ÍAnalytikU 781
NMR-Spektroskopie für die
quantitative Analyse
Die hohe Empfindlichkeit und die Homogenität von Hochfeld-NMR-Spektrometern
führen heute zu so präzisen Ergebnissen, dass sich die Spektren unter bestimmten
Randbedingungen quantitativ auswerten lassen.
G Mehrere Eigenschaften machen
die NMR-Spektroskopie interessant
für quantitative Anwendungen:
• Sie registriert Strukturunterschie-
de sehr empfindlich,
• sie arbeitet zerstörungsfrei,
• sie ist linear, so dass bei der Bestim-
mung von Stoffmengenverhältnis-
sen die Kalibrierung entfällt,
• sie erfüllt die Anforderungen einer
primären Relativmethode, welche
die Richtigkeit der Analysenergeb-
nisse gewährleistet,
• es lassen sich mehrere Komponen-
ten einer Mixtur in einem Spektrum
gleichzeitig quantifizieren, und
• die Probenpräparation ist einfach,
da die Analyten vor der Messung
nicht isoliert werden müssen.
Die wichtigste Beziehung für die
quantitative NMR-Spektroskopie
(qNMR) ist die direkte Proportiona-
lität zwischen der integralen Signal-
intensität IX (Fläche unter einem Re-
sonanzsignal) und der dazugehöri-
gen Zahl der Kerne NX des entspre-
chenden Signals (Gleichung 1):
IX kX NX
Für quantitative Analysen muss
die Spektrometerkonstante kX für alle
Resonanzlinien innerhalb eines
NMR-Spektrums identisch sein. Da-
mit diese Forderung erfüllt ist, sind
folgende Parameter zu beachten:1)
Die Pulswiederholzeit (Zeit zwi-
schen zwei zu akkumulierenden
Free Induction Decays, FIDs) muss
mindestens dem Fünffachen der Re-
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laxationszeit T1 für die zu quantifi-
zierenden NMR-Signale entspre-
chen. Paramagnetische Relaxations-
reagenzien wie Chrom(III)-acetyl-
acetonat [Cr(acac)3] bei Kernen mit
langen T1-Werten, z. B. 13C, 19F, ver-
kürzen die Relaxationszeiten – und
damit die Messzeit. Sie wirkt sich
nicht auf die integralen Signalintensi-
täten im Spektrum aus. Der FID als
Messsignal in der Zeitdomäne soll
nach der Hälfte der Aufnahmezeit Abb. 1. Messprinzip der ERETIC-Technik: Während der Aufnahme des
vollständig abgeklungen sein. Die Messsignals (pink) wird passend geformter FID (blau) des
Impulsanregung muss gleichförmig Standardsignals in die äußere Spule eingestrahlt.
über die gesamte Spektralbreite erfol- SG1, SG2: Signalgeneratoren, Dec.: Entkopplerspule.
gen. Der Kern-Overhauser-Effekt bei
heteronuklearen Experimenten ist
mit Entkopplung einer zweiten Kern- Problem Empfindlichkeit
art zur Spektrenvereinfachung (z. B.
13
C, 19F, 31P) nur während der Auf- G Neben den hohen Anschaffungs-
nahmezeit zu unterdrücken. kosten und den Betriebskosten ist die
Um präzise Resultate zu erhalten, im Vergleich zu anderen Techniken
ist noch Folgendes zu beachten: Ein geringe Empfindlichkeit ein Nachteil
auswertbares Signal muss ein Signal- der qNMR. So liegt die Nachweis-
zu-Rausch-Verhältnis (S/N) von
mindestens 250 aufweisen. Phasen- G QUERGELESEN
und Grundlinienfehler sind zu ver-
meiden. Gegebenenfalls sind die UU Quantitative NMR-Spektroskopie erreicht heute
NMR-Spektren manuell zu korrigie- Nachweisempfindlichkeiten bis 10–11 mol.
ren. Die Integrationsgrenzen sind UU Sie ist eine der wichtigsten Methoden für die
für alle zu bewertenden Signale als Quantifizierung von Isomeren, Diastereomeren
gleiche Vielfache der individuellen und Enantiomeren sowie für die Gehaltsbestim-
Linienbreiten (volle Breite in halber mung kleiner und mittlerer organischer Moleküle.
