des Transkriptionsstarts (kann oberhalb oder unterhalb des Transkriptionsstarts oder
auch im ersten Intron des Gens sein) gibt es vor allem in den sogenannten Housekeeping Genes
CpG-Islands. Diese CpG-Islands sind wichtig fr eine relativ permanente Transkription dieser
Gene, die allgemein relativ wenig reguliert werden. Die Islands werden dabei fr die Assoziation
von Transkriptionsfaktoren, die dafr sorgen, dass diese Gene permanent angeschaltet sind.
Man kann solche Gene mit CpG-Islands aber auch stilllegen, indem man diese methyliert. Die
Methylierung von CpG-Islands ist ein relativ seltener Prozess, wenn er stattfindet, bedeutet das aber
meist ein permanentes Silencing des betreffenden Gens.
Wie wird ein Gen durch DNA-Methylierung stillgelegt?
Es gibt Flle, wo Transkriptionsfaktoren einfach nicht mehr an die DNA binden knnen, wenn die
Cytosine in der Bindungsstelle methyliert sind.
Die andere Mglichkeit ist, dass Methyl-Cytosine durch die Methyl-Cytosin-bindenden Proteine
MeCP1 und MeCP2 erkannt werden knnen.
MeCP2 ist in der Lage, den Sin3A-Komplex an das Chromatin zu bringen, der eine HistonDeacetylase (HDAC) enthlt. Dadurch werden die umgebenden Histone deacetyliert, was das
Chromatin an dieser Stelle transkriptionsunfreundlich macht.
Die Funktion von MeCP1 ist nicht die Rekrutierung von Histon-modifizierenden
Proteinkomplexen, sondern es blockiert wichtige Bindungsstellen z.B. im Bereich der
Initiationsstelle eines Gens.
Technisch fhrt die DNA-Methylierung auerdem sehr oft dazu, dass ein kompakteres Chromatin
gebildet wird, was durch DNAseI-Verdau getestet werden kann.
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Dort, wo das Chromatin stark aufgelockert vorliegt oder in Bereichen von aktiven Enhancern gibt
es teilweise gar keine Nucleosomen mehr.
Bei Zugabe von DNAseI zu Zellkernextrakten schneidet diese vorwiegend in solchen
aufgelockerten Bereichen des Chromatins, weshalb diese auch DNAseI-hypersensitive Sites
genannt werden.
Der Effekt der DNA-Methylierung kann an solchen Stellen dadurch beobachtet werden, dass das
Chromatin an dieser Stelle kompakt wird und die DNA dort aufhrt, hypersensitiv gegenber dem
Verdau durch DNAseI zu sein.
Das Verfahren, mit dem das untersucht wird, nennt man DNAseI Hypersensitivity Mapping.
Genetic Imprinting wurde durch Experimente entdeckt, wo die beiden Zellkerne einer fertilisierten
Eizelle vor deren Verschmelzung entfernt und durch Kerne, die
entweder aus einer nicht fertilisierten Eizelle oder einem
Spermium gewonnen wurden, ersetzt wurden. Das wurde so
durchgefhrt, dass einmal zwei Eizellenkerne, einmal zwei
Spermienkerne und einmal je einer in diese leere Eizellenhlle
eingebracht wurden. Diese rekonstruierte Eizelle mit den zwei
Genomen wurde in Muse implantiert und die Entwicklung der
Embryos abgewartet. Dabei wurde festgestellt, dass nie
Embryonen erhalten werden knnen, wenn die Eizelle
gynogenetisch
(2
weibliche Zellkerne)
oder androgenetisch
(2
mnnliche
Zellkerne) ist.
So wurde festgestellt, dass mnnliche und weibliche
Genome also nicht vollstndig quivalent sind, sie haben
einen Abdruck (Imprint), der sie eindeutig als mnnlich
oder weiblich erkennbar macht. DNA-Methylierung
wurde dann spter als wichtiger Faktor dabei erkannt.
