Genex – MOLL

1. Geben sie 2 Beispiele für Translationsregulatoren an.

Sie beeinflussen Sekundärstrukturen, verbessern oder verschlechtern die
Ribosomenbindung.
-) Das glgCAP-Operon: Ein Protein bindet 2 Hairpinloops, bei einem wird so
die SD Sequenz verdeckt. Somit ist jegliche Translation abgeschaltet. Einer
ringförmiges RNA Struktur, deren Sekundärstruktur den Hairpinloops ähneln,
ist es möglich mehrere Proteine zu binden und so von der 5' utr weg zu
leiten. Dies geschieht, wenn genug Kohlenstoff vorhanden ist, da so das
Protein translatiert werden kann. Die RNA Struktur baut eine
Endoribonuklease ab.

-) Stringente Kontrolle: wird aktiv bei einem Mangel von Aminosäuren. RelA
dockt an die A Seite und hydrolysiert GTP zum Alarmon. Alarmone binden an
die aktive Seite der RNA-Pol und diskriminiert dort an den σS Promoter.
Ribosomensynthese wird heruntergeschalten, die As Synthese erhöht. Der
Stresspromoter wird aktiviert. Ein anderes Protein hydrolysiert GTP bei
Nährstoffmangel (C).

2. Was ist Riboregulation? Erklären Sie zu cis- sowie transencoded sRNAs

die Unterschiede an 2 Beispielen.
Cis-Antisense RNA bildet perfekte Duplexe, da sie vom Gegenstrang
desselben Loci transkribiert wird.
Der Phage λ stellt eine Cis-Antisense mRNA die ein Duplex zur cro mRNA
bildet. Das Protein cI (λ Protein) ist für den lysogenen, das Protein cro für den
lytischen Zyklus verantwortlich. Das cII Protein erhöht wiederum cI.
Proteasen von E. coli degradieren cII bei guten Bedingungen

Trans-Antisense RNA werden an einem anderen Locus kodiert und bilden

nicht perfekte Duplexe. Sie benötigen Hfq als Chaperon.

Eine mRNA basenpaart an der TIR Sequenz der mRNA für die eisenhaltige
Superoxid-Dismutase. Deren Translation ist somit blockiert. Ist zu viel Eisen in
der Zelle vorhanden, dimerisiert ein Fur Protein bei Eisenbindung. Der Fur
Dimer bindet am Promoter und blockiert so die RNA Polymerase der Trans-
Antisense mRNA zur Dismutase-mRNA.

3. Wie kann das Binden von Ribosomen an die RBS verhindert werden? Wie
können Sie die Mechanismen detektieren?
In vivo: Die Endoribonuklease MazF schneidet bei Überexpression die ACA
Sequenz in der Initiationsregion von mRNAs und die von 16S rRNAs.
Ribosomen sind so nicht mehr länger fähig an die RBS zu binden. Sie können
nun nur mehr an die hergestellten lmRNAs binden.
Verwendung eines E. coli Stammes mit einem mazF Plasmid. Das Plasmid
steht unter Kontrolle eines Phagenpromoters, sowie eines Lac Operators.
MazF wird mit IPTG ungefähr eine Viertelstunde überexpremiert. Beim
folgenden Saccharose-Gradienten werden die Ribosomen in 30S Ue, 50S Ue,
Monosomen und Polysomen aufgetrennt. mRNA wird von rRNAs
aufgereinigt; um DNA Reste nach der Reinigung zu entfernen wird immer
DNase I eingesetzt. Dasselbe führt man mit der Kontrollgruppe durch. Das
erlaubt die Selektion der Polysomen, und so der mRNAs die aktiv translatiert
wurden (Translatom).
Man führt eine RT-PCR an der gesamten rRNA und an der polysomalen 16S
rRNA durch. Dafür setzt man S/X Primer ein, die an der ganzen, wie an der
abgeschnittenen 16S rRNA binden. Für die ungeschnittene 16S rRNA setzt
man einen Y Primer am 3' Ende ein.
{P1RT-PCRMazF|16SrRNA(s/x)} = {P1RT-PCRalle|16SrRNA(s/x)} - {P1RT-PCRintakt|16SrRNA(s/y}
Jetzt läßt sich das Verhältnis von der 70Sintakt : 70SMazF berechnen. Einmal
für die gesamte rRNA (T+) und einmal für die polysomale rRNA (P+). Die
prozentuale Verschiebung der Ribosomenmenge die an die lmRNA binden
können von der gesamten RNA Menge zu der polysomalen RNA Menge wird
nun errechnet.

Namen von Stressgenen und deren Proteinen ist bei EcoGene einsehbar. Ist
ein Stressgen bekannt erfolgt eine RT-PCR von der polysomalen und der
gesamten mRNA. Um die MazF Prozessierung der mRNA zu bestätigen führt
man einen Extension-Assay mit der polysomalen mRNA durch. Profile der
Next-Generation Illumina Sequenzing werden von der polysomalen (P+) und
der gesamten (T+) erhalten, zum Vergleich auch P- und T- vor MazF
Expremierung.
Die Primer werden wieder für die gesamte kanonische Startsequenz und
spezifisch für die leaderless mRNA gewählt. Man sollte nun eine deutliche
Reduzierung der Menge der verbrauchten PCR Produkte mit Primern für die
ungeschnittene mRNA nach MazF Überexpremierung erhalten.
Legt man eine cDNA Bibliothek an und kartiert die Reads gegen das
Referenzgenom, lassen sich Veränderungen der Transkriptmenge nach
MazF+ darstellen. Für verschiedenste mRNAs von Genen die leaderless
transkribiert werden erfolgen Toeprinting-Assays mit aufgereinigten 70SΔ43
Ribosomen.
In vitro: Die Ue der Ribosomen werden chemisch gecrosslinked. Bei etwa
1mM Mg2+ dissozieren alle unvernetzten Proteine. Mit einer mRNA die eine
kanonische RBS und eine leaderless Startsequenz aufweist, 70S Monosom,
radioaktiv markierter Primer, Nukleotide sowie RT wird Toeprinting
durchgeführt. An der selben mRNA wird Toeprinting mit einer 30S Ue
durchgeführt. Das 70S Monosom zeigt das kürzere Toeprintingsignal auf.

4) Was Ist If3 Und Wie Kann Man Seine Funktion In Vitro Bzw. In Vivo
Feststellen? Skizze.

