LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA

II PERCOBAAN II
KROTOMOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF (KLTP)

DI SUSUN OLEH:
KELOMPOK 4 /
BATCH B
Nama :Musdalifa (F202101053)
Riska (F202101054)

Hilda Wahyuningsih (F202101217)

ArzitaJunianti (F202101218)

Annisa Indah Mawadda (F202101052)

Alika Rizkiana Iskandar (F202101097)
Nila Wahyuni (F202101098)

Vera Sarmila (F202101229)

Aksal Eming Widiarta (F202303001)

Dwi Farhana (F202101219)

Kelas :F1

Koordinator Lab :Wa Ode Ida Fitriah, S.Farm., M.Si

Asisten Lab :Eki Asrina
PROGRAM STUDI S1 FARMASI
FAKULTAS SAINS DAN
TEKNOLOGI UNIVERSITAS
MANDALA WALUYA
KENDARI 2023
I. Tujuan Percobaan

1. Mengetahui prinsip Krotomografi lapis tipis preparatif

2. Memperoleh isolat senyawa dari isolate

II. Tinjaun Pustaka

Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) adalah salah satu metode yang memerlukan
pembiayaan paling murah dan memakai peralatan paling dasar. Walaupun KLTP dapat
memisahkan bahan dalam jumlahgram, sebagian besar pemakainya hanya dalam jumlah
miligram.KLTPbersama-sama dengan kromatografi kolom terbuka, masih dijumpaidalam
sebagian besar publikasi mengenai isolasi bahanalam (Hostettmann, 2006)

Seperti halnya KLT secara umum, KLT Preparatif juga melibatkanfase diam dan fase
gerak. Dimana fase diamnya adalah sebuah platdengan ukuran ketebalan bervariasi. Untuk
jumlah sampel 10-100 mg,dapat dipisahkan dengan mengunakan KLT Preparatif dengan
adsorbensilika gel atau aluminium oksida, dengan ukuran 20x20 cm dan tebal 1mm, jika
tebalnya di dua kalikan, maka banyaknya sampel yang dapatdipisahkan bertambah 50%,
seperti halnya KLT biasa, adsorben yangpaling umum digunakan pada KLT Preparatif adalah
silika gel (Rohman,2007)

Ketebalan penjerap (adsorben) yang paling sering dipakai padaKLTP adalah sekitar 0,5-2

mm. Ukuran pelat kromatografi biasanya 20 x20 cm atau 20 x 40 cm. Pembatasan ketebalan
lapisan dan ukuran pelatsudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan
KLTP. Penjerap yang paling umum digunakan ialah silika gel dan dipakaiuntuk pemisahan
campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawahdrofil (Hostettmann, 2006)

Salah satu metode praktis yang dapat digunakan untuk pemisahan dan pemurnian senyawa
aktif yakni kromatografi lapis tipis (KLT)/thin layer chromatography (TLC). Cai (2018)
menyatakan bahwa KLT merupakan sebuah teknik cepat, sensitif, dan murah yang digunakan
untuk menentukan jumlah komponen dalam campuran, memverifikasi identitas dan
kemurnian senyawa, memantau kemajuan reaksi, menentukan komposisi pelarut untuk
pemisahan preparatif dan menganalisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom (Kartini
et al. 2021), juga menambahkan bahwa kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan salah satu
teknik analisis yang
telah umum digunakan baik untuk analisis secara kualitatif maupun kuantitatif, bahkan untuk
pengujian aktivitas biologis bila dikombinasikan dengan bioautografi. tipis/thin layer
chromatography dan lebih lanjut analisis aktivitas farmakologis yakni inhibisi terhadap enzim
a- glukosidase. (Afinda Novi Krintanti dkk. 2008)

Pemisahan komponen kimia dengan metode kromatografi lapis tipis preparatif pada
dasarnya sama dengan kromatografi lapis tipis biasa yaitu prinsip adsorbsi dan partisi.
Perbedaan yang nyata adalah pada KLT preparatif menggunakan lempeng yang besar (20x20
cm) dan juga penotolannya berupa garis pada salah satu sisi lempeng. Kromatografi lapis tipis
preparatif (KLTP) adalah salah satu metode yang memerlukan pembiayaan paling murah dan
memakai peralatan paling dasar. Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan dalam jumlah
gram, sebagian besar pemakaiannya hanya dalam jumlah milligram. (Afinda Novi Krintanti
dkk. 2008)