Mittlerweile sind mehrere Hundert solcher Imprinted
Genes bekannt, wobei eine relativ groe Gruppe solcher
Gene mit Wachstumsregulation zu tun haben.
Wachstumsregulation ist etwas, das in der richtigen
Gendosis reguliert werden muss, sowohl fehlende als
auch zu hohe Aktivitt bewirkt hier in der Regel eine
Strung der Homostase des Organismus und es kommt
zu Abnormalitten.
Wann geschieht das Imprinting?
Der Imprint wird bei der Fertilisation etabliert, also
schon in der Eizelle kommen zwei Genome zusammen,
die imprinted sind. Nun gibt es also ein mnnliches und
ein weibliches Genom, aus dem Keimzellen gebildet
werden knnen, es soll aber nur der jeweils auf das
eigene Geschlecht des Organismus bezogene Imprint
weitergegeben werden, da ja immer nur eine Art von
Gameten gebildet wird, entweder Spermien oder
Eizellen. Kurz vor der Bildung der Keimzellen, was ja
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bereits whrend der Embryogenese erfolgt, muss der existierende, von den Eltern weitergegebene
1st Generation Imprint gezielt nur in den Gonaden entfernt werden. Die Gonaden erhalten
schlielich explizite Signale, entweder nur weibliche oder nur mnnliche 2 nd Generation Imprints zu
etablieren. Dabei kommen die De-novo-Methylasen zum Einsatz.
Was ist der Zusammenhang zwischen DNA-Methylierung und Genexpression?
Dieser Zusammenhang ist bei dem Locus, der die beiden Imprinted Genes H19 und Igf2 (Igf
Insulin-like Growth Factor).
H19 ist kein protein-codierendes Gen, sondern codiert fr eine non-coding RNA (ncRNA), deren
Funktion bisher nicht bekannt ist, Igf2 hat eindeutig eine wachstumsregulierende Funktion.
H19 wird nur vom weiblichen Allel, Igf2 nur vom mnnlichen Allel abgelesen.
Fr die Expression sind zwei regulatorische Stellen wichtig, einerseits das Imprinting Control
Element (ICE) und andererseits ein Enhancer, der unterhalb beider Gene liegt, aber beide Gene
aktivieren kann.
Ist die DNA im Bereich des ICE methyliert, kann der Enhancer nicht auf das H19-Gen wirken,
sondern nur auf das Igf2-Gen. Ist das ICE nicht methyliert, bindet dort das CTCF-Protein, das
besonders fr sogenannte Long-range Interactions wichtig ist. Ist CTCF am ICE gebunden,
blockiert es die Fhigkeit des Enhancers, auf das Igf2-Gen zu wirken und das H19-Gen wird
exprimiert. Es gibt also eine paternal-spezifische Methylierung des Kontrollelements.
Hierzu existiert allerdings ein zweites Modell, das besagt, dass bei der Regulation von Imprinted
Genes auch eine ncRNA wichtig ist, nmlich die Air-ncRNA, die von diesem Kontrollelement aus
gebildet werden kann. Man vermutet, dass diese Air-ncRNA im paternalen Genom fr das Silencing
von nur maternal exprimierten Genen verantwortlich ist.
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der Transkriptionsfaktor wird zunchst als inaktive Vorstufe gebildet, aus der durch
Proteolyse die aktive Form generiert wird.
Ein weiterer wichtiger Begriff beim Regulieren von Transkriptionsfaktor-Aktivitten ist
Partnertausch bzw. das Gewinnen oder Verlieren von Partnern.
Auerdem gibt es die sogenannten Nuclear Hormone Receptors, die intrazellulre Liganden
binden, und gleichzeitig auch Transkriptionsfaktoren sind.
Das Gal1-Gen in Hefe, das durch den Gal4-Transkriptionsfaktor reguliert wird, ist ein Beispiel fr
die Bedeutung von Partnern.
