G8; Nina von Spreckelsen, Oliver Braubach, Jonas Meyer

HPLC 01.04.2021

Praktikum Instrumentelle Analyse

HPLC

I. Ziel des Versuchs

Der Versuch besteht aus zwei Teilen, die beide an derselben HPLC-Anlage durchgeführt
werden. Im ersten Teil wird der Einfluss der Flussrate, sowie des Injektionslösungsmittels auf
die Trennung untersucht. Im zweiten Versuchsteil wird zunächst die experimentelle Totzeit
bestimmt und anschließend die Gehalte verschiedener Aromaten in einer unbekannten Probe
mittels externer Kalibrierung quantifiziert.

II. Theorie zum Versuch

Aufbau und Funktionsweise:

Der Versuch erfolgt mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie, kurz HPLC (engl. High
Performance Liquid Chromatography). Die HPLC-Anlage (Abb. 1) besteht grundlegend aus
den Vorratsgefäßen des Eluenten, einer Pumpe, dem Injektor, der Säule und einem Detektor.

Abb. 1: Schematischer Aufbau einer HPLC-Anlage.[1]

Mit Hilfe der Pumpe werden die Elutionsmittel durch die Anlage transportiert, wobei zu
beachten ist, dass die verwendeten Eluenten besonders rein (HPLC grade) und somit frei von
Partikeln, Stabilisatoren und Verunreinigungen sein müssen, da diese die Qualität der Trennung
beeinflussen würden. Zudem müssen die Eluenten von gelösten Gasen befreit werden, um eine
Störung der Pumpe, sowie des Detektors zu vermeiden. Das Entgasen kann entweder extern
durch Einleiten von Helium oder durch Ultraschall-Behandlung oder intern durch einen
Entgaser, in dem die Gasbläschen an einer Membran zurückgehalten werden, erfolgen. Am
Injektor erfolgt die Aufgabe der flüssigen Probe auf die Säule, wobei häufig mit einer
Dosierschleife (Sechswegeventil) gearbeitet wird, welche ein geringes Totvolumen besitzt und
sehr gut reproduzierbare Injektionsvolumina gewährleistet durch definierte Volumina der
enthaltenen Kapillaren. Die Probenlösungen sollten in einem, dem Elutions-mittel ähnlichen,
Lösungsmittel bzw. einem Lösungsmittel geringerer Elutionskraft im Vergleich zur mobilen
Phase gelöst sein. Besitzt das injizierte Lösungsmittel eine höhere Elutionskraft als die mobile
Phase kommt es zu Doppelpeaks oder veränderten Retentions-zeiten, was einen Verlust an
Trennleistung und Reproduzierbarkeit zur Folge hat.[1][2]
Zwischen dem Injektor und der eigentlichen Trennsäule ist oft noch eine Vorsäule eingebaut,
die Schwebstoffe aus der Probe zurückhält und somit die Haltbarkeit der Trennsäule verlängert.
Dennoch sollte vor der Injektion der Probenlösung darauf geachtet werden, dass diese frei von
Partikeln, nicht zu stark gefärbt und nicht zu konzentriert ist, um eine Verunreinigung der Säule
zu vermeiden und eine gute Trennung zu erzielen.