Ketebalan penyerap (adsorben) yang paling sering dipakai pada KLTP adalah sekitar 0,5-
2 mm. Ukuran pelat kromatografi biasanya 20x20 cm atau 20x40 cm. Pembatasan ketebalan
lapisan dan ukuran pelat sudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan
KLTP. Penyerap yang paling umum digunakan ialah silika gel dan dipakai untuk pemisahan
campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil. Cuplikan pada KLTP
dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada pelat KLTP. Pelarut yang baik
adalah pelarut atsiri (heksana, diklorometana, etil asetat), karena jika pelarut kurang atsiri
akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5%-10%. Cuplikan yang
ditotolkan berupa pita yang harus sesempit mungkin karena pemisahan tergantung pada lebar
pita. Seperti halnya KLT secara umum, KLT Preparatif juga melibatkan fase diam dan fase
gerak. (Afinda Novi Krintanti dkk. 2008)

Di mana fase diamnya adalah sebuah plat dengan ukuran ketebalan bervariasi. Untuk
jumlah sampel 10-100 mg, dapat dipisahkan dengan mengunakan KLT Preparatif dengan
adsorben silika gel atau aluminium oksida, dengan ukuran 20x20 cm dan tebal 1 mm, jika
tebalnya di dua kalikan, maka banyaknya sampel yang dapat dipisahkan bertambah 50%,
seperti halnya KLT biasa, adsorben yang paling umum digunakan pada KLT Preparatif adalah
silica gel. Sebelum ditotolkan pada plat KLT Preparatif, sampel dilarutkan terlebih dahulu
dengan sedikit pelarut. Pelarut yang baik adalah pelarut yang mudah menguap, misalnya n-
heksana, diklorometana atau etil asetat. Karena jika pelarut yang digunakan tidak mudah
menguap, maka akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi sampel juga sebaiknya hanya 5%-
10%. Sampel yang
ditotolkan harus berbentuk pita yang sesempit mungkin karena baik tidaknya pemisahan juga
bergantung pada lebarnya pita.

Setelah plat KLT Preparatif dielusi, pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari
plat. Selanjutnya senyawa harus diekstraksi dari adsorben dengan pelarut yang sesuai (5 ml
pelarut untuk 1 gram adsorben). Diupayakan untuk menggunakan pelarut yang paling
nonpolar. Harus diperhatikan bahwa makin lama senyawa kontak dengan adsorben, maka
makin besar kemungkinan senyawa tersebut mengalami peruraian. Selanjutnya ekstrak yang
diperoleh disaring menggunakan corong berkaca masir atau menggunakan membran.Proses
isolasi kromatografi lapis tipis preparatif terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya
partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti
kepolaran eluen, karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka
komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan
pemisahan. (Afinda,dkk 2008)

Adsorben yang paling banyak digunakan dalam kromatografi lapis tipis adalah silika gel
dan aluminium oksida. Silika gel umumnya mengandung zat tambahan kalsium sulfat untuk
mempertinggi daya lekatnya. Zat ini digunakan sebagai adsorben universal untuk
kromatografi senyawa netral, asam dan basa. Aluminum oksida mempunyai kemampuan
koordinasi, oleh karena itu sesuai untuk pemisahan senyawa yang mengandung gugus fungsi
yang berbeda. Aluminium oksida mengandung ion alkali, dengan demikian bereaksi sebagai
basa dalam suspensi air. Di samping kedua adsorben yang sangat aktif ini dalam hal tertentu
dapat digunakan "kieselgur" yang kurang aktif sebagai lapis adsorpsi. (Munson.2010)

Pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat
menampung beberapa plat. Keefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara
pengembangan berulang. Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak dengan
penyerap maka semakin besar kemungkinan penguraian. (Hostettman,2006)
III. Metode Kerja

III.1 Alat dan Bahan

III.1.1 Alat yang di gunakan:
1) Lempeng kaca 20x20 cm
2) Batang pengaduk
3) Erlenmeyer
III.1.2 Bahan yang digunakan
1) Silika (halus)
2) Aquades
III.2 Prosedur Kerja
III.2.1 Pembuatan lempeng preparatif
1) Sejumlah 5 gram silika dilarutkan dengan 20mL aquades dalam erlenmeyer
2) Silika dihomogenkan hingga berbentuk bubur silika
3) Bubur silika dituangkan pada pelat kaca 20x20 cm
4) Silika diratakan pada pelat kaca hingga homogen
5) Pelat KLTP dikeringkan dan diaktifkan dalam oven pada suhu
90oC selama 30 menit