In diesem Gal1-Gen knnen drei Zustnde unterschieden werden:
Das Gen ist permanent abgeschaltet, was dadurch geschieht, dass der Transkriptionsfaktor
Mig1 an seine Bindungsstelle bindet und dann einen Tup1-Histon-Deacetylase-Komplex
rekrutiert, woraufhin das Chromatin deacetyliert und damit transkriptionsunfreundlicher
wird.
Gal4 ist gebunden, kann aber seine Aktivitt nicht entfalten, weil das Partnerprotein Gal80
daran bindet, wodurch die Transaktivierende Domne von Gal4 maskiert wird. Bei
Vorhandensein von Galactose sorgt diese dafr, dass Gal80 im Cytoplasma festgehalten
wird und Gal4 kann seine Funktion als Transkriptionsfaktor ausben.
Gal4 ist gebunden und aktiv
Eine weitere Mglichkeit ist, dass Partnertausch wichtig ist, das findet man oft bei Proteinen der
basic Helix-Loop-Helix (bHLH) Familie.
Die Basic Region ist eine Ansammlung von basischen, also positiv geladenen Aminosuren, die zur
Bindung an die DNA bentigt wird, das Helix-Loop-Helix-Motiv ist fr die Dimerisierung
verantwortlich.
Die Mitglieder dieser Proteinfamilie knnen sowohl Homodimere als auch Heterodimere bilden,
was oft darber entscheidet, ob dieses Dimer transkriptionell aktiv ist oder nicht.
Ein Beispiel fr diesen Mechanismus ist
der Transkriptionsfaktor MyoD, der fr die
Differenzierung
von
Muskelzellen
gebraucht wird. Dieser muss also weder vor
noch nach der Differenzierung aktiv sein,
sondern nur whrenddessen.
Das kann dadurch reguliert werden, dass
aktive Dimere gebildet werden, also solche,
bei dem MyoD mit einem Protein aus der
gleichen Familie interagiert, nmlich
entweder E12 oder Ac-S. Wichtig dabei ist,
dass beide Komponenten des dabei
gebildeten Heterodimers sowohl die HelixLoop-Helix-Struktur fr die Dimerisierung
als auch eine Basic Region als DNAbindende Domne besitzen, es knnen also
beide Partner zur DNA-Bindung beitragen.
Wenn die Differenzierung abgeschlossen
ist, wird in den differenzierten Zellen das Id-Protein hochreguliert, wobei Id fr Inhibitor of MyoD
steht. Id bildet mit MyoD Heterodimere, bei denen zwar auch beide Partner die Helix-Loop-HelixRegion fr die Dimerisierung besitzen, dem Id fehlt aber die Basic Region fr die DNA-Bindung.
Dadurch wird das Heterodimer inkompetent fr DNA-Bindung, weil diese nur dann mit
ausreichender Affinitt erfolgt, wenn beide Dimerisierungspartner ber eine Basic Region verfgen.
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Hat man nun ein Gen, das durch Wachstumsfaktoren reguliert wird,
sind dort die zwei Transkriptionsfaktoren gebunden, der Serum
Response Factor (Srf) und Elk1.
Ist die Transaktivierende Domne (TAD) von Elk1 nicht
phosphoryliert, knnen an den Promoter des Gens zwar TFIID und
TFIIA binden, der Rest des Initiationskomplexes nicht.
Das entscheidende Ereignis ist jetzt also die Phosphorylierung der
TAD von Elk1, wodurch Elk1 die Fhigkeit erhlt, mit Mediator zu
interagieren, was zur vollstndigen Assemblierung des
Initiationskomplexes fhrt.
Die hier aktiven MAP-Kinasen werden als Extracellular-signal
Regulated Kinases (ERK) bezeichnet.
Es gibt mehrere MAP-Kinase-Wege, die bei der Transkription auch
kooperieren knnen.
Eines der Gene, die durch Srf und Elk1 angeschaltet werden, ist das
cFos-Gen. CFos ist ein Leucine-Zipper-Protein, also eine
Untereinheit eines Transkriptionsfaktors, die gebraucht wird, um
den dimeren Transkriptionsfaktor AP-1 zu bilden.