Höhe) zu setzen. Dabei sind die Sa- UU Anwendungsbereiche sind die pharmazeutische
telliten zu NMR-Signalen (z. B. Analytik, die Analyse von Metaboliten in Bioflüs-
13
durch C-Kopplung über eine sigkeiten sowie die Lebensmittel- und Naturstoff-
C-H-Bindung in 1H-Spektren) bei analytik. Mit Durchflussprobenköpfen lässt sich
der Integration für alle Signale die Methode auch im Prozess einsetzen.
gleich zu behandeln.
782 Blickpunkt Analytik|NMR-Spektroskopie
grenze (Limit of Detection, LOD) ei-
nes 14,1-T-NMR-Spektrometers für
die 1H-NMR bei 10–9 mol.2) Ein höhe-
res Magnetfeld, Cryo-Probenköpfe,
die Messspule und Vorverstärker auf
20 K kühlen, sowie Mikroliter- und
Nanoliter-Probenköpfe verbessern
die Sensitivität bis zu einem LOD von
10–11 mol. Trotzdem bleibt die qNMR
unempfindlicher als die IR-Spektro-
skopie (LOD von 10–12 bis 10–15 mol)
und die Massenspektrometrie (LOD
von 10–18 mol).3)
Quantitative NMR-Spektroskopie
 Aus einem Spektrum lässt sich di-
rekt das Stoffmengenverhältnis
zweier Komponenten A und B be-
rechnen, und zwar aus dem Verhält-
nis der Signalflächen I von je einer
Resonanzlinie der Verbindungen A
und B (Gleichung 2):
nA I A NB
˜ Routineverfahren (GC, HPLC etc.) er-
nB IB NA
Dabei ist die Zahl der äquivalen-
ten Messkerne N zu berücksichti-
gen. Art und Menge des Lösungsmit-
tels spielen keine Rolle. Dies ist die
einfachste Anwendung der qNMR.
Eine Validierung hat die Linearität,
die Robustheit, die Spezifität und Se-
1
lektivität der H-Single-Puls(SP)-
NMR bestätigt. Die relative Messun-
sicherheit der Methode U95 liegt bei
1 % (95 % Vertrauensintervall).
Abb. 2. Ergebnisse eines nationalen Ringversuchs zur Bestimmung des relativen Gehalts
(Reinheit) des pharmazeutischen Referenzmaterials Rutin-Trihydrat mit qNMR. Ergebnisse
mit mehr als 2 % Abweichung sind darauf zurückzuführen, dass die Arbeitsvorschrift nicht
eingehalten wurde und es Probleme bei der Einwaage gab.
Das Spektrum der NMR-Spektro-
skopie spiegelt immer nur das Ver-
hältnis zweier oder mehrerer Signal-
flächen zueinander wider. Man erhält
somit lediglich relative Aussagen. Um
absolute Messgrößen zu bestimmen,
etwa Konzentration, werden Refe-
renzsubstanzen als interne oder ex-
terne Standards herangezogen: stabi-
le, nicht reaktive, nicht flüchtige Stof-
fe mit einfachem NMR-Spektrum
und guter Löslichkeit in üblichen
NMR-Lösungsmitteln, leicht und bil-
lig zu beschaffen und in kleinen Men-
gen gut einzuwiegen.
Gängig ist die interne Standardi-
sierung. Hierbei werden Probe und
interner Standard (mit bekanntem
Gehalt) entsprechend des zu erwar-
tenden molaren Protonenverhältnis-
ses derart zusammen eingewogen,
dass das Intensitätsverhältnis der
auszuwertenden Signale ähnlich ist.
Im Gegensatz zu den anerkannten
folgt die Gehaltsbestimmung bei der
qNMR direkt über die Hauptkom-
ponente (Hauptkomponentenana-
lyse) und nicht über die Verunrei-
nigungen (100%-Methode). Somit
lässt sich aus dem Verhältnis der In-
tensitäten eines Analyt- und eines
Standardsignals der Gehalt berechnen
(Gleichung 3):
mX I X N Std M X m Std
˜ ˜ ˜ ˜ f Std
m I Std N X M Std m
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mit MX, MStd = Molmassen von
Analyt und Standard, m, mStd = Ein-
waagen von Probe und Standard und
fStd = Reinheitsfaktor des Standards.