1
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HPLC 01.04.2021

Grundsätzlich kann bei der HPLC zwischen Normalphasen (NP)- und Umkehrphasen (RP)-
Chromatographie unterschieden werden. Bei der NP-Chromatographie wird eine polare
stationäre Phase (z.B. unmodifiziertes Silica-Gel) und eine unpolare mobile Phase (z.B. Pentan)
verwendet, während bei der RP-Chromatographie eine unpolare stationäre Phase (z.B. Silica-
Gele, deren endständige, oberflächliche Hydroxylgruppen mit Alkyl- oder Phenylresten
modifiziert wurden) und eine polare mobile Phase (z.B. Wasser mit Acetonitril oder Methanol)
Anwendung finden. Am häufigsten wird die Octadecylsilan (RP-18) Phase verwendet. Da bei
der Modifikation des Kieselgels nicht alle Silanolgruppen reagieren, wird zusätzlich
endcapping angewandt, um zu verhindern, dass die stationäre Phase neben unpolaren weiterhin
polare Gruppen enthält, die zu Tailing führen würden. Dazu werden diese Gruppen mit
Trimethylsilylchlorid derivatisiert.[2][3][4]
Die Trennleistung einer Säule ist nicht nur von dem Material der stationären Phase, sondern
auch von dessen Partikelgröße und dem Säuleninnendurchmesser abhängig. HPLC-Säulen
haben einen Innendurchmesser von bis zu 4,6 mm und sind bis zu 250 mm lang. Die Größe der
Partikel liegt zwischen 3 und 10 µm, wodurch sich ein Arbeitsdruck von maximal 400 bar
ergibt. Bei der UHPLC (Ultra high Performance-LC) wird der Innendurchmesser halbiert (ca.
2,1 mm) und die Partikel sind noch kleiner als bei der HPLC (< 3 µm). Dadurch können die
Trennleistung verbessert und die Analysenzeit verkürzt werden.Allerdings kommt es durch die
kleineren Partikel und die schmalere Säule auch zu höheren Drücken (bis zu 1500 bar), was zu
einer höheren Belastung des Gerätes sowie höheren Anschaffungs- und Wartungskosten
führt.[5]
Der Trennmechanismus der RP-Chromatographie beruht auf der unterschiedlichen Verteilung
der Analyten zwischen der stationären und der mobilen Phase. Ein unpolarer Analyt wird sich
eher in bzw. an der unpolaren stationären Phase aufhalten und wird somit später von der Säule
eluiert als polare Verbindungen, die kaum mit der stationären Phase wechselwirken und sich
bevorzugt in der polaren mobilen Phase aufhalten. Als mobile Phase wird meist ein Gemisch
mit hohem Wasser-Anteil gewählt, da Wasser die geringste Elutionskraft bei der RP-
Chromatographie besitzt. Durch Zusatz organischer Lösungsmittel, wie Methanol, Acetonitril
oder Tetrahydrofuran, wird die Elutionskraft des Elutionsmittels erhöht. Die genannten
organischen Lösungsmittel besitzen unterschiedliche Elutionsstärken und zudem Unter-schiede
in der Selektivität der Wechselwirkungen mit den Analyten und der stationären Phase.[4]
Nach Verlassen der Trennsäule gelangen die Analyten in den Detektor, der ein entsprechendes
Messsignal (Peak) ausgibt. Um dieses Signal in direkten Zusammenhang mit der Konzentra-
tion des Analyten setzen zu können, muss eine Kalibrierung – in diesem Versuch eine externe
– der gewählten Methode durchgeführt werden. Bei der Wahl des Detektors müssen die
Eigenschaften der zur analysierenden Stoffklasse berücksichtigt werden. In diesem Versuch
wurde ein Diodenarray-Detektor (DAD) verwendet.[6]

2
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Abb. 2: Schematischer Aufbau eines Diodenarray-Detektors (DAD).[7]

Im Gegensatz zu normalen UV-vis-Detektoren wird hierbei kein mono-, sondern

polychromatisches Licht durch die Probe geleitet, was zur Folge hat, dass nicht bei einer
bestimmten Wellenlänge gemessen werden muss, sondern parallel ein Absorptionsspektrum für
jede der ausgestrahlten Wellenlängen aufgenommen wird. Die elektromagnetischen Strahlen
werden geteilt und sowohl durch eine Referenzküvette, die nur das Elutionsmittel enthält, als
auch eine Messküvette geleitet. Das durch den Analyten abgeschwächte Licht trifft auf ein
Gitter, welches das Licht in die einzelnen Wellenlängen zerlegt. Das so erzeugte
monochromatische Licht wird auf einen Diodenarray geleitet, der aus hunderten von
Photodioden besteht, die für jede der auftreffenden Wellenlängen ein Absorptionsspektrum
erzeugen. Durch Vergleichen der durch die Probe abgeschwächten Intensität mit der Intensität
der Strahlung, die durch die Referenzküvette gelangt (und nicht abgeschwächt wird), wird das
Spektrum erzeugt. Es handelt sich um einen konzentrationsabhängigen Detektor, dessen
Signalhöhe proportional zur Konzentration des Analyten in der mobilen Phase ist. Der DAD ist
ebenso wie der UV-vis-Detektor nur zur Detektion von Substanzen geeignet, die UV-/ bzw.
sichtbares Licht absorbieren können. Voraussetzung dafür ist, dass die Substanzen ein
konjugiertes π-Elektronensystem besitzen, was für unsere Analyten, die alle mindestens einen
Benzolring enthalten, gegeben ist. Ein großer Vorteil des DAD ist die simultane Detektion von
Analyten unterschiedlicher Absorptionsmaxima. Allerdings muss, ebenso wie beim UV-vis-
Detektor, bei der Wahl der Messwellenlängen die cut-off Wellenlänge des Eluenten be-
rücksichtigt werden. Unterhalb dieser Wellenlänge ist die Eigenabsorption des Eluenten so
hoch, dass keine eindeutige Detektion der Analyten mehr möglich ist. Eine weitere Möglichkeit
der Detektion ist mittels Fluoreszenz-Messung. Diese Art der Detektion ist empfindlicher als
die vorigen Detektoren, ist allerdings nur für Analyten anwendbar, die fluoreszieren oder zu
solchen Verbindungen derivatisiert werden können. Neben den zuvor genannten
spektrometrischen Detektoren, die sehr selektiv sind, können auch (fast) universelle
Detektoren, wie der RI- (Brechungsindex) oder der ESL-Detektor (Lichtstreu-detektor)
eingesetzt werden. Der Vorteil des RI-Detektors ist seine universelle Einsetzbarkeit, womit
auch Zucker oder andere nicht UV-aktive Substanzen mitbestimmt werden können. Allerdings
ist die Empfindlichkeit ca. 1000 mal geringer als die eines UV-Detektors und es sind nur
isokratische Trennungen möglich, da der Brechungsindex sich mit jeder Änderung der
Zusammensetzung des Eluenten verändern würde. Zudem muss die Temperatur während der
gesamten Messung konstant gehalten werden, da der Brechungsindex temperaturabhängig ist.
Beim ESL-Detektor wird die mobile Phase mit den Analyten zerstäubt und in einer Driftröhre
das Lösungsmittel verdampft. Im Detektionsbereich des Detektors trifft Licht auf die Analyten,