Der Translationsinitiationsfaktor IF3 ist einer der drei Faktoren (IF 1-3), die
für die Initiierung der Proteinbiosynthese in Bakterien erforderlich sind. IF3,
der aus der 30S- UE, der Initiator-tRNA und der mRNA besteht, als
Wiedergabetreue-Faktor fungiert. IF3 ist ein basisches Protein, das an 30S-UE
bindet, die tRNA-Assoziation steuert, indem es die Affinität der fMet-
tRNAfMet verringert und nicht verwandte Initiationskomplexe (Nicht-AUG-
Startcodons) durch Konformationsänderungen unterscheidet. Lokalisierung
der C-Domäne von IF3 an der 30S-UE blockiert der Faktor die Verbindung der
Untereinheiten sterisch. Nach Freisetzung von IF3 stimuliert es eine
Konformationsänderung, der durch Bindung von GTP an IF2 eingeführt wird,
und verhindert Assoziations der 50S- und 30S-UE.
In Vivo Toeprinting-Assay ist eine Technik, um die Position von Ribosomen
(oder UE) auf bekannten mRNAs genau zu messen. Hier wird eine reverse
Transkriptase gestoppt, wenn sie auf einen blockierenden Komplex
(Ribonukleoprotein oder Protein) auf der RNA trifft. Die Länge des Primer-
Verlängerungsprodukts, das erzeugt wird, wenn die RNA von einem solchen
Komplex besetzt ist, im Vergleich zu dem Primer-Verlängerungsprodukt voller
Länge zeigt die 3'-Position des interessierenden Komplexes an. Zur
Bestimmung der IF3-Funktion in vitro wird eine bekannte mRNA-Sequenz,
die eine ribosomale Bindungsstelle (RBS) enthält, mit radioaktiv markierten
Primern (zur Bindung stromabwärts von RBS) und Nukleotiden sowie fMet-
tRNA einmal mit und einmal ohne IF3 inkubiert. Wenn IF3 tatsächlich für
korrekte Positionierung und Bildung des Präinitiationskomplexes (30S, IF1,
IF2 und IF3) wichtig ist, stoppt die reverse Transkription am
Präinitiationskomplex an der Position, die IF3 enthalten. → wird ein kürzeres
cDNA-Fragment erhalten (Toeprint-Signal) als bei der reversen Transkription
von Proben ohne IF3 (Extensionssignal). Sequenzfragmente dann durch
Gelelektrophorese aufgetrennt und durch radioaktiv markierte Sonden auf
einem Southern Blot sichtbar gemacht.
IF3-Aktivität in vivo kann ein Reportergen-Assay durchgeführt werden. Ein
Plasmid, wird das Reportergen lacZ mit Startcodon AUG codiert, in eine Zelle
eingeführt, die Wildtyp-IF3 enthält (ß-Galactosidase kann synthetisiert
werden). Wenn Zellen, mutiertes IF3 enthalten, mit demselben Plasmid
transduziert werden, ist auch eine Produktion von ß-Galactosidase möglich.
Wenn jedoch ein Plasmid, das lacZ und AUU-Startcodon enthält, in Zellen
eingeführt wird, die Wildtyp-IF3-β-Galactosidase besitzen, kann dies nicht
synthetisiert werden. IF3 erfährt eine Konformationsänderung, wenn es an
ein anderes Startcodon als AUG gebunden ist und die anschließende
Transkription verhindert (IF3 diskriminiert andere Codons). Wenn das gleiche
Plasmid in Zellen eingeführt wird, die eine mutierte Version von IF3 besitzen,
kann ß-Galactosidase immer noch hergestellt werden, jedoch nur mit 1/3 der
ursprünglichen Translationseffizienz. Die Mutante IF3 kann nicht mehr
dieselbe Konformationsänderung durchlaufen, wodurch Wildtyp-IF3
zwischen AUG und anderen Startcodons unterscheiden kann. Daher zeigt es
keine erhöhte Bindungsaffinität zu AUU, sondern initiiert die Translation von
& bgr; -Galactosidase.
Was anderes kurz
In Vivo:
Reportergene Assay--> Produkt in großer Mende vorhanden wenn IF3, AUG Start-
Codon, Ribosom, fMetTRNA wenig bis kaum Produkt--> wenn andere Start-Codons
statt AUG
In Vitro:
Toeprint Assay---> Toeprint Signal bis zum Ende, keine Bindung, nur mRNA+ fMettRNA
und Ribosom----> Signal bei Bindung des Komplexes. mRNA+ fMettRNA, Ribosom und
andere tRNAs bekommt man viele Signale, bindet öfter. mRNA+ fMEttRNA, Ribosom
und IF3 --> nur Signal bei AUG . Affinitätschromatographie--> Antigene gegen IF3 auf
der Säule

5) wie kann man experimentell feststellen, dass ein TF die shine dalgarno
sequenz bindet? Nennen sie zwei experimente. Skizze!
Prokaryoten besitzen eine "interne Initiation", was bedeutet, dass ihre
Translationsinitiationsstelle durch die direkte Wechselwirkung des Ribosoms
mit der Initiationsregion RBS definiert ist. Diese Wechselwirkung wird durch
die rRNA / mRNA-Assoziation von Anti-Shine-Dalgarno (aSD) - bzw. Shine-
Dalgarno (SD) -Sequenzen erreicht. Die SD-Sequenz ist eine RBS in
bakterieller mRNA. Die SD-Sequenz hilft dabei, das Ribosom für die mRNA zu
rekrutieren, um die Proteinsynthese zu initiieren, indem das Ribosom mit
dem Startcodon ausgerichtet wird. Die Länge der aneinander gebundenen
aSD- und SD-Sequenzen und ihre entsprechende Stärke der Wechselwirkung
bestimmen die Stabilität der ribosomalen Bindung. Wenn die Sequenzen zu
lang und die Bindung zu stabil ist, kann sich das Ribosom nicht bewegen. Eine
Übersetzung ist daher nicht möglich.
Die Initiierung der prokaryotischen Translation hängt von der Bildung des
Initiierungskomplexes an der SD-Sequenz ab, der die Initiator-tRNA (fMet-
tRNA), IF1, IF2 und IF3 sowie die mit S1 assoziierte kleine ribosomale 30S-
Untereinheit umfasst. Auch Toeprint-assay. In E. coli ist die
Translationsinitiierung S1 essentiell, da sie für die Translation von mRNAs mit
kanonischen ribosomalen Bindungsstellen und einer 5'-UTR (nicht
translatierte Region) erforderlich ist. Es bindet das 30S-Ribosom durch
direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen und interagiert mit einer
Enhancersequenz stromaufwärts von SD als Teil des
Translationsinitiationskomplexes.

6) Vergleichen sie Cis-Antisense-sRNA aus Bakterien mit Si-Rna in

Eukaryoten! Skizze!
Riboregulation wird verwendet, wenn RNA als genetischer Regulator die
Translationseffizienz beeinflusst. Riboregulatoren sind nicht-kodierende
Antisense-RNAs, d. H. Einzelsträngige RNAs, die zu einer Protein-kodierenden
mRNA, mit der sie hybridisieren, komplementär sind und somit ihre
Translation in Protein blockieren.
Riboregulatoren können in zwei verschiedene Gruppen eingeteilt
werden: cis-kodierte RNA und trans-kodierte RNA. Ersteres führt zu
Transkriptionsschwächung, Translationshemmung, Hemmung der
Bildung eines aktivierenden Pseudoknotens und Förderung /
Hemmung des mRNA-Abbaus. Perfekte Duplexe, Kontrolliert plasmid-
Transposon und Phagengene.

Es gibt verschiedene Transkripte, die dsRNA-Strukturen annehmen können,

die von Dicer zu siRNAs (small interfering) verarbeitet werden können. Diese
Transkripte umfassen repetitionsassoziierte Transkripte (Centromere,
Telomere), virale RNAs, Haarnadel-RNAs, konvergente Transkripte oder
andere Antisense-Paare, Gen / Pseudogen-Duplexe, Transgen-Transkripte
und Tasi-RNAs. Duplexe können intra- oder intermolekular sein. Eine siRNA
besteht aus Leitstrang, der zu funktionalem siRISC zusammensetzt, und
Passagierstrang, der ausgeworfen und abgebaut wird. Alle Formen von siRISC
enthalten die an ein Ago-Protein gebundene siRNA und in der Regel auch
einige zusätzliche Faktoren. Ziel-RNAs werden durch Basenpaarung erkannt,
und die Stummschaltung erfolgt über einen von mehreren Mechanismen. In
vielen Spezies können siRNA-Populationen, die ein Ziel angreifen, durch die
Wirkung von RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRP) -Enzymen amplifiziert
werden, wodurch die Silencing-Reaktion verstärkt und aufrechterhalten wird.
Während kanonischen RNA-Interferenz (RNAi) erkennt siRISC eine perfekt
komplementäre mRNA → zu einer agokatalysierten mRNA-Spaltung an einer
einzelnen Stelle innerhalb des Duplex führt →Nach der Spaltung
funktionelles siRISC regeneriert, während mRNA-Fragmente weiter abgebaut
werden. siRISC kann auch, Ziele mit partieller Komplementarität erkennen,
was zu Translationshemmung, die eine translationale Repression und einen
exonukleolytischen Abbau beinhalten. Darüber hinaus kann siRISC die
Bildung von Heterochromatin induzieren → indem es mit entstehenden
Transkripten und RNA-Polymerasen assoziiert wird. In Pflanzen führt das
Target-Engagement zur Assoziation oder Aktivierung einer DNA-
Methyltransferase (DMT), die die DNA methyliert. Bei S. pombe und
vermutlich auch bei Tieren handelt es sich um eine Histon-Methyltransferase
(HMT), die Lys9 von Histon H3 methyliert und dadurch eine
Heterochromatisierung induziert. Bei den meisten anderen Eukaryoten als
Insekten und Säugetieren induziert die Zielerkennung durch siRISC die
Synthese von sekundären dsRNAs und siRNAs durch RdRP-Enzyme. Die
sekundären dsRNAs werden von Dicer zu siRNAs verarbeitet, die dem siRISC-
Pool hinzugefügt werden. In Nematoden entstehen viele der sekundären
siRNAs als einzelsträngige, unprimierte Transkripte mit 50-Triphosphaten und
erfordern keine Dicer-Prozessierung.