Der Vergleich mit einem externen
Standard erfolgt durch aufeinander
folgende Messungen von Analyt und
Standard. Diese Methode ist vorteil-
haft beispielsweise bei hoch toxischen
Analyten und Referenzmaterialien.
Walter et al.4) prüften potenzielle
Fehlerquellen beim Einsatz externer
Standards. Wenn man alle von ihnen
spezifizierten Einflussgrößen und
Vorgaben über das Messverfahren ein-
hält, ist eine relative Standardabwei-
chung (RSD) unter 0,5 % erreichbar.
Im Jahr 1998 haben Akoka et al.5)
eine neue Technik zur externen
Standardisierung veröffentlicht:
Electronic Reference to Access in vi-
vo Concentrations, ERETIC. Hierbei
wird ein elektronisch erzeugtes Re-
ferenzsignal während der Aufnah-
mezeit über eine nicht benötigte
Spule des Probenkopfes eingestrahlt
(Abbildung 1, S. 781).
Amplitude, Linienbreite und die
chemische Verschiebung kann der
Nutzer passend zum NMR-Spektrum
des Analyten setzen, beispielsweise in
einen freien Spektralbereich bei nega-
tiven ppm-Werten. Erfolgreiche An-
wendungen sind sowohl für die Flüs-
sigkeits- als auch für die Festkörper-
und die bildgebende NMR-Spektro-
skopie veröffentlicht. Die relative
Standardabweichung dieser Technik
6)
liegt zurzeit bei 2 % bis 3 %.
Messunsicherheit
 Analysenergebnisse sind nach der
DIN EN ISO/IEC 17025 mit einer
Messunsicherheit für ein bestimmtes
Vertrauensintervall anzugeben. Da-
bei sind alle Unsicherheitsbeiträge
der Eingangsgrößen entsprechend
der Messgleichung in einem Unsi-
cherheitsbudget zu berücksichtigen.
Diese kombinierte Unsicherheit
uc(y) berechnet sich z. B. für die Ge-
haltsbestimmung mit qNMR bei Ver-
wendung eines internen Standards
nach Gleichung 3 und dem Richt-
linienband zur Bestimmung von
Messunsicherheiten, kurz GUM,7)
folgendermaßen (Gleichung 4):

§m · mX § u I x I Std · §u Mx
uc ¨ X ¸ ˜ ¨¨ ¸¸  ¨¨
© m ¹ m © I x I Std
Die erweiterte Messunsicherheit
U für ein Vertrauensintervall ergibt
sich aus (Gleichung 5):
U k ˜ uc y
Im Allgemeinen liegt der Erweite-
rungsfaktor k bei 2 für ein Vertrau-
ensintervall von 95 %.
Anwendung
 Aufgrund ihrer exzellenten Selek-
tivität in der Strukturanalytik, kom-
biniert mit der einfachen und
schnellen Quantifizierungsprozedur
ist die qNMR eine der wichtigsten
Methoden für die Quantifizierung
von Isomeren, Diastereomeren und
Enantiomeren sowie bei der Ge-
haltsbestimmung kleiner und mitt-
lerer organischer Moleküle (Mol-
masse < 2000). Dabei ist der am
1
meisten beobachtete Kern H, ge-
folgt von 13C; weitere Kerne sind 19F,
31
P und 29Si.
Die pharmazeutische Analytik,
speziell für Arzneimittel und Phyto-
pharmaka, stellt dabei den größten
Applikationsbereich der qNMR.8)
Die United States Pharmacopeia
USP29 enthält die Gehaltsbestim-
mung von Amylnitrit-Isomeren mit
1
H-qNMR. 2005 erschien ein Son-
derband zur qNMR im Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Ana-
lysis.9) Im Jahr 2005 wurde die
quantitative NMR als orthogonale
Referenzmethode erfolgreich an 14
pharmazeutischen Referenzstan-
dards nach Richtlinien der Interna-
tional Conference on Harmonisati-
on (ICH) validiert (Tabelle, S. 784).
Ein nationaler Ringversuch bestätig-
te die laborinterne Validierung (Ab-
bildung 2).
Ein weiterer Bereich, in dem die
qNMR an Bedeutung gewinnt, ist die
Analyse von Metaboliten in Bioflüs-
sigkeiten. Ein Beispiel ist die Zuord-
nung und Quantifizierung von elf
Inhaltsstoffen in Urinproben unter-
10)
schiedlicher Herkunft.