3
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wodurch dieses gebrochen und die so erzeugten Photonen an einer Photodiode erfasst werden.
Mit diesem Detektor können alle Verbindungen erfasst werden, die weniger flüchtig sind als
die mobile Phase. Des Weiteren ist die Kopplung einer HPLC-Anlage mit einem
Massenspektrometer als Detektoreinheit möglich.[6][7][8]

Chromatographische Kenngrößen:
In diesem Versuch sollen einige wichtige Kenngrößen untersucht werden.

Durchflusszeit bzw. Totzeit t0:

Die Durchflusszeit ist die Zeit, die ein Teilchen, welches keine Wechselwirkung mit der
stationären Phase zeigt, benötigt, um die Trennstrecke zu durchqueren. Als Totzeitmarker wird
in diesem Versuch Thioharnstoff verwendet.[7]

(Netto)Retentionszeit t'R :
Um auf die Nettoretentionszeit t'R zu kommen, wird die Durchflusszeit von der Brutto-
retentionszeit tR abgezogen (Gl. 1). Die Bruttoretentionszeit ist hierbei die gesamte Zeit, in der
sich der Analyt in der mobilen sowie an der stationären Phase aufgehalten hat. Die
Nettoretentionszeit gibt an, wie lange sich der Analyt an der stationären Phase aufhielt.[7]

Kapazitätsfaktor k':
Der Kapazitätsfaktor gibt das Verhältnis zwischen Nettoretentionszeit und Durchflusszeit (Gl.
2) an und beschreibt die Wanderungsgeschwindigkeit des Analyten im chromatographischen
System. Um eine gute Trennung zu erreichen, sollten die Werte der Peaks aller Analyten
zwischen 0,5 und 20 liegen.[9]

Selektivitätsfaktor α:
Der Selektivitätsfaktor α ist ein Maß für die Selektivität eines chromatographischen Systems
und gibt die Trennung der Peakmaxima zweier benachbarter Peaks an. Der Wert für α sollte
zwischen 1 und 10 liegt und sich somit die Kapazitätsfaktoren der beiden Substanzen
unterscheiden (Gl. 3).[7]

Auflösung RS:
Die Auflösung gibt das Maß eines chromatographischen Systems an zwei Substanzen
voneinander zu trennen. Die Auflösung sollte über 1,5 liegen, da die Peakflächen bei diesem
Wert nur noch zu 0,3 % überlappen. Zur Berechnung werden meist die Peakbreiten auf halber
Höhe (w1/2) der Peaks verwendet, weil die Breite dort besser bestimmbar ist als an der
Basislinie.[7]

4
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Bodentheorie:
In der Bodentheorie wird (analog zur Destillation mittels Glockenbodenkolonne, die aus
mehreren Böden besteht) davon ausgegangen, dass die Chromatographie-Säule in Abschnitte
zerlegt werden kann, wovon jeder Abschnitt eine Trennstufe (einen Boden) darstellt. In jedem
dieser Böden stellt sich das Verteilungsgleichgewicht des Analyten zwischen stationärer und
mobiler Phase einmal ein. In der Chromatographie können diese Böden nur theoretisch ermittelt
werden, da die Säule nicht aus mehreren Kompartimenten besteht wie die
Glockenbodenkolonne bei der Destillation. Je höher die theoretische Bodenzahl N (Gl. 5) ist,
desto schmaler werden die Peaks und desto besser ist die Trennung. Aus den Gleichungen 5
und 6 ergibt sich, dass eine hohe Bodenzahl und somit eine geringe Bodenhöhe die
bestmögliche Trennung erzielt.[2][7]

Die Bodenhöhe ergibt sich aus der Bodenzahl N und der Länge der Säule L (Gl. 6).[7]

Peakkapazität:
Die Peakkapazität beschreibt die Anzahl der Peaks, die in einer bestimmten Zeit mit einer
definierten Auflösung getrennt werden können.[9]

5
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Van-Deemter-Gleichung:
Der Einfluss der Säuleneffekte sowie der Fließgeschwindigkeit auf die Bodenhöhe und somit
die Qualität der Trennung werden durch die van-Deemter Gleichung (Gl. 7, Abb. 3)
beschrieben.[2]