AP-1 ist immer ein Heterodimer aus einem Protein der Fos-Familie
und cJun. Beide sind Leucine-Zipper-Proteine mit Basic Region
und beide sind nur als Heterodimer aktiv.
Das aktive cJun kommt durch einen kooperierenden
Signaltransduktionsweg, nmlich den sogenannten Stressaktivierten MAP-Kinase-Weg, zustande. Dabei sind die cJunGenexpression (Decker, Blsi)
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Kinasen aktiv, die aktiviert werden, wenn die Zelle Stress ausgesetzt ist. Daraufhin wird cJun von
diesen phosphoryliert, das dadurch dann in der Lage ist, mit Fos-Proteinen zu interagieren und man
erhlt den aktiven AP-1-Transkriptionsfaktor.
Die hier aktiven MAP-Kinasen werden als cJun N-terminal Kinases (JNK) oder Stress-activated
Phosphokinases (SAPK) bezeichnet.
Die Genregulation durch cAMP ist ein weiteres Beispiel dafr, dass letztlich ein
Transkriptionsfaktor durch Phosphorylierung die Fhigkeit erhlt, Chromatin-modifizierende
Enzyme an den Promoter zu bringen.
Cyclo-AMP ist ein zyklisches 3'-5'-Phosphat von ATP, das durch das
Enzym Adenylylcyclase gebildet wird. Adenylylcyclase wird sehr oft
unter dem Einfluss von sogenannten Seven-Transmembrane-Receptors
(7TM receptors) aktiviert. Diese 7TM-Rezeptoren gehen mit jeweils
einem helikalen Bereich 7-mal durch die Membran hindurch und werden
auch als G-coupled Receptors bezeichnet. Das liegt daran, dass die
Signaltransduktion dadurch erfolgt, dass diese Rezeptoren sogenannte
trimere G-Proteine binden, die groe GTPasen darstellen. Das Resultat
davon ist, dass bei den sogenannten stimulatorischen Rezeptoren dieser
Familie das G-Protein die Fhigkeit erhlt, an die Adenylylcyclase zu
binden, die dadurch aktiviert wird und beginnt, cAMP zu synthetisieren. Das cAMP bindet dann an
die sogenannte regulatorische Untereinheit der Proteinkinase A (PKA), die manchmal auch als
cAMP-stimulierte Proteinkinase (cAPK) bezeichnet wird.
PKA hat zwei katalytische und zwei regulatorische Untereinheiten, wobei die regulatorischen
jeweils zwei cAMP-Molekle binden knnen. Die Bindung des cAMPs fhrt dazu, dass die
katalytischen Untereinheiten abdissoziieren, in den Zellkern wandern und dort den
Transkriptionsfaktor
CREB
(cAMP-responsive
element
(CRE)-binding
protein)
phosphorylieren.
CREB ist wie Elk1 permanent an die DNA gebunden, erhlt aber erst durch die Phosphorylierung
seiner TAD die Fhigkeit, den Coaktivator CBP (CREB-binding protein) oder P300 (haben
quivalente Funktion) zu binden. Bei diesen Coaktivatoren handelt es sich um HistonAcetyltransferasen (HATs), die dann ber Histon-Modifikation und eventuell auch andere
Aktivitten fr das Transkriptionsereignis sorgen.
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Eine etwas andere Konsequenz der Phosphorylierung kann beim sogenannten JAK/STATSignaltransduktionsweg beobachtet werden.
Hier sind die Rezeptoren selbst keine Enzyme, sie sind aber mit Tyrosin-Proteinkinasen, den
sogenannten Janus-Kinasen (JAKs) assoziiert.
Wenn ein Cytokin-Rezeptor ein Cytokin bindet, wird ein Komplex aus den Rezeptorketten und den
Janus-Kinasen gebildet. Die JAKs knnen in dieser Konformation des Rezeptors die Rezeptorketten
an Tyrosin phosphorylieren. Diese Tyrosin-phosphorylierten Rezeptoren knnen jetzt durch STATTranskriptionsfaktoren erkannt werden, da die STATs eine SH2-Domne besitzen, mit der eben
Tyrosin-phosphorylierte Proteine gebunden werden knnen (STAT Signal Transducers and
Activators of Transcription).