In der Lebensmittelanalytik wer-
den die chemische Veränderung
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NMR-Spektroskopie|Analytik Blickpunkt 783
2 2 2 2 2 2
· § u M Std · u m · § u m Std · § u f Std ·
¸¸  ¨¨ ¸¸  §¨ ¸  ¨¨ ¸¸  ¨¨ ¸¸
¹ © Mx ¹ © M Std ¹ © m ¹ © m Std ¹ © f Std ¹
von nativem Olivenöl durch Lage- durch Zucker lassen sich leicht mit
rung,11) die Herkunft von Oliven- der SNIF-NMR (Site specific Natu-
öl,12) der Fortschritt der alkoholi- ral Isotope Fractionation) identifi-
schen und der Milchsäuregärung zieren. Das in den 80er Jahren ent-
von Traubenmost13) sowie der wickelte Verfahren15) (Bestimmung
Ameisensäuregehalt in Apfelsaft14) des H/D-Isotopenverhältnisses)
mit qNMR untersucht. Verfälschun- wird auch noch heute erfolgreich
gen von Wein und Fruchtsäften eingesetzt. Die Massenspektrome-
Editorial Union
of Chemical
Societies
2008. Volume 14
36 Issues
ISSN: 0947-6539 print
ISSN: 1521-3765 online
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Communications (2006
5.015 ): please send an E-mail to:
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Total Synthesis of Five Thapsigargins: Guaianolide Natural Products Exhibiting
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Sub-Nanomolar SERCA Inhibition (Germany/Austria/Switzerland)
S. P. Andrews, M. Ball, F. Wierschem, E. Cleator, S. Oliver, K. Högenauer, O. Simic, cs-journals@wiley.co.uk
A. Antonello, U. Hünger, M. D. Smith, S. V. Ley (all other regions)
Chem Eur. J., 2007, 13, 5688 – 5712
Phosphorescent Dyes for Organic Light-Emitting Diodes
P.-T. Chou, Y. Chi
Chem Eur. J., 2007, 13, 380 – 395
Intra- and Intermolecular Reactions of Indoles with Alkynes Catalyzed by Gold
C. Ferrer, C. H. M. Amijs, A. M. Echavarren
Chem Eur. J., 2007, 13, 1358 – 1373
38620711_gu
www.chemeurj.org
784 Blickpunkt Analytik|NMR-Spektroskopie
Substanz Gehalt
g x g –1 [%]
Chlorogensäure
Rutin
Rutin
Cichoriensäure
Ginkgolid A
Ginkgolid A
Ginsenosid RC
1,8-Cineol
Hypericin
Hyperforin
Hyperforin DCHA-Salz
Hyperforin DCHA-Salz
Vergleich von qNMR-Ergebnissen mit den Referenzwerten, ermittelt nach validierten
Bestimmungsverfahren (GC und HPLC, kombiniert mit Karl-Fischer-Titration). Die
angegebene Unsicherheit U95 repräsentiert die erweiterte Messunsicherheit für ein
95 %iges Konfidenzintervall.
trie liefert hier nur Gesamtdeute-
rierungsgrade. McManus et al.16)
fanden für Ethanol aus unter-
schiedlichen Zuckerarten von ver-
schiedenen Herkunftsorten deut-
lich unterscheidbare H/D-Isotopen-
verhältnisse, die sich mit den her-
kunftsabhängigen, massenspektro-
metrisch erfassbaren 13C-Gehalten
korrelieren lassen.
Wells et al.17) erzielten bei der
Quantifizierung von landwirtschaft-
lichen Produkten mit 1H- und
31
P-NMR für das Herbizid Glyphosat
und das Insektizid Profenofos erwei-
von Verunreinigungen. Damit er-
U 95 Referenzwert
gänzt die NMR-Spektroskopie als
g x g –1 [%] [%]
direkte Analysenmethode die bishe-
98,2 1,1 99,03 rigen Routineverfahren ideal.