Abbildung 3: Van-Deemter-Kurve.[10]

Eddy-Diffusion (A-Term):
Die Eddy‐Diffusion beschreibt die unterschiedlichen Fließstrecken innerhalb der Säule, welche
von den Analytmolekülen zurückgelegt werden, wodurch diese zu unterschiedlichen Zeiten am
Detektor eintreffen und zu einer Bandenverbreiterung führen. Die unterschied-lichen Wege
kommen durch die unregelmäßige Packung der Partikel sowie deren, innerhalb der Säule,
variierenden Größe und Form zustande. Der A-Term kann durch kleine Teilchen ähnlicher
Größe und eine homogene Säulenpackung verringert werden, da dadurch auch die
Streckendifferenzen der Anayltmoleküle kleiner werden. Die Eddy-Diffusion wird nicht von
der Fließgeschwindigkeit beeinflusst.[2][10]

Longitudinal-Diffusion (B-Term):
Die Bandenverbreiterung durch Longitudinal-Diffusion (auch Längsdiffusion) entsteht
aufgrund eines Konzentrationsgefälle der Analyten innerhalb der Säule. Die Bezeichnung
Längsdiffusion resultiert daraus, dass sie längs der Säulenachse abläuft und somit einige
Analytmoleküle den Detektor schneller erreichen als andere. Da diese Art der Diffusion
während des Transports der Analyten durch die mobile Phase stattfindet, verringert sie sich bei
höheren Flussraten, da der Analyt kürzer in der Säule verweilt.[2][10]

6
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Massenaustausch (C-Term):
Der C-Term berücksichtigt die unterschiedlichen Wechselwirkungen der Analyten mit der
stationären Phase und beschreibt somit den eigentlichen chromatographischen Effekt.
Analyten, die stärker mit der stationären Phase wechselwirken, werden später vom Detektor
erfasst. Zudem wandern einige Analyten weit in die Partikel der stationären Phase hinein,
während andere Analyten nur wenig oder gar nicht mit der stationären Phase wechselwirken,
wodurch es zu unterschiedlichen Retentionszeiten und somit einer Verbreiterung der Peaks
kommt. Bei höheren Flussraten werden die Banden breiter, da die zeitlichen Differenzen
zwischen den wenig und stark wechselwirkenden Teilchen größer wird. Durch Temperatur-
erhöhung kann die Bandenverbreiterung zusätzlich reduziert werden, da die Diffusions-
koeffizienten der Analyten damit erhöht werden.[2][10]
Werden die Kurven der verschiedenen Terme aufsummiert ergibt sich eine Kurve, aus der die
optimale lineare Fließgeschwindigkeit abgelesen werden kann, bei der eine möglichst geringe
Bodenhöhe resultiert. Durch Verkleinerung der Partikel der stationären Phase können die
Einflüsse aller drei Terme reduziert werden (Abb. 4).[2]

Abbildung 4: Van-Deemter-Kurven unterschiedlicher mittlerer Korngröße der stationären Phase.[2]

Noch schmalere Peaks ergeben sich bei Verwendung von Core-Shell-Partikeln, die aus einem
festen Kern aus Siliciumdioxid bestehen, auf den eine homogene poröse Hülle aufgebracht ist.
Dadurch wird der Weg, den die Analyten in die Partikel der stationären Phase eindringen
können, verringert und somit auch der Massenaustausch. Außerdem wird in Säulen solchen
Materials eine einheitliche Partikelgrößenverteilung eingesetzt, die zu einer verringerten Eddy-
Diffusion führt.[11]

Analyten:
In diesem Versuch wird eine Standardmischung (Abb. 5) zum Test von RP-Phasen in der HPLC
verwendet. Alle der fünf enthaltenen Substanzen sind Aromaten und besitzen ein konjugiertes
π-Elektronensystem, was Voraussetzung für die Detektion mittels DAD ist.

Abbildung 5: Strukturformeln der, in der Standardmischung enthaltenen, Aromaten.[12]

7
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Zudem handelt es sich bei vier der fünf Substanzen (Ausnahme Toluol) um polycyclische
aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK). Diese entstehen bei Verbrennungsprozessen und sind
somit stark in Luft, Wasser und Boden vertreten, wodurch sie in die Nahrungskette gelangen.
Die Problematik an dieser Stoffklasse sind die schlechte Abbaubarkeit in der Umwelt
(Persistenz), die Anreicherung in Organismen (Bioakkumulation) und ihre Toxizität
(cancerogen, mutagen). Die Aufnahme in den Körper kann durch Einatmen von Rauch bzw.
Stäuben, Nahrungsaufnahme oder Hautkontakt erfolgen.[13]
Als Totzeitmarker wird bei dieser HPLC-Anlage Thioharnstoff (Abb. 6) verwendet, da es sich
um einen polaren Stoff handelt, der nicht mit der stationären Phase wechselwirkt. Allerdings
entspricht die so experimentell bestimmte Totzeit nicht der wahren Totzeit, da der
Thioharnstoff erst noch dem Konzentrationsgradient folgend in die Poren hineinwandern muss,
wodurch eine geringe Verzögerung entsteht.