Als nchstes werden die STATs von den JAKs selbst Tyrosin-phosphoryliert, woraufhin sie sich
vom Rezeptor ablsen und Dimere bilden, indem das Phosphotyrosin des einen Partners von der
SH2-Domne des anderen Partners erkannt wird und umgekehrt.
Im aktiven Dimer eines STAT-Transkriptionsfaktors gibt es also zwei Phosphotyrosin-SH2Domne-Interaktionen, die es zusammenhalten.
Nur das STAT-Dimer kann in den Zellkern gelangen und an die DNA binden.
Die STAT-Transkriptionsfaktoren sind die einzigen Transkriptionsfaktoren, die durch TyrosinPhosphorylierung aktiviert werden. Die Konsequenz der Tyrosin-Phosphorylierung ist in diesem
Fall keine nderung des transaktivierenden Potentials dieser Transkriptionsfaktoren, sondern die
Dimerisierung und damit die Fhigkeit in den Zellkern zu gelangen.
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Die
Abschaltung
dieses
Signaltransduktionswegs
erfolgt
durch
klassisches Feedback. Feedback bedeutet
immer, dass ein Signal selbst etwas tut, was
dafr sorgt, dass es zur Verstrkung oder zur
Abschwchung des Signals kommt.
Im Fall des NFB-Pathways kommt es zu
negativem
Feedback,
also
zur
Abschwchung des Signals. Eines der
NFB-Zielgene ist IB, dieses wird also
zuerst abgebaut, damit NFB in den Zellkern
gelangen kann, wird dann aber durch die
Aktivitt von NFB wieder neu gebildet.
Sobald wieder genug IB vorhanden ist,
wird NFB durch dieses wieder inaktiviert.
Ein anderer Signaltransduktionsweg, der vor allem fr Zellwachstum und Entwicklung wichtig ist,
ist der sogenannte Wnt-Pathway.
In der Abbildung sind die roten Komponenten diejenigen, die aktiv sind, wenn der Pathway
abgeschaltet sind und die grnen diejenigen, die aktiv sind, wenn der Pathway angeschaltet ist.
Hier geht es darum , dass
eine
Familie
von
Rezeptoren, die als Frizzle
bezeichnet werden und die
sogenannten Wnt-Liganden
binden,
letztlich
den
TranskriptionsfaktorKomplex TCF (T-cell
Factor) aktivieren.
Um TCF aktivieren zu
knnen, bentigt man ein
Protein, das in diesem
Signaltransduktionsweg
eine zentrale Rolle spielt,
nmlich das -Catenin.
Dieses
-Catenin
ist
inhrent, wenn der Pathway
abgedreht ist, was bedeutet,
dass es zwar gebildet, aber
sofort wieder zerstrt wird. Zum Zerstren wird die Proteinkinase GSK3 bentigt, die als Komplex
mit mehreren anderen Proteinen vorliegt. GSK3 ist normalerweise aktiv und phosphoryliert Catenin, das daraufhin ubiquitiniert und in weiterer Folge durch das Proteasom abgebaut wird.
Sobald Frizzle seinen Liganden bindet, wird ein Komplex aktiviert, der das Protein Dishevelled
(Dsh) enthlt. Dieser Dsh-Komplex bindet an den GSK3-Komplex und inaktiviert ihn, wodurch Catenin nicht mehr phosphoryliert wird, sondern stabil bleibt und im Zellkern an einen Komplex,
der den Transkriptionsfaktor TCF enthlt, bindet. Das wiederum fhrt dazu, dass die negativen
Regulatoren der Transkription wie z.B. Groucho, also Proteine, die HDAC-Komplexe rekrutieren,
durch positive Cofaktoren ausgetauscht werden, die acetylierend wirken.
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