91,0 0,7 90,8
88,2 0,8 88,34 Frank Malz
92,4 0,8 93,44
Deutsches Kunststoff-Institut (DKI)
99,1 0,9 99,6
Darmstadt
95,1 0,9 94,79
Dietmar Pfeifer
89,8 1,0 90,65
Bundesanstalt für Materialforschung
98,8 0,9 98,5
und -prüfung (BAM)
91,0 1,0 90,52
Berlin
94,2 0,9 95,19
60,4 0,5 61,2
74,4 0,6 74,2 1) F. Malz, H. Jancke, J. Pharm. Biomed.
Anal. 2005, 38, 813.
2) U. Holzgrabe, R. Deubner, C. Schollmayer,
B. Waibel, J. Pharm. Biomed. Anal. 2005,
38, 806.
3) C. Szántay Jr., Z. Béni, G. Balogh, T. Gáti,
TrAC 2006, 25, 806.
4) I. W. Burton, M. A. Quilliam, J. A. Walter,
terte Messunsicherheiten U95 von
Anal. Chem. 2005, 77, 3123.
generell kleiner 0,7 % (relativ). 5) S. A. Akoka, L. Barantin, M. Trierweiler,
In der Naturstoffanalytik haben Anal. Chem. 1999, 71, 2554.
Verpoorte et al.18) Strychnin und 6) V. Molinier, B. Fenet, J. Fitremann,,
Brucin aus Strychnos-Nux-Vomica- A. Bouchu, Y. Queneau, Carbohydr. Res.
2006, 341, 1890.
Proben mit 1H-qNMR sowie Ascari-
7) Guide to the Expression of Uncertainty
dol und verwandte Produkte aus in Measurement in dt. Übersetzung,
Chenopodium Ambrosioides mit Beuth-Verlag, Berlin, 1999.
13
C-qNMR quantifiziert.19) 8) G. F. Pauli, B. U. Jaki, D. C. Lankin, J. Nat.
Maiwald et al.20) beschrieben Prod. 2005, 68, 133.
9) J. Pharm. Biomed. Anal. 2005, 38.
qNMR für die Prozessanalytik. Mit
10) A. M. Weljie, J. Newton, P. Mercier,
Durchflussprobenköpfen lassen E. Carlson, C. M. Slupsky, Anal. Chem.
sich Prozess- und Reaktionskineti- 2006, 78, 4430.
ken direkt online sowohl mit 1H- 11) A. Spyros, A. Phillipides, P. Dais, J. Agric.
als auch mit 13C-NMR präzise über- Food Chem. 2004, 52, 157.
12) G. Vlahov, C. Schiavone, N. Simone,
wachen.
Magn. Reson. Chem. 2001, 39, 689.
Die Auswahl der Beispiele gibt
13) A. Avenoza, J. H. Busto, N. Canal,
nur einen Bruchteil der in den letz- J. M. Peregrina, J. Agric. Food Chem.
ten Jahren veröffentlichten quantita- 2006, 54, 4715.
tiven NMR-Anwendungen wieder. 14) I. Berregi, G. del Campo, R. Caracena,
Jedoch wird deutlich, dass die J .I. Miranda, Talanta 2007, 72, 1049.
15) G. J. Martin, M. L. Martin, F. Mabon,
qNMR genau genug ist, um zu einer
M. J. Michon, J. Agric. Food Chem. 1983,
Routinemethode für quantitative 31, 311.
Analysen in analytischen Laborato- 16) G. G. Martin, Y. L. Martin, N. Naulet,
rien zu werden. H. J. D. McManus, J. Agric. Food Chem.
1996, 44, 3206.
17) T. S. AlDeen, D. B. Hibbert, J. M. Hook,
Fazit R. J. Wells, Anal. Chem. Acta 2002, 474,
125.
 Die NMR-Spektroskopie bietet 18) M. Frederich, Y. H. Choi, R. Verpoorte,
beides, exzellente Selektivität für Planta Med. 2003, 69, 1169.
die Strukturaufklärung und eine 19) J.-F. Cavalli, F. Tomi, A. F. Bernardini,
J. Casanova, Phytochem. Anal. 2004, 15,
hohe metrologische Qualität im
275.
Sinne von Richtigkeit und Präzision 20) M. Maiwald, H. H. Fischer, Y.-K. Kim,
beim quantitativen Einsatz. Erwei- K. Albert, H. Hasse, J. Magn. Reson. 2004,
terte Messunsicherheiten U95 von 166, 135.
1 % und weniger sind heute erreich-
bar, sowohl für die Bestimmung
von Hauptkomponenten als auch
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