Abbildung 6: Strukturformel des als Totzeitmarker verwendeten Thioharnstoffs.[12]

Die mobile Phase sollte allerdings ohne jegliche Wechselwirkung durch das HPLC-System
transportiert werden, wobei diese im Normalfall nicht vom Detektor erfasst wird. Durch
Einstellen einer Wellenlänge unterhalb des cut-off des Eluenten zeigt dieser allerdings eine
Eigenabsorption und ist im Chromatogramm sichtbar.

III. Versuchsdurchführung
Die Durchführung des Versuchs erfolgte analog zum Praktikumsskript.[14]
Abweichend davon wurde die Standardmischung für den ersten Versuchsteil 1:10 mit dem
Eluentengemisch Acetonitril/Wasser (65/35, v/v) verdünnt (Tab. 1).

Tabelle 1: Stammlösungen

Konzentration Stammlösung Konzentration

Analyt
[mg/L] Verdünnung [mg/L]
Toluol 9900 990
1-Methylnaphthalin 4540 454
Phenanthren 200 20
Fluoranthen 390 39
Pyren 310 31

Für Versuchsteil 1.2 wurden, entgegen der Angaben im Skript, je einmal die 1:10 verdünnte
Standardmischung sowie eine 1:100 mit Acetonitril und eine 1:100 mit Acetonitril/Wasser
(65/35, v/v) Verdünnung der Standardmischung injiziert. Die Durchführung des zweiten
Versuchsteils erfolgte analog zum Skript, die Kalibrierreihe wurde aus der Standardmischung
durch Verdünnen hergestellt und die unbekannte Probe (Probe Nr. 3) mit dem Eluenten-
gemisch so verdünnt, dass 100 µL der Probe in einem Vial mit 900 µL des Eluentengemischs
aufgefüllt wurden.

8
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IV. Messwerte

Messwerte der Messung mit DAD Detektor

Zunächst wurden die DAD-Spektren der Komponenten aus der Standardmischung aufge-
nommen (Abb. 7 – 11). Das Auswerteprogramm der HPLC-Anlage lieferte die dazugehöri-gen
Messwerte (Tab. 2). Hierbei steht die “Area” für die Fläche unter dem Peak, “Height” gibt die
Signalhöhe (Peakhöhe) an und “Width (50 %)” die Peakbreite auf halber Höhe.

Tabelle 2: 1,6 ml/min mit DAD

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 3,173 529493 129730 0,062
1-Methyl-
2 4,636 2918148 554724 0,077
naphthalin
Phenanthren 3 5,610 1980336 344932 0,087
Fluoranthen 4 7,075 1182713 174096 0,103
Pyren 5 7,636 961378 126767 0,113

mAU
3,166/ 1,00
198

3000

2500

2000

1500

1000

500
260

661
491

757

200 300 400 500 600 700 nm

Abbildung 1: Peak 1 der Messung mit DAD

mAU
4,636/ 1,00
208

3500

3000

2500

2000
279

1500

1000

500
661
491

757

200 300 400 500 600 700 nm

Abbildung 2: Peak 2 der Messung mit DAD

9
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mAU
5,610/ 1,00

249
400

300

210
200

291

661
100

757
0

200 300 400 500 600 700 nm

Abbildung 3: Peak 3 der Messung mit DAD

mAU
7,075/ 1,00
233
195
210

500

400
284

300

200
343

100

200 300 400 500 600 700 nm

Abbildung 4: Peak 4 der Messung mit DAD

mAU
7,636/ 1,00
238

500
195

400
334

300
271

320

200

100

200 300 400 500 600 700 nm

Abbildung 5: Peak 5 der Messung mit DAD

Messwerte bei verschiedenen Flussgeschwindigkeiten

Anschließend wurden Messungen bei verschiedenen Flussgeschwindigkeiten durchgeführt, um
den Einfluss dieser auf die Trennung zu untersuchen. Aufgrund des geringen Flusses ergeben
sich bei den ersten beiden Messungen sehr hohe Retentionszeiten, weshalb die Messung nach
dem ersten Peak abgebrochen und die verbleibenden Substanzen von der Säule gespült wurden
(Abb. 12). Es zeigt sich, dass die Messwerte mit zunehmendem Fluss sinken (Tab. 3 – 9). Bei
einer Verdopplung der Flussrate (z.B. von 0,6 auf 1,2 mL/min) sind die Messwerte (mit
Ausnahme der Peakhöhe) um ca. 50 % gesunken.

10
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Tabelle 3: Messwert bei Fließgeschwindigkeit 0,15 ml/min

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 33,681 5572522 117527 0,741

Tabelle 4: Messwert bei Fließgeschwindigkeit 0,3 ml/min

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 16,802 2788290 145296 0,299

Datafile Name:0,3 mL Toluol001.lcd

Sample Name:0,3 mL/min Toluol
mAU
150 254nm,4nm

100

50

0
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 min

Abbildung 6: Beispielsspektrum bei Fließgeschwindigkeit 0,3 ml/min

Tabelle 3: Messwerte bei Flussgeschwindigkeit 0,6 ml/min

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 8,408 1424179 158419 0,139
1-Methyl-
2 12,287 7483918 632437 0,184
naphthalin
Phenanthren 3 14,840 5347152 376534 0,220
Fluoranthen 4 18,684 3111989 179482 0,267
Pyren 5 20,154 2448404 125804 0,295

Tabelle 4: Messwerte bei Flussgeschwindigkeit 1,0 ml/min

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 5,066 851484 147923 0,089
1-Methyl-
2 7,392 4640318 607385 0,114
naphthalin
Phenanthren 3 8,926 3200312 366714 0,134
Fluoranthen 4 11,237 1859610 176914 0,161
Pyren 5 12,119 1462666 125338 0,176

Tabelle 5: Messwerte bei Flussgeschwindigkeit 1,2 ml/min

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 4,216 707516 141451 0,076
1-Methyl-
2 6,152 3887925 588252 0,097
naphthalin
Phenanthren 3 7,432 2670986 357936 0,114
Fluoranthen 4 9,359 1554170 173939 0,136
Pyren 5 10,097 1222002 123157 0,149

11
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Tabelle 6: Messwerte bei Flussgeschwindigkeit 1,6 ml/min

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 3,181 529443 126926 0,063
1-Methyl-
2 4,651 2915536 542520 0,079
naphthalin
Phenanthren 3 5,626 2006737 332208 0,092
Fluoranthen 4 7,095 1168598 164222 0,108
Pyren 5 7,656 924973 116984 0,118

Da die meisten Versuchsteile bei einem Fluss von 1,6 mL/min durchgeführt wurden, ist
nachfolgend ein Chromatogramm der Standardmischung bei diesem Fluss dargestellt (Abb.
13). Alle Peaks der enthaltenen Substanzen sind bei dieser Flussrate gut zu erkennen.
Datafile Name:1,6 mL.lcd
Sample Name:1,6 mL/min
mAU
254nm,4nm
500

250

0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 min

Abbildung 7: Beispielchromatogramm für die Messung mit einer Flussgeschwindigkeit von 1,6 ml/min

Tabelle 7: Messwerte bei Flussgeschwindigkeit 2,0 ml/min

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 2,550 422645 115497 0,055
1-Methyl-
2 3,727 2331132 496738 0,068
naphthalin
Phenanthren 3 4,511 1605402 312897 0,078
Fluoranthen 4 5,691 934642 153933 0,092
Pyren 5 6,145 744590 111338 0,099

Messwerte bei Nutzung verschiedener Injektionsmittel

Zuletzt wurde in Teil 1 des Versuchs der Einfluss des Injektionslösungsmittels auf die Trennung
untersucht (Tab. 10 – 12).

Tabelle 8: Injektionsvolumen 10 μl / Stammlösung 1:10

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 3,191 527902 126873 0,063
1-Methyl-
2 4,675 2916071 541431 0,079
naphthalin
Phenanthren 3 5,661 2007873 332726 0,092
Fluoranthen 4 7,141 1168530 162524 0,108
Pyren 5 7,706 924974 116121 0,119

12
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Tabelle 9: Injektionsvolumen 100 μl / Stammlösung 1:100

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 3,195 2804863 175862 0,272
1-Methyl-
2 4,674 10766936 545133 0,348
naphthalin
Phenanthren 3 5,655 4901484 338200 0
Fluoranthen 4 7,126 2786374 181150 0
Pyren 5 7,686 3384101 142138 0,422

Tabelle 10: Injektionsvolumen 100 μl / Stammlösung 10:100

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 3,214 1854677 327555 0,088
1-Methyl-
2 4,696 9188429 1419794 0,096
naphthalin
Phenanthren 3 5,681 6288421 900008 0,108
Fluoranthen 4 7,160 3957051 499341 0,121
Pyren 5 7,724 3072478 352137 0,132

Messwerte zur Bestimmung der Totzeit

Um die (experimentelle) Totzeit zu bestimmen, wird Thioharnstoff verwendet, da dieser
aufgrund seiner Polarität keine Wechselwirkungen mit der stationären Phase eingehen sollte.
In der Realität gehen aber alle Substanzen, außer Lösungsmittel wie die mobile Phase, eine
Wechselwirkung mit der stationären Phase ein, indem sie dem Konzentrationsgradienten
entlang in die Poren der stationären Phase wandern, wodurch sich eine geringe Verzögerung
ergibt (Tab. 13 + 14, Abb. 14).
Tabelle 11: Erste Messung des Thioharnstoffes

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Thioharnstoff 1 1,370 980284 287098 0,051
Datafile Name:Thio1.lcd
Sample Name:Thio1
mAU
300 254nm,4nm

200

100

0
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25 2,50 2,75 3,00 3,25 3,50 3,75 min

Abbildung 8: Beispielsspektrum der ersten Messung des Thioharnstoffes

Tabelle 12: Zweite Messung des Thioharnstoffes

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Thioharnstoff 1 1,371 980151 27181 0,051

Die experimentelle Totzeit sollte regelmäßig überprüft werden, da sie ein Parameter ist, der
dem Anwender der HPLC Aufschluss über die Konstanz der Bedingungen in der HPLC-Anlage
und somit die Reproduzierbarkeit der Messungen gibt. Sie ermöglicht eine schnelle Erkennung

13
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HPLC 01.04.2021

von einer Vergrößerung des Totvolumens, was z.B. durch Säulenbluten zustande kommen
kann.

Messwerte der Kalibriermessungen

Um die Quantifizierung der Probe im zweiten Versuchsteil zu ermöglichen, wird eine externe
Kalibrierung anhand vierer Verdünnungen der Standardmischung durchgeführt. Die sich dabei
ergebenden Messwerte sind nachfolgend dargestellt (Tab. 15 – 18).

Tabelle 13: Messwerte bei Kalibrierlösung 1:10

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 3,192 525579 125669 0,064
1-Methyl-
2 4,674 2917485 540151 0,079
naphthalin
Phenanthren 3 5,659 2009198 329788 0,092
Fluoranthen 4 7,138 1169407 162884 0,109
Pyren 5 7,704 925297 116225 0,119

Tabelle 14: Messwerte bei Kalibrierlösung 1:20

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 3,194 55839 12995 0,064
1-Methyl-
2 4,676 1000220 184654 0,079
naphthalin
Phenanthren 3 5,662 789021 130932 0,091
Fluoranthen 4 7,141 464589 64037 0,109
Pyren 5 7,706 374275 46689 0,119

Tabelle 15: Messwerte bei Kalibrierlösung 1:50

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 3,191 12045 2776 0,065
1-Methyl-
2 4,666 415624 76516 0,079
naphthalin
Phenanthren 3 5,647 343958 57014 0,091
Fluoranthen 4 7,121 208298 28681 0,109
Pyren 5 7,684 167247 21020 0,119

Tabelle 16: Messwerte bei Kalibrierlösung 1:100

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 3,190 12131 2868 0,064
1-Methyl-
2 4,667 219442 40205 0,080
naphthalin
Phenanthren 3 5,649 164664 27176 0,092
Fluoranthen 4 7,125 94826 13010 0,110
Pyren 5 7,689 76006 9509 0,119

14
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Messwerte der Probe

Anschließend wurde die unbekannte, zuvor verdünnte, Probe zweifach vermessen, wobei sich
nur sehr geringe Schwankungen zwischen den Messwerten der beiden Messungen zeigten (Tab.
19 + 20, Abb. 15).

Tabelle 17: Erste Messung der Probe

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 3,194 275569 64603 0,064
1-Methyl-
2 4,673 1692265 311329 0,080
naphthalin
Phenanthren 3 5,656 1333632 219899 0,092
Fluoranthen 4 7,133 569868 78497 0,109
Pyren 5 7,696 474836 58866 0,120
Datafile Name:Probe1.lcd
Sample Name:Probe1
mAU
300 254nm,4nm

200

100

0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 min

Abbildung 9: Beispielsspektrum der ersten Messung der Probe

Tabelle 18: Zweite Messung der Probe

Ret.-Zeit
Analyt Peak Area Height Width (50%)
[min]
Toluol 1 3,197 275291 64864 0,064
1-Methyl-
2 4,677 1690785 307374 0,080
naphthalin
Phenanthren 3 5,661 1337293 219721 0,092
Flouranthen 4 7,140 571173 78425 0,110
Pyren 5 7,705 476125 58917 0,120

V. Auswertung

1. Aufgabe
Anhand der unterschiedlichen Wechselwirkungen mit dem Material der Trennsäule und den
unterschiedlich großen Analytmolekülen kommt es zu unterschiedlichen Retentionszeiten der
verschiedenen Substanzen. Somit ist jeder Peak einer bestimmten Substanz zuzuordnen. Im
Falle der Messung ergibt sich folgende Reihenfolge. Toluol; 1-Methylnaphthalin; Phenanthren;
Flouranthen; Pyren (Abb. 11).

Abbildung 10: Reihenfolge der Eluenten

15
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2. Aufgabe
Aufgabenteil 2.1
Die Berechnung der effektiven Bodenzahl des Pyrens bei verschiedenen Flussraten erfolgt
anhand von Gleichung (5):
%
#!
𝑁!"" = 5,54 &$ ' (5)
"
#

Die zur Berechnung zugrundeliegenden Messwerte sind den Tabellen 5 – 9 zu entnehmen. Mit
zunehmendem Fluss ergibt sich auch eine proportionale Erhöhung der Bodenzahl (Tab. 21),
wodurch sich eine bessere Trennleistung ergibt.

Tabelle 21: Bodenzahl Pyren

𝒎𝒍
Fließgeschwindigkeit in (𝒎𝒊𝒏) Bodenzahl
0,6 7410,72
1,0 10478,37
1,2 14310,54
1,6 16464,96
2,0 19786,23

Aufgabenteil 2.2
Anhand folgender Formel wird die Bodenzahl der Analyten berechnet.
%
#!
𝑁 = 5,54 &$ ' (02)
"
#

Analyt Bodenzahl Effektive Bodenzahl

Toluol 17064,5850 3628,7118
1-Methylnaphthalin 22069,4723 8789,1337
Phenanthren 23254,3546 11221,8216
Flouranthen 25729,5076 14767,6868
Pyren 24950,7244 14998,2350

*
𝐻=+ (6)
l=Säulenlänge=250 mm
N=Bodenzahl

16
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Tabelle 22: Bodenhöhe bei verschiedener Flussgeschwindigkeit

𝒎𝒍
Durchfluss(𝒎𝒊𝒏) Bodenhöhe[cm]
2,00 0,0021
1,60 0,0018
1,20 0,0015
1,00 0,0014
0,60 0,0012
0,30 0,0014
0,15 0,0022

Im Folgenden wird die Van-Deemter-Kurve von Toluol Graphisch dargestellt. Dazu wird die
Bodenhöhe gegen die Durchflussrate aufgetragen.

0,0024

0,0022

0,002
Bodenhöhe [cm]

0,0018

0,0016

0,0014

0,0012

0,001
0 0,5 1 1,5 2
Durchfluss [ml/min]

Abbildung 11: Van-Deemter-Kurve

Aufgabenteil 2.3

In Aufgabenteil 2.2 wurde das Van-Deemter-Diagramm von Toluol aufgetragen und es ist ein
Typischer verlauf zu erkennen. Das Van-Deemter-Diagramm dient zur Bestimmung der
Optimalen Bodenhöhe und Durchflussrate. Diese Parameter entsprechen am tiefsten Punkt des
Diagramms den Optimalen Bedingungen zur Bestimmung der ungekannten Substanzen.

17
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HPLC 01.04.2021

Aufgabenteil 2.4
,
𝐻 =𝐴+-+𝐶∙𝑣 (04)

Anhand der Formel ist zu sehen, dass die Bodenhöhe umgekehrt proportional zur
Durchflussrate ist. Zu sehen ist, dass bei kleineren Fließgeschwindigkeiten die Diffusion einen
größeren Einfluss nimmt. Wenn die Durchflussrate steigt ändert sich auch die Austauschmenge
der Säule.

Aufgabe 3

Während die Retentionszeiten nahezu unverändert sind, unterscheiden sich die anderen
Parameter bei den unterschiedlichen Lösungsmitteln zum Teil sehr stark. Auffällig ist, dass die
Chromatogramme der 1:10 und der 1:100 verdünnten Standardmischung sich in ihrer äußeren
Form kaum unterscheiden. Die großen Unterschiede der Messwerte ergeben sich durch die
unterschiedlichen Injektionsvolumina. Bei der Ver-dünnung der Standardmischung mit reinem
Acetonitril ergibt sich hingegen ein Chromatogramm, was auch in seiner äußeren Form starke
Abweichungen aufweist (Abb. 14). Es sind Doppelpeaks zu erkennen, die erheblich verbreitert
sind, wodurch sich eine deutliche Verschlechterung der Trennleistung ergibt.
Datafile Name:Lsgm b.lcd
Sample Name:Lsgm b
mAU
254nm,4nm
500

250

0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 min

Abbildung 12: Beispielsspektrum der Messung Injektionsvolumen 100 μl / Stammlösung 1:100

Aufgabe 4
Im Anschluss wird anhand folgender Daten die Totzeit ermittelt.
/∙1$%%!
𝑡. = "&
(05)

Tabelle 23: Werte zur Berechnung

Höhe [mm] 250

Radius [mm] 2,30
Pi 3,141592654
Porösität 0,80
ml
Durchfluss (min) 0,15
ml
Durchfluss (min) 0,30

18
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Tabelle 24: Berechnete Totzeit gegen gemessene Totzeit

Fließgeschwindigkeit Totzeiten Totzeiten

Abweichung
ml berechnet gemessen
C E [%]
min [min] [min]
0,15 33,032 33,681 1,97
0,30 16,516 16,802 1,73

Aufgabe 5
Durch zur Hilfenahme der Totzeit wird anschließend der Kapazitätsfaktor k bestimmt.

6!7#!7#897:;!8#<=9#;!8# #' <#(

𝑘= =9