7) Wie können RNA-Moleküle in der Translation auf Translations -

beeinflussende Proteine Einfluss nehmen? Skizzen A. Wie kann man das
binden Nachweisen? B. Wie kann man nachweisen, dass es genau das
Protein Of Interest Ist, dass an das RNA Molekül gebunden ist?
Bei Prokaryoten beruht die Transkriptions- und Translationskontrolle auf
Riboschaltern, die beim Empfang von Reizen durch ein äußeres Ereignis
bilden, das mit dem Stoffwechselstatus der Zelle zusammenhängt. Diese
Stammschleifenstrukturen brechen die Transkription entweder vorzeitig ab
oder binden die SD-Sequenz und hemmen dadurch die
Translationsinitiierung. RNA, die an der Bildung der Stammschleifenstruktur
beteiligt ist, kann in zwei Domänen unterteilt werden: die Bindungsdomäne
oder das Aptamer und die regulatorische Domäne, die die RBS enthält. Das
Aptamer hat strukturierte Bindungstasche → hohe Affinität und Spezifität für
Liganden ausdrückt. Die regulatorische Domäne reagiert mit strukturellen
Änderung der Ligandenbindung durch das Aptamer und verändert dadurch
die Genexpression. Die Translationskontrolle wird durch die gegenseitig
ausschließende Bildung eines Anti-Anti-RBS-Stammes oder eines Anti-RBS-
Stammes vermittelt.
Chemical Probing: Beim
chemischen Untersuchen von
RNA werden Chemikalien
verwendet, die mit
ungepaarten Basen von RNAs
wie CMTC-modifizierendem
Uracil, DMS-modifizierendem
Adenin und Cytosin oder Kethoxal, das Guanin modifiziert,
reagieren. Ihre Reaktivität hängt von der lokalen RNA-
Struktur ab. Zielpositionen auf der RNA können → durch
Binden von Proteinen vor den Reagenzien geschützt werden,
mit chemischem Sondieren zum Testen der Proteinbindung.
Wenn RNA durch eine reverse Transkriptase in eine DNA-
Kopie revers transkribiert wird, → erzeugte cDNA an
modifizierten Positionen verkürzt, da das Enzym durch die
Addukte blockiert wird. cDNA-Sequenzen unterschiedlicher
Länge geben → Auskunft über die Reaktionshäufigkeit an
jeder Basenposition, → spiegelt Strukturprofil entlang der
RNA wieder. cDNA-Sequenzen durch Gelelektrophorese
aufgetrennt und sichtbar gemacht; Die Intensität der Bänder
→wie die Häufigkeit der Beobachtung einer Kürzung an einer
bestimmten Position.
toeprint-Assay: Um die Assoziation eines Proteins an mRNA
zu bestimmen→ mRNA inkubiert mit dem Protein und einem
der oben genannten Reagenzien die ungepaarten Basen
modifizieren. → der Extrakt wird gereinigt und die mRNA
denaturiert. → mRNA wird unter Verwendung von
markierten Primern revers transkribiert, die
verschiedene Positionen an der mRNA und radioaktiv
markierte Nukleotide. → cDNA-Synthese stoppt bei der
Erzeugung modifizierter Basen verschiedene cDNA-
Fragmente unterschiedlicher Länge → durch
Gelelektrophorese aufgetrennt → und auf Southern Blot
visualisiert.
Immunpräzipitation: kann bestimmt werden, wo und
wie sich ein Protein bindet→ mRNA-Fragmente werden
mit dem Metaboliten inkubiert und durch UV-Strahlung
vernetzt. → Zielmolekül gebunden, kann der RNA-
Protein-Komplex durch Immunpräzipitation über
metabolitenspezifische Antikörper isoliert werden.
Während der Reinigung des Metabolit-Antikörper-
Komplexes wird auch vernetzte mRNA isoliert, wodurch
die durch RNA-Sequenzierung gebundene spezifische
mRNA-Sequenz identifiziert werden kann.
8) Programmed Frameshift
a) Mechanismus erklären + Beispiel + Skizze
b) Experiment, mit dem man Frameshift nachweisen kann (Skizze).
Frameshifting: (aufbau erklärung+BSP+Nachweis+skizze)
Dabei bewegt sich das Protein entweder um eine Base vorwärts
oder rückwärts auf der mRNA und ändert dadurch den Reading-
Frame. Befindet sich in einem Open-Reading-Frame ein Frameshift
(bsw. zwischen orfA und orfB), ist es dem Ribosom möglich ein
chimäres Protein zu translatieren. Kommt es zu keinem FS stoppt
das Ribosom.
+1 Frameshifting: E. coli RF2: Bei genug RF2 von E. coli, erkennt es
das Stoppcodon (UGA an der A Seite) und es kommt zur
Termination. Ist nicht genug vorhanden stallt das Ribosom, die SD-
aSD Interaktion ist nicht optimal und es kommt zur Einrückung des
Ribosoms um + eine Base.

-1 Frameshifting: E. coli dnaX:

DNA Polymerase III besitzt die beiden Ue γ und τ, die im Verhältnis
1:1 translatiert werden. Die SD Sequenz hält das Ribosom zurück,
sodass es an der A-reichen Slippery Sequenz eine Base
zurückrutscht. Der Hairpinloop hat ebenso Einfluß bei dem -1
Frameshift. Ein Triplet später folgt das Stopcodon für das γ Protein.
Τ ist der Standardweg.

Damit das alles funktioniert, muss Damit das funktionieren kann,

muss das Ganze eine Form haben. Wir haben eine Shine-Dalgarno-
ähnliche Sequenz, eine Slippery-Sequenz (auf dieser kann das Ribosom quasi
„herumrutschen“), ein Stopp-Codon und einen Stem-Loop. Der Stem-loop ist
eventuell daher wichtig, dass das Ribosom nicht schnell weitergehen kann,
sondern eine Zeit lang in dem Rahmen bleibt und die Chance somit erhöht,
dass es zu einem Frame-Shift kommt.

+1 frameshifting Mammalian antizyme gene: Die

Ornithin Decarboxylase (ODC) stellt aus der
nichtproteinogenen As Ornithin das Polyamine
Putrescin her. Sind genug Polyamine vorhanden,
kommt es zum Frameshifting wodurch das Antizym
(AZ) translatiert wird, welches ODC degradiert.

Beispiel T4 Gen 60: Hier bildet sich im codierenden

Bereich der mRNA eine Sekundärstruktur. Das
Ribosom ignoriert diesen einige hundert nts langen
Bereich und translatiert nur die ungebunden
vorliegenden Bereiche der mRNA, ohne die
Translation zu unterbrechen. + T4 DNA
Topoisomerase Gen 60 Bypassing für Ue der Typ II Topoisomerase im 1:1
Verhältnis → Ein temperaturabhängiges System, bei dem das Ribosom ganze
50 Nukleotide bei 37°C umgeht oder bei 10°C ganz dissoziert: Die
freiwerdende Lys As Kette (+ gel.) mit dem 5' stem loop verlangsamen das
Ribosom, verursachen eine Strukturänderung im Ribosom, die eine Bindung
von RF verhindern und ein Abheben am GGA Codon (an der P Seite)
erlauben. Die SD-artige Sequenz bestimmt die Landung am GGA Codon.

9) Riboswitch, Thermosensor +Aufbau+ Erklärung & Nachweis?

1) Riboswitch a) Aufbau und Funktion erklären + 1 Beispiel nennen mit
Skizze b) 1 Experiment nennen, um Riboswitch nachzuweisen + Skizze
Regulation der Translation durch RNA Sekundärstruktur
Am T4 Phagen wird die Translation des Gens zur Lyse von Zellen blockiert→
da AUG in einer Sekundärstruktur liegt. späte Promoter transkribiert kürzere
mRNA, die translatiert werden kann.
• Breathing
Sekundärstrukturen 'breathe', öffnen und schließen sich wieder. Beim 𝛌
Phage beeinflusst die Ratio von S105 (ein Holin) und S107 (Inhibitor mit einer
2 As-Verlängerung) den richtigen Zeitpunkt für die Zelllyse.
• Thermosensor
Beim Pathogen Listeria Monocytogenes (Lebensmittelvergiftung) öffnet sich
die SD Sequenz der Sekundärstruktur bei 37 °C für das Protein prf A. = Zipper-
Mechanismus.
Switches erlauben unter Ausbildung eines Pseudoknoten eine
Proteintranslation (cspA) bei niedrigen Temperaturen. Eine andere
Sekundärstruktur bildet die ROSE Familie (repressor of heat-shock gene
expression) vieler Gram-Negativer Bakterien.

• Riboswitches
Vitamine, As und Purin führen zu
einer Abschwächung der
Proteintranslation durch
Ausformung eines Stemloops an der
SD Sequenz, der so die Translation
blockiert.

Riboswitches Aufbau aus zwei Komponenten: Das Aptamer bindet den

kleinmolekularen Liganden und daraufhin eine Konformationsänderung, die
eine Veränderung der Sekundärstruktur ist, der angrenzenden
Expressionsplattform bewirkt. Diese Konformationsänderungen verändern
die Expression des Gens, indem sie entweder die Transkription beenden oder
den Beginn der Translation hemmen. Die Expression des biosynthetischen
coboperons Cobalamin (Cbl) in Salmonella typhimurium wird durch das
Endprodukt unterdrückt. wird auf translationaler Ebene übertragen und
beinhaltet eine cobalamininduzierte Faltung einer RNA-Hairpin, die die
ribosomale Bindungsstelle (RBS) der cob-mRNA sequestriert und die
Einleitung der Translation verhindert.

Nachweis:
In Line-Probing:→ Einzelsträngige RNA degradiert wesentlich schneller.
mRNA wird radioaktiv markiert → nach einer gewissen Degradationszeit wird
jeweils eine Probe einmal mit und einmal ohne Ligand aufs Gel aufgetragen.
Mit Ligand wird die mRNA geschützt, das zeigt sich als Footprint am Gel.

SAM→ (S-Adenosyl-Methionin) ist am Schwefel Stoffwechsel und an der

Methioninsynthese aktiv. bindet bei gram(-) Bakterien einen Repressor, →
Komplex bindet an die Metbox der DNA und blockiert so die RNA-
Polymerase. In gram(+) Bakterien bindet SAM an die mRNA und kommt zur
Ausbildung eines Terminator stem, der sich an der poly-U RUT Sequenz
befindet. Der schräge Hairpin dieser rho-unabhängigen Termination bricht so
die RNA Transkription ab. In vitro konnte eine verstärkter Terminator-Bande
durch SAM Zugabe angezeigt werden.

Thiamine Pyrophospat (TTP =Cocarboxylase) fungiert im Kohlenstoffwechsel

als Coenzym: → Translatorisch Kontrolle: In e. coli (gram -) führt TPP zu einer
Sekundärstruktur am 5' Ende (UTR) welche die SD Sequenz verdeckt.
Transkriptionelle Kontrolle: In B. subtilis (gram +) führt die Bindung von TPP
zu einem Terminator stem. Splicing Control: Im rotem Schimmelpilz führt die
Bindung im Intron zu dessen Splicing. Processing/ Stabilitätskontrolle: Im
wilden Blaugras bindet TPP zur Stabilität nah am PolyA-Anhang.

-) Regulation der Genexpression auf posttranskriptionaler Ebene in Pro‐ und

Eukaryoten
-) Beeinflussen die Translation! Translationale Repressoren und Aktivatoren
Das P32 Protein ist autoreguliert und bindet am 5' Pseudoknoten seiner
eigenen mRNA. Bindet ein P32 können weitere P32 binden bis die SD Seq.
überdeckt ist.

Stringente Kontrolle als Antwort auf Nährstoffmangel – Guanidin

Tetraphosphatzyklus (RelA-pppGpp)
Kommt es zu einem Mangel an Aminosäuren bleibt das Ribosom mit einer
leeren A Seite stehen. Die Guanidintetraphosphatsynthetase (RelA) dockt mit
hoher Affinität an die A Seite und hydrolysiert dort GTP+ATP zum Alarmon
pppGpp. Das Alarmon bindet an die aktive Seite der RNA-Pol und
diskriminiert dort gegen den σ70 Promoter. Folglich wird die Ribosomen- als
auch die tRNA Synthese heruntergeschalten. Die As-Synthese wird dafür
erhöht. Daneben aktiviert es die rpoS (σS) Transkription und darauf folgend
Gene für die Glykolyse, Stressantwort. Bei C-Mangel erzeugt SpoT
(Synthethase, Hydrolase für die Autoregulation) als Stressanwort ebenso
pppGpp.

Das glgCAP-Operon:

Threonin-tRNA Synthetase
wird autoreguliert indem die Synthetase an die Domain 2 (mit SD Seq.) der
eigenen mRNA bindet. Das Ribosom wird an der mRNA 'entrapped' wie bei
S15.

Feedback Loops – Autoregulation der Translation

• Gene von ribosomalen Proteinen (mit Genen von nicht-ribos. Proteinen) sind
in Operons organisiert.
• In jedem Operon gibt es ein Gen, dessen Protein an der eigenen rRNA als
Regulator (< Affinität) wirkt.
• S15 bindet an einen Pseudoknoten der eigenen mRNA an dem sich das G des
Startcodons befindet, dadurch kann keine Codon-Anticodon Interaktion
stattfinden. Wenn gewollt kann ein Toeprint Assay durchgeführt werden.
Feedback Lane wird am Gel oberhalb vom Tertiär Komplex liegen.

-) Translationelle Kopplung erklären(positive und negative) und skizze:

N:kann mit oder ohne Überlappung der Gene stattfinden. Solange Spacer
keine 30-40nt übersteigt, ist keine Dissoziation des Ribosoms nötig. Bei der
Überlappung beträgt das Coupling des Ribosoms 2nt. Liegen die Gene A und
B überlappend vor und weist
Gen A eine stärkere Ribosomenbindungsstelle als Gen B auf, wird Gen A
verhältnismäßig stärker translatiert werden als Gen B → (Translation von Gen
A verhindert die Translation von Gen B). Dies kann dadurch zustande
kommen, dass das Ribosom das Startcodon des zweiten Gens einfach
überliest.
P:Fall von positiver Kopplung tritt beim Phagen MS2 auf → Erst nach
Translatierung des Coat-Protein Gens, geht eine Sekundärstruktur für ein
anderes Ribosom auf, die sonst die Startsequenz des Replikase-Protein-Gens
verdeckt. Die Translation eines Gens ist für die Translation eines weiteren
Gens notwendig. Translation von Gen A ist notwendig, damit Gen B
überhaupt translatiert werden kann. Dies spielt bei Sekundärstrukturen eine
Rolle: Wenn die mRNA ans Ribosom kommt, dann macht es die
Sekundärstrukturen auf und es kann zur Translation des zweiten Gens
kommen.

Translational attenuation:
Bsp.: SecA ist eine ATPase von E. coli und
unterstützt den Proteintransport durch den
SecYEG-Kanal. Die RBS und das Startcodon für
das Antibiotika- Resistenz-Gen sind in der mRNA
durch die Sekundärstruktur verdeckt (a),
wodurch das Ribosom dieses Gen nicht
translatieren kann. Wenn nun ein Ribosom in der
upstream leader region Translation beginnt
bildet sich eine Sekundärstruktur downstream
davon, die die RBS von SecA blockiert. Ausgelöst
durch Antibiotika, d.h. wenn zu wenig SecA
vorhanden ist, bleibt das Ribosom inmitten der
Peptidtranslation stehen. Dadurch öffnet sich die
Sekundärstruktur und die RBS wird frei. Dieser
angehaltene Arrest bleibt so lange aufrecht bis
genug SecA zur Verfügung steht um die Antibiotika aus der inneren Membran
hinaus zu befördern.
Transcriptional attenuation:+bsp+skizze
findet sich häufig bei Genen und Operons, die mit der Biosynthese zu
tun haben. Diese Gene bzw. Operons besitzen eine Leadersequenz,
die mehrfach für die AS codiert, deren Biosynthese durch die
nachfolgenden Gene erfolgt. Bsp: Trp-Operon. Die mRNA des Operons
bildet nach der Leader Sequenz eine Sekundärstruktur. Ist
ausreichend Trp vorhanden, translatiert das Ribosom die
Leadersequenz und löst sich durch die folgende Sekundärstruktur
wieder ab. Steht wenig Trp zur Verfügung, ist auch die Trp-tRNA
Konzentration niedrig und das Ribosom muss die Translation der Trp-
Leadersequenz stoppen. Der Stop bewirkt eine
Konformationsänderung der bereits translatierten mRNA, wodurch
sich wiederum die folgende Sekundärstruktur auflöst. Nach dem
Auflösen der Sekundärstruktur löst sich das Ribosom nicht von der
mRNA sondern translatiert weiter und kann so die Enzyme zur Trp-
Biosynthese erzeugen. Es handelt sich hier um eine Mischung
zwischen translativer und transkriptiver Attenuation.

- Ist genügend von der AS vorhanden, wird das Leader-Peptid sehr

schnell translatiert → es bildet sich eine Sekundärstruktur in der
mRNA, die als transkriptioneller (!) Terminator wirkt → die
Polymerase bleibt stehen - Ist wenig von der AS vorhanden, kann die
Leader-Sequenz nicht oder nur langsam translatiert werden, es
kommt zu keiner Terminations-Struktur und die Synthese-Gene
können transkribiert werden.

Leaderless mRNA:
starten mit dem AUG Codon,fehlt die 5' utr.
zeigt das allein die AUG Sequenz und die Codon-
Anticodon Interaktion nötig ist. Unser
Labormodel ist die leaderless mRNA Cl des
Repressors vom Phagen λ. In pro- &Eukaryonten
translatierbar. In menschlichen Mitochondrien
sind nur lmRNA. Für die Initiation benötigt es
den tRNA Shuttle IF2(pos.). Sie steigert die
Effizienz der Translation. Da IF3 die Affinität zur
tRNA abschwächt, inhibiert sie die
Ribosomenaktivität.(neg). keine SD sequenz.
Bringt man leaderless mRNA in gram- Bakterien
ein, so kann diese translatiert werden, normale
mRNA aus gram- Bakterien kann in gram+
Bakterien allerdings nicht translatiert werden,
da sie S1 benötigt, das viele gram+ Bakterien nicht besitzen. Bei Archae z.B.
bei Sulfolobus solfataricus sind ca. 70% aller mRNAs monocistronisch und
leaderless, es handelt sich dabei um nichtkanonische mRNA. cI ist eine mit
AUG beginnende leaderless mRNA. In Versuchen konnte sie in E.coli,
Sulfolobus und Reticulocytenlysat aus Kaninchenaugen translatiert werden.
OmpA mRNA aus E.coli ist bei Versuchen im direkten Vergleich damit nur in
E.coli, aber nicht in Sulfobolus oder Eukaryoten translatierbar. Es wird daher
angenommen, dass es sich bei leaderless mRNA um eine alte Form von
mRNA handelt, bevor sich ribosomale Bindungsstellen entwickelten.

IF2 ist ein durch alle Organismen hoch konservierter translationaler Faktor. In
Prokaryoten erhöht er die Bindungseffizienz der fMet-tRNA an die P-site des
Ribosoms. Da die translationale Maschinerie in Mitochondrien der
bakteriellen sehr ähnlich ist, dürfte IF2 hier dieselbe Funktion ausüben. In
Archae und Eukaryoten dient IF2 demgegenüber der Bindung der großen
ribosomalen UE an die kleine. Im Fall der leaderless mRNA kann ein Ribosom
nur dann den Anfang der Translation finden, wenn es über die Initiator-tRNA
an das Startcodon bindet. Zu diesem Zweck muss das Ribosom bereits vor der
Bindung an die mRNA einen Komplex mit der tRNA eingegangen sein. Um
diese Situation zu begünstigen, kann mit Hilfe von Plasmiden die
Konzentration von IF2 in der Zelle erhöht werden. Durch diese
Konzentrationserhöhung sollte die Expression von leaderless mRNA
gesteigert werden. IF3 diskriminiert gegen alle Codons außer AUG und
verändert zu diesem Zweck die Konformation des Ribosoms. Im Versuch mit
leaderless mRNAs die als Startcodon AUU benutzen, sinkt die Translation,
wenn IF3 hinzugefügt wird, da das Ribosom durch die
Konformationsänderung leicht von der mRNA abdiffundiert.
Experiment:Toeprint-assay: Beweis, dass IF3 gegen leaderless mRNA
selektioniert (Toeprint). - Spezielle mRNA mit AUG am 5'-Ende und einem
weiteren AUG mit vorgelagerter SD (siehe vorne) 5'-AUG-SD-AUG-3'. +
Ribosom + tRNAi. Ein Toeprint assay ergibt zwei Banden für beide AUGs.
- Die Zugabe von IF3 mit anschließendem Toeprint Assay ergibt nur eine
Bande für das AUG mit SD Sequenz.
MazEF Module: mazEF ist ein Toxin-Antitoxin-Modul, das sich auf dem
Escherichia-coli-Chromosom und dem einiger anderer Bakterien,
einschließlich Krankheitserreger, befindet. mazF spezifiziert für ein stabiles
Toxin, MazF und mazE spezifiziert für ein labiles Antitoxin, MazE, das MazF
antagonisiert. MazF ist eine sequenzspezifische mRNAEndoribonuklease, die
als Reaktion auf verschiedene Belastungen einen programmierten
Zelltodpfad initiiert. Der mazEF-vermittelte Todesweg kann als
Abwehrmechanismus dienen, der die Ausbreitung einer bakteriellen
Phageninfektion verhindert und es Bakterienpopulationen ermöglicht, sich
wie multizelluläre Organismen zu verhalten.
ELONGATION:
Für die Elongation sind die Faktoren EF-Tu, EF-Ts und EF-G essentiell. Diese
Faktoren sind für Bakterien spezifisch, es gibt kaum Homologien zu
eukaryotischen Faktoren. Daher wäre hier ein guter Ansatzpunkt für
Antibiotika. Viele Imidazolverbindungen stören die Interaktion zwischen EF-
Tu und EF-T, Kirromycin bindet EF-Tu an das Ribosom, wodurch die weitere
Translation unterbrochen wird.
Ablauf der Elongation:
1. Eine aa-tRNA (Aminoacyl-tRNA) kommt und mit aktives
EF-Tu-GTP (rot) gebunden (Ausnahme: fMettRNA). EF-TU-
GTP bringt die aa-tRNA zur A-Site des Ribosoms, P-Site
bereits besetzt ist. Bindet eine aatRNA in der A-Site, wird
die tRNA ohne AS aus der E-Site freigesetzt. Das gebundene
GTP wird gespalten, EF Tu-GDP wird freigesetzt, ist in dieser
Form inaktiv und bindet deshalb aa-tRNA nicht effizient. Um
den Faktor EF-Tu-GDP wieder in aktive Form zu überführen,
wird durch Faktor EF-Ts das gebundene GDP mit GTP
ausgetauscht.
2. Nachdem eine aa-tRNA an A-Site gebunden hat und
EFTu- GDP sich vom Ribosom gelöst hat, wird die
Polypeptidkette von der tRNA in der P-Site mit der neuen
AS der tRNA in der A-Site verknüpft. keine
Peptidyltransferase, die Peptidbindungen knüpft, dieser
Vorgang wird von der 50S UE durchgeführt, die rRNA dient
als Ribozym. Es kommt zu einer Proofreading-Reaktion, um
zu überprüfen, ob auch die richtige tRNA gebunden wurde. Danach kommt es
zu einem durch das Ribozym dirigierten nucleophilen Angriff durch die AS in
der A-Site auf die C-terminale Carboxylgruppe der Peptidkette in der P-Site
durchgeführt.
3. Anschließend bindet das Motorprotein EF-G-GTP, das das Ribosom unter
Hydrolyse von GTP um ein Codon weiterschiebt, EF-G-GDP löst sich wieder
vom Komplex ab. Die unbeladene tRNA liegt jetzt in E-Site und kann das
Ribosom verlassen, die tRNA mit der Polypeptidkette liegt in der P-Site, die A-
Site ist leer.
Das Peptidyltransferasezentrum liegt in der 23S rRNA der 50S Untereinheit.
Hier kommen sich Amino- und Carboxylgruppen einander physisch so nah,
dass eine Bindung mittels Konformationsänderung der umgebenden RNA
vermittelt werden kann.
EF-G-GTP bindet in der Nähe der A-site. EF-G-GTP, das tRNA mit
angehängtem nascent Polypeptid bindet, schiebt sie von der Asite zur P-site.
Die entladene tRNA, die sich in der P-Site befand, verschiebt sich zur exitsite.
Die mRNA und die beiden tRNAs bewegen sich relativ zum Ribosom. Das
Ribosom im Ganzen bewegt sich nicht, aber es ist in sich selbstständig
beweglich.
Molecular Mimicry: EF-Tu gebunden an die tRNA sieht relativ ähnlich aus wie
EF-G → EF-G, obwohl es keine tRNA gebunden, hat mimikt die tRNA, um in
die A-Site des Ribosoms zu passen und seine Funktion ausführen zu können.
Termination: (oben termination aber reihe 2 Recycling)
-) Molekulare Mimikry: erlaubt
Release Faktoren 1/2 an
derselben Position A wie EF-Tu
zu landen. RF1 erkennt
UAG/UAA als Stopp Codons.
RF2 --//-- UGA/UAA als Stopp
Codons. Die Esterbindung der
Peptidyl-tRNA wird nach
Landung von RF1/2 an der A
Seite hydrolysiert, es kommt
zur Freilassung der Peptidkette.
Mithilfe RF3 dissoziert RF1/2.
Es kommt zur GTP Bindung an
der A Seite. Hydrolyse des
gebundenen GTP befreit RF3.
RRF mit EF-G leiten durch
Hydrolyse die Dissoziation der
Ue ein. IF3 bindet an die 30S
Ue und verdrängt die tRNA und mRNA.
-) Ablauf: Das Ribosom bleibt an einem Stopp-Codon stehen, weil es keine
passende tRNA für dieses Codon gibt und das einzige, was passt, ist RF2, der
an dieser Stelle in die ASite bindet. Es kommt zu einem Freisetzen des
fertigen Peptids, woraufhin der größere RF3 an RF2 bindet. RF3 (ein G-
Protein) hat zuerst GDP gebunden, welches nach Binden an RF2 freigesetzt
und durch ein GTP ersetzt wird. Das wiederum hat zur Folge, dass RF2
entfernt wird. Nun wird das GTP zu GDP hydrolysiert und RF3 ist wieder
einsatzfähig.

-) Was passiert, wenn was schief geht?

Während der Translation kann es
zu vorzeitiger Translation,
Transkription, zu mRNA Schaden,
Frameshifting, ein Überlesen des
Stop Codons oder zu einem
vorzeitigem Ribosomenstopp
kommen. Ohne lesbares Codon, ist
die A Seite des stillgestandenen
Ribosoms leer. Dies wird von einer
mit einem Ala beladenen tmRNA
erkannt, eine Kombination aus
tRNA und mRNA. Das Gen,
welches die tmRNA codiert, heißt
ssrA. Die 4 Pseudoknoten helfen
beim Einlesen des ORF der tmRNA.
SmpB ist ein Proteinfaktor, der die
Bindung von der tmRNA ans
Ribosom stimuliert. Die Protease ClpXP erkennt zur Degration die As des
translatierten ORF. Ebenso werden von der tmRNA RNases rekrutiert.
In E. coli ist die tmRNA nicht unbedingt erforderlich aufgrund deren
Alternative Rescue Faktoren ArfA/B, die die leere A Seite erkennen. ArfA
immitiert ein Stop Codon an der A Seite und rekrutiert so RF2. Dieser Weg
benötigt keine Degration des Proteins und der mRNA. ArfB ist ein separater
Weg und kommt als größeres Protein ohne RF2 aus. Die RrfA mRNA selbst
hat ein Hairpin mit einer RNase III Schneidestelle. Dieser fehlt so ein Stopp
Codon. Ist genug tmRNA vorhanden, wird daher die mRNA wie das Peptid
abgebaut. Da immer eine gewisse Menge ArfA in der Zelle ist, ist es ihr
möglich bei keiner tmRNA, das verkürzte aber aktive 58 As lange ArfA zu
retten, indem es das Peptid vom Ribosom entkoppelt. Das führt zu einem
positiven Feedbackloop. Schneidet die RNase III die mRNA nicht, imitiert die
letzte translatierte hydrophobe Peptidkette ein SsrA-Tag, und es kommt so
zur Degration durch ClpPX.

REGULATION OF GENE EXPRESSION IN EUKARYOTES

mRNA FEATURES THAT GOVERN STABILITY:
• Ribosome Binding and Translation
Je mehr Ribosome an der mRNA binden, desto besser ist sie vor der RNaseE
geschützt. Die RNA Polymerase transkripiert etwa 40-80nt pro Sekunde, ein
Ribosom um die 20 As pro Sekunde (~ 60nt). Die Bindungsstärke der SD
Sequenz ist ein Zeichen für die Bindungsanzahl an Ribosomen. Die T7 RNA
Polymerase hat eine viel höhere Umsatzgeschwindigkeit und erlaubt so eine
schnellere mRNA Degration zu simulieren.
• Intramolecular Base Pairing
Eine ompA mRNA mit 5' Hairpin hat eine Halbwertszeit von etwa 15min.
Werden am 5' Ende ss Nt hinzugefügt verkürzt sich die Halbwertszeit auf
6min, die RNaseE (an MonoP, und AUU-reiche Sequenzen) kann so viel
leichter zugreifen. Hairpins am 3' Ende verhindern ein trimmen von
Exonukleasen wie der PNPase. In vitro kann beobachtet werden das die
PNPase das 3' Ende trimmt bis es ein Hairpin erreicht.
• sRNA Binding
Kleine RNAs können Degration entweder initiieren oder verhindern.

-) Chemische und funktionelle Halbwertszeit:

Die chemische Halbwertszeit ist einfach zu definieren: es sind nur noch 50%
der mRNA vorhanden.
-) RNases:
Endoribonukleasen, wie RNase E, III und P spalten innerhalb der mRNA oder
anderer
Transkripte (tRNA, 16S rRNA, 23S rRNA etc).

-) E. coli polynucleotide phosphorylase (PNPase):

Die PNPase, eine Exoribonuklease, baut (genauso wie die Oligoribonuklease)
mRNAs vom 3’ zum 5’ Ende ab.

E. coli
Poly(A) ----
----
-) Polymerase I (PAPI):
Ein Trick, wie Transkripte von Bakterien mit einer 3’-seitigen
Sekundär-struktur trotzdem. abgebaut werden können ist
die Verwendung der PAPI, welche Poly-A-Schwänze ans 3’-
Ende anhängt (wirken in Eukaryoten stabilisierned, aber in
Bakterien destabilisierend). Ohne dem Poly-A Schwanz kann
das Degradosom nicht binden (und die PNPase nicht aktiv
werden).

TRANSKRIPTION IN EUKARYOTEN:
- RNA Polymerase I synthetisiert rRNAs im Nukleolus, RNA Polymerase II
mRNAs im Nukleoplasma und RNA Polymerase III sRNAs im Nukleoplasma.
-) Processing of the pre-mRNA:
Vor der Entfernung der Introns wird diese so genannte prämRNA
modifiziert. Am 5'-Ende wird eine so genannte CAPStruktur angebracht,
einen Poly-A(200) Anhang am 3'-Ende. Diese Modifikationen
fürTranslation der mRNA essentiell. Der Vorgang, bei dem die Introns
aus der prä-mRNA entfernt und die Exons zusammengefügt werden,
wird als Spleißen (splicing) bezeichnet und durch einen Komplex
(Spliceosom) durchgeführt, der aus Proteinen und RNAs (hnRNAs,
snRNAs) besteht. Durch Kernpore (NPC) erfolgt der Transport ins
Cytoplasma.
-) Splicing:
Beinah alle Introns folgen der GU-AG (oder GT-AG) Regel. Sie gibt die
beiden ersten und letzten Basen an. Fünf katalytisch aktive snRNAs
sind im Splicing (Ribozym) involviert. Das Spliceosom ist ein RNA-
Proteinkomplex (snRNPs) von 12MDa, wobei die sRNAs unter 1/3 der
Masse ausmachen.
Im Intron findet sich eine so genannte Branch Site, die ein A enthält.
Das OH dieser AS führt einen nucleophilen Angriff auf die
Phosphoesterbindung der 5' Site durch. Es entsteht die Lariatstruktur
und ein freies OH an der 5' Site. Dieses freie OH der 5' site führt einen
dirigierten nucleophilen Angriff auf die 3' Site des Introns durch, wodurch
das Lariat freigesetzt und die beiden Exons miteinander verknüpft
werden. Das freigesetzte Lariat wird für den Abbau wieder in lineare Form
überführt. Lariat ist mittels Gelelektrophorese gut nachzuweisen.
Spleißen ist kein enzymatischer, sondern ein autokatalytischer
Vorgang, das Spliceosom bringt die miteinander interagierenden Teile in
räumliche Nähe, damit die Aktion ablaufen kann. Der Vorgang wird durch
RNAs vermittelt, die durch gebundene Proteine korrekt positioniert
werden. hnRNAs müssen aus dem Zellkern exportiert werden, im Cytosol
binden sie an die benötigten Proteine und werden anschließend wieder in
den Nucleus importiert. snRNAs des Spliceosoms müssen für Faltung ins
Cytoplasma transportiert werden. Für diesen Transport werden zahlreiche
Exportproteine benötigt. Im Cytoplasma werden die snRNAs freigesetzt,
die Faltung wird durch hfq ähnliche SM Proteine und RNasen
durchgeführt. Durch Importproteine werden die gefalteten snRNAs zurück
in den Nucleus transportiert.
-) snRNAs are required for splicing:
(1) U1 bindet an 5' Splicestelle, U2AF (Auxilary factor) bindet an Pyrimidin
(2) U2 bindet mittels ATP-Hydrolyse an die Branch site
(3) U5/U4/U6 Trimer bindet das Exon an der 5' Site über
U5 und U2 über U6.
(4) U1 wird freigesetzt, U5 rutscht vom Exon zum Intron,
U6 bindet an 5' Site
(5) Durch ATP Hydrolyse wird U4 freigesetzt. Das
verhindert eine Interaktion von U6 mit U4 (da U6
Bindungsstelle schon von U4 besetzt bzw blockiert)
Paarung von U6 mit U2
- U6/U2 katalysieren Transesterifizierung
- U5 bindet Exon an 5' Splicestelle
- 5' Site wird geschnitten ... es bildet sich Lariat
(6) U2/U5/U6 an Lariat gebunden 3' Site wird geschnitten
und Exons ligiert.
(7) gespleißte RNA wird freigesetzt und Lariat linearisiert
(und abgebaut).

-) Group I and group II structure Introns: Organelles and

bacteria fold into a typical secondary structure
Es gibt drei Splicereaktionen:
a) Group I Introns ... autokatalytisch, in Organellen und Bakterien
b) Group II Introns ... autokatalytisch, in Organellen und Bakterien
c) nukleares Splicing ... benötigt Spliceosom für Splicen (snRNPs)
-) Group I Introns: self splicing
Die Exons befinden sich weit auseinander, Introns sind relativ linear und
zirkularisieren, sie bilden kein Lariat.
• 3' OH Ende eines freien G greift 5' Ende des Introns an
• 3' OH Ende von Exon 1 greift 5' Ende von Exon 2 an
• 3' Ende von Intron greift 5' von Intron an
-) Group II Introns: self splicing
Sie weisen eine spezielle Sekundärstruktur auf, Exons befinden sich dadurch
räumlich näher beieinander. Sie spleißen ausschließlich autokatalytisch, es
wird ein Lariat gebildet.
• OH Gruppe eines freien A attackiert Phosphodiesterbindung zwischen
Exon 1 und Intron.
• 3' OH greift Bindung zwischen Intron und Exon 2 an.
-) Der Exon Junction Complex (EJC):
lagert sich zuerst während dem Splicing an und
wird mit ins Cytoplasma transportiert. Der EJC
besteht aus verschiedenen Proteinkomponenten
(wie RNPS, Y14, SRm160, Aly/REF, Magoh), die als
Anknüpfungsort für weitere Proteine fungieren.
Er agiert als Positionsmarker des Splicings,
beeinflußt den Transport und legt den weiteren
Weg der mRNA fest, sowie stimuliert die
Initiation der Translation. Es leitet sogar die
Degration der mRNA ein. Eine recht gut bekannte
Funktion des EJC ist seine Rolle im Nonsense-
mediated mRNA Decay.

TRANSLATION IN EUKARYOTEN
startet generell am 5' Cap. Eine besondere
Form der Initiation der Tranlation wird durch
IRES (Internal-Ribosom- Entry-Site)
ausgelöst. Besonders Viren benützen die an
eine lmRNA erinnernde Sequenz. Proteine
die an die RNA Signatur am 3' Ende binden,
bestimmen den Transportort für die
Translation. Die Interaktion der PolyA-
Bindeproteine (PABP) mit dem Translation-
Initiationskomplex markieren die Intaktheit
der mRNA. IF2 als hochkonserviertes Protein
ist in Eubakterien, Eukaryoten als auch in
Archea vorhanden.

-) Ribosomal recruitment to mRNA in Eukaryotes

Kozak Sequenz: Die Kozak Sequenz (nach ihrer Entdeckerin) in Eukaryoten
ist ähnlich der Shine-Dalgarno-Sequenz in Prokaryoten. Vielen
eukaryotischen mRNA fehlt diese Sequenz, aber wenn sie vorhanden ist,
erhöht sich die Effizienz der Translation. Ein zweites Merkmal, das zu einer
effizienten Translation beiträgt, ist das Vorhandensein eines Poly-A-
Schwanz am 3'-Ende der mRNA.
-) Eukaryotische translationelle Initiationsfaktoren:
In Eukaryoten gibt es deutlich mehr IF als in Bakterien, mit den
unterschiedlichsten Funktionen (zB. zur Erkennung des AUG [eIF1], Bindung
von Met-tRNAMet [eIF2], Erkennung der Cap Struktur [eIF4F] etc.). Die
große Anzahl an Faktoren ermöglicht natürlich mehr Regulation. Die
Funktion der einzelnen eIFs wurde durch Toeprinting nachgewiesen.

-) Mechanismen der Initiation bei Eukaryoten

1) Scanning:
Ribosom bindet an das 5’-Ende (Cap) und scannt so lange, bis AUG +
Konsensus- Sequenz gefunden wird.
2) Reinitiation/Leaky scanning:
Ribosom kann auch im Strang anstatt am 5’-Ende binden und von dort
scannen, oder nach dem Stopp-Codon einfach wieder zu scannen beginnen.
Dies passiert vor allem bei Viren (polycistronische mRNA Stücke).
3) Interne translationale Initiation:
Viele Viren haben eine Protease, die eIF4G spaltet (verhindert
translationale Initiation). Viren selbst haben keine CAP Struktur, sondern
nur einen Phosphatrest und eine interne ribosomale Eintrittstelle (IRES).
Diese IRES haben komplexe Sekundärstrukturen, die von Proteinen (IF) und
infolge dessen auch vom Ribosom gebunden werden können.

-) Translations-Initiation in Eukaryoten: →
Die Rekrutierung des Ribosoms an die mRNA geschieht bei Eukaryoten nicht
wie bei Prokaryoten durch RNA-RNA Wechselwirkungen (16S rRNA mit SD
Sequenz), sondern durch Protein-Protein Interaktionen (43S rRNA-Protein-
Komplex und 4G/A/B/E-Protein- Komplex an der Cap-Struktur der mRNA)!

-) Modulation der Translation– mTOR stimuliert die eIF3-eIF4G Interaktion

Die eIF4E Level werden in der Zelle durch den mTor/Rapor/ LST8-GbL
Komplex streng kontrolliert, der durch Nährstoffe, Hormone,
Wachstumsfaktoren aktiviert wird. Dadurch das mTor den IF 4E-
Bindeprotein (4E-BP) und die Serin-6-Kinase (S6K) phosphoryliert, löst sich
das Bindeprotein von eIF4E und die Kinase von eIF3. Das RNA-Bindeprotein
eIF4B wird phosphoryliert, assoziert mit eIF3 und die eIF3-eIF4G Interaktion
kommt zustande. Wird die Kaskade blockiert, ist immer noch die
Translation mittels IRES möglich.
Die Cap-unabhängige (IRES) Initiation wird durch ITAFs und eIG4GI, an dem
PABP binden ermöglicht. Manche Wachstumsfaktoren, Onkogene wie c-
myc, einige Apoptosefaktoren werden nur mittels IRES translatiert.

-) Viruses can reprogram the translation machinery IRES (Internal ribosom

entry site) Initiation:
Wurde ursprünglich bei Viren entdeckt (Picornavirus). Durch virale
Proteasen 2A wird der eukaryotische Translationsfaktor eIF4G gespalten, es
kann keine CAP abhängige Translation mehr stattfinden. Die viruseigene
mRNA ist von CAP unabhängig und initiiert Translation an einer IRES
(Internal ribosom entry site). IRES sind Sekundärstrukturen in der 5' NCR
(Non coding region, am 5' Ende der mRNA) von Picornaviren, das Ribosom
kann an dieser Sekundärstruktur andocken.
Virale Regulation: Viren können auf verschiedensten Wegen die
eukaryotische Translation beeinflussen:
- Initiation:
- Kinasen (eIF2 phosphoryliert → Translation stoppt)
- Dephosphorilierung anderer IF (eIF4E, eIF4E BP)
- Proteasen (Spaltung von eIF4G)
- IRES Regulation
- Scanning:
- IRES
- Ribosome shunting (Strukturen, die dazu führen, dass das Ribosom an
diesen Stellen bindet und anfängt zu translatieren)
- Leaky scanning (AUG überspringen)
- Elongation/Termination:
- Frame-Shifting (AUG nichtmehr gelesen)
- Recoding (anderes Start- oder Stopp-Codon wird benutzt)
- Reinitiation
-) Beim Ribosom-Shunting:
wird die Sekundärstruktur der 5' utr beim Einlesen
vom Ribosom überbrückt. Virale Proteine können dies
auslösen, indem sie die Sekundärstruktur fester
binden, dass es so dem Ribosom unmöglich ist die
Struktur zu öffnen.

-) Translationale Kontrolle durch das Iron Responsive

Protein (IRP):
Da zu hohe Eisenkonzentrationen toxisch sind, wird
die Translation des Eisen Speicherstoffes Ferritin (Leber,
Milz, Knochenmark) streng kontrolliert. Ist Eisen rar
bindet IRP an die 5' Sekundärstruktur Iron-Responsive-
Element (IRE). Die Ferritin Synthese wird so inhibiert. Die
mRNA des Transferrinrezeptors enthält 5 IREs an der 3'
utr. Binden IRPs daran kommt es zur Rezeptorensynthese
für den Eisentransporter Transferrin.
Ist Eisen reichlich vorhanden, formt IRP einen Eisen-
Schwefel Cluster. Die Ferritin 5' utr ist nicht blockiert, die
Translation findet statt. Da die IREs der Transferrin
mRNA frei vorliegen, wird die mRNA degradiert.

-) Die homologen Elongationsfaktoren eIF5A in Eukaryoten und EF-P in

Bakterien (s.20 bei anderen pdf)
-) RNA Stabilität und deren Abbau (s.20 bei anderen pdf)
Eine Exonuklease kann mRNA nur in 5’→3’ Richtung abbauen, wenn
die CAP Struktur entfernt wird. Dafür gibt es 2 Enzyme: Dcp1 und
Dcp2 (entfernen Methylgruppe und Guanysyl Rest); diese werden
wiederum vom Lsm Proteinkomplex zur Cap-Struktur gebracht,
jedoch erst, nachdem der Poly-A-Schwanz abgebaut wurde, der
Crosstalk zwischen 5’- und 3’-Ende ist daher sehr wichtig. Zusätzlich
kommt es dann noch durch die Ski-Proteine zum Abbau vom 3’-Ende
her.
-) Nonsense-Mediated Decay (NMD) bei vorzeitigem Stoppcodon
Wenn kurzeitig nach dem Start-Codon ein Stopp-Codon auftritt, wird
diese DNA abgebaut.
- Exon-Intron Junctions sind hoch konserviert und werden durch
Proteine und RNAs erkannt. Nach dem Splicing im Kern bleiben einige
dieser Proteine beim Transport ins Cytoplasma erhalten.
- Wird die mRNA durch die Kernpore transportiert, bindet der Faktor
hUpf2 daran.
- Bindet jetzt das Ribosom und läuft über die RNA (Normalfall),
werden diese Proteine heruntergeschmissen.
- Tritt jedoch ein vorzeitiges Stopp-Codon auf, werden die
verbleibenden Splicing Faktoren von hUpf1 erkannt und es kommt
zur Phosphorylierung und zum De-Capping.

-) Der Ablauf ist in allen Eukaryoten vorhanden, es gibt nur

minimale Unterschiede:
- Hefe: ein down-stream Element wird erkannt und weniger Proteine
sind involviert. Es kommt wie bei Säugetieren zum 5’3’ Abbau.
- Drosophila/Pflanzen: Es wird ein Schnitt am NMD (nonsense
mediated decay Komplex) gemacht. Ein Exosom wandert in 3‟ → 5‟
Richtung und Xrn1 (5„ 3„ Exonuklease) in die andere Richtung
(es entstehen ja 2 RNAs).
-) Der Non-Stop Decay (NSD) & No-Go Decay (NGD)
NSD: kommt ganz ohne Stoppcodon aus. Das Ribosom translatiert
bis zum 3' Ende. Es entfernt dabei die PABPs. Bindung von Ski7
rekrutiert Exosome. Weitere Ribosomenbindung ist durch Fehlen der
PABPs nicht möglich.
NGD: Starke utr Sequenz oder mRNA stabilisierende Proteine
verunmöglichen eine weitere Translation. Das stehende
Ribosom löst eine endonukleasische Spaltung aus.
-) Micro RNA und Small Interfering RNA Silencing:
(S.22 pdf anderes)

What is the Difference between miRNA and siRNA?

Sowohl siRNA, als auch miRNA (microRNA) haben die
Funktion, die Expression zu regulieren, sie kommen jedoch
aus unterschiedlichen Quellen.
- siRNA kommt von dsRNA, ist meist eine Antwort auf
Fremd-RNA (normalerweise virale) und meist 100%
komplimentär zum Target.
- miRNA wird im Kern gemacht (ssRNA) und hat immer eine Hairpin
Struktur. miRNAs regulieren oft verschiedene mRNAs und sind
deshalb nicht 100% komplimentär zum Target.
siRNA ähnelt cis-acting RNA, miRNA trans-acting RNA
Veränderungen von miRNA und Wirkung auf mRNA:
a) Deletion: keine miRNA mehr → mRNA Überexpression
b) Deletion + Promoter Hypermethylierung → mRNA Überexpression
c) Deletion + Mutation → mRNA Überexpresssion
d) Amplifizierung → mRNA runterreguliert
e) Translokation: miRNA wird an anderer Stelle im Chromosom
exprimiert und hat deshalb auf anderer Gene Effekte → andere
mRNA wird runterreguliert