III.2.2 Prosedur Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

1) Membuat garis tepi atas dan tepi bawah pada KLT dengan
menggunakan pensil
2) Menotolkan ekstrak atau fraksi yang akan dipisahkan kegaris tepi bawah
3) KLTP dielusi dengan eluen yang sesuai pada chamber
4) KLTP yang telah dielusi diamati pada penampak noda yang sesuai
5) Noda dalam bentuk pita yang akan dipisahkan dikerok, dipisahkan
dengan KLTP
6) Dipisahkan dengan isi isolat dengan silika
IV. Hasil Pengamatan
1. Tabel Hasil
No Gambar Keterangan

1 Gambar alat KLT Preparatif

1. Tutup chamber
2. Kertas
3. Bagian depan pelarut
4. Pelarut

2 Gambar 2. Profil hasil KLTP [fasa diam Di dapatkan hasil berwarna Ungu
silika gelGF254, fasa gerak isopropanol-
larutan amonia-air (20:1:1 v/v)], (1) standar
trans-zeatin (2) fraksi 7,penampak noda
sinar ultraviolet.

3 Gambar.3 Penyemprotan Pereaksi Di dapatkan hasil berwarna hijau

V. Pembahasan
Kromatografi lapis tipis termasuk jenis kromatografi padat-cair yang banyak digunakan
untuk proses pemisahan karena menggunakan peralatan yang sederhana sehingga tidak
membutuhkan biaya yang tinggi, selain itu hanya membutuhkan waktu yang relatif singkat
untuk analisis. Kromatografi lapis tipis juga dapat digunakan untuk memisahkan banyak
senyawamungkin sampai mencapai 60 sampel per pelat sehingga sampai saat ini masih
terus digunakan sebagai teknik pemisahan (Scott 2008).

Selama proses aktivasi plat, dilakukan penjenuhan chamber menggunakan fase gerak.
Penjenuhan chamber bertujuan untuk menyamaratakan tekanan uap dari fase gerak yang
digunakan sehingga pemisahan dapat berjalan dengan baik (Dewi 2018)
Chamber yang berisi eluen dijenuhkan dan ditutup dengan tujuan agar pelarut yang
digunakan tidak menguap, karena hal itu nantinya dpat mempengaruhi proses pemisahan.
(Rizky Triadi, 2021).

Di saring kertas saring penyaringan bertujuan untuk menyaring kemungkinan adanya

partikel-partikel kecil yang ikut terbawa sehingga dapat mempengaruhi proses pemisahan.
(Annisa primadianti,dkk 2018)

Penyaringan larutan sampel juga merupakan tahapan penting pada preparasi sampel.
Penyaringan dapat memperbaiki kromatogram yang dihasilkan dan mempermudah
penotolan sampel karena dapat memisahkan analit dari partikel-partikel yang ada dalam
larutan sampel. Adanya partikel dalam larutan sampel dapat menyebabkan munculnya
pengotor pada kromatogram yang dihasilkan terutama bila partikel tersebut larut dalam fase
gerak dan terdeteksi oleh detektor yang digunakan. (Lestyo Wulandari, S.Si, Apt,
M.Farm.2011)

Terjadinya perbedaan pemisahan komponen senyawa aktif di sebabkan oleh prinsip Like-
dissolve-Like, senyawa yang bersifat polar akan larut dalam pelarut yang polar, senyawa
yang bersifat non-polar dan sebagian besar senyawa yang bersifat polar dan non-polar
memiliki kemampuan untuk larut dalam pelarut yang bersifat semi-polar seperti etil asetat.
(Hartoyo Notonegoro.2022)

Prinsip pemisahan dalam KLT Preparatif didasarkan atas perbedaan daya serap dan daya
partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti
kepolaran eluen atau fase gerak oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia
tidak sama, maka komponen kimia akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga
hal inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan (Gede Sughiarta Giri, 2020).
 Adapun Kelebihan dan kekurangan KLTP yaitu (1) biaya yang digunakann murah dan
memakai peralatan paling dasar, (2) ketetapan penuntun kadar akan lebih baik karena
komponen yang akan di tentukan merupakan bercak yang tidak bergerak (3) preparasi
sampel yang mudah, (4) dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid hidrokarbon),
dan (5) dapat di lakukan elusi secara mekanik,menurun atau dengan cara elusi dua dimensi.
(Dwi Monika Ningrum,M.Farm.dkk.2019).

Kekurangan KLTP yaitu: (1) adanya kemungkinan senyawa yang diambil dari plat
adalah senyawa beracun, dan (2) Waktu yang diperlukan dalam proses pemisahan cukup
panjang (Dwi Monika Ningrum, M.Farm.dkk.2019)

Berdasarkan penelitian yang di kutip dari jurnal “Alga Merah (Gracilaria coronpifolia)
sebagai Sumber Fitohormon Sitokinin yang Potensial, Kromatografi lapis tipis preparatif
di dapatkan hasil pada Gambar 2 menunjukkan bahwa pada plat KLTP tedapat noda yang
berwarna ungu apabila dilihat pada lampu ultraviolet dengan panjang gelombang 254 nm.

Sedangkan pada gambar 3 Pemurnian pada teknik kromatografi lapis tipis preparatif
dilakukan pada fraksi 6 menggunakan eluen n-Heksan : etil asetat (6:4). Hasil kromatografi
lapis tipis preparatif, diperoleh 2 pita. Pita 1 dan 2 dikerok dan dilarutkan dengan etil asetat
lalu dilakukan pemisahan isolat dari gel silika menggunakan teknik sentrifugasi. Isolat 1
dan
2 dilakukan pengujian dengan menggunakan pereaksi penampak bercak Lieberman-
Burchard. Isolat pita 2 di KLTP kembali menggunakan eluen n-Heksan : etil asetat (6:4)
diperoleh isolat pita 2a dan pita 2b, selanjutnya dilakukan pengujian menggunakan pereaksi
penampak bercak Lieberman-Burchard. Dari hasil pengujian, isolat pita 2b positif
mengandung steroid yang ditandai dengan penampakan noda berwarna hijau pada plat KLT
dengan nilai Rf 0,50. (Fadillah Maryam,dkk.2020)
 DAFTAR PUSTAKA

Afinda Novi Krintanti dkk. 2008. Buku Ajar Fitokimia. Universitas Airlangga.

Dwi Monika Ningrum, M.Farm.dkk.2019.Buku Ajar Kimia Farmasi.Editor: Hardani M.Si.

Dewi dkk.2018.Pemisahan, Isolasi, dan Identifikasi Senyawa Saponin dari Herbal Pegagan
(Centella asiatica L Urban). Jurnal Farmasi Udayana.Vol 7.No 2, hal 68-74

Fadillah Maryam, dkk. 2020. Isolasi Dan Karakterisasi Senyawa Steroid dari Ekstrak Biji
Mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.). Jurnal Fitofarmaka Indonesia, Vol.7, No.2, hal.
6- 11.
Gede Sugiharta Giri. 2020. Identifikasi penetapan kadar senyawa kuinin fraksi etil asetat kulit
batang kina (Chincona succirubra Pav.Ex klotzch) secara KLT-DENSITROMETRI.
BIMFI, Vol. 7, No. 2, hal. 9.
Hostettmann. M, Marston. A. 2006. Cara Kromatografi Preparatif. ITB; Bandung.

Hartoyo Notonegoro,dkk.2022. Fraksinasi Flavanoid Spirulina platensis dengan metode

Krotomografi Lapis Tipis dan Aktivitas Inhibisi Enzim a-Glukosidase. Jurusan
Manajemen Sumberdaya Perairan,Fakultas Pertanian,Perikanan dan Biologi, Universitas
Bangka Belitung

Kartini, K., Wulandari, W.A, Jayani, N.I.E.& Setiawan, F. (2021). TLC-Based fingerprinting
for Phyllanthus niruri from diverse geographical origins in East and Central Java
Indonesia. ΙΟΡ Conference Series: Earth and Environmental Science, 948, 1-8.

Lestyo Wulandari, S.Si, Apt, M.Farm.2011. Krotomografi Lapis Lipis. Fakultas Farmasi
Universitas Jember
Meydia, Suwandi, R. dan Suptijah, P.2016. Isolasi Senyawa Steroid dari Teripang Gama
dengan Berbagai Jenis Pelarut.

Munson, James, W. 2010. Analisis Farmasi. Airlangga Universitas Press;

Surabaya.
Rohman, Abdul. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar; Jakarta.

Rizki Triadi, Rudiyansyah, Andi Hairil Alimuddin,2021. (Characterization Of Triterpenoid

Structure From Lean Plant (Lansium Domesticum). Indonesian Journal Of Pure And
Applied Chemistry. Indo. J. Pure App. Chem. 4 (1), Pp. 40-50, 2021.

Saadah Diana R, dkk. 2017. Alga Merah (Gracilaria coronopifolia) sebagai Sumber
Fitohormon Sitokinin yang Potensial. Chemical et Natura Acta, Vol.5 No.3, hal.124-
131.

Scott, R.P.W. (2008). Thin Layer Chromatography. Library4Science. Letchworth Garden

City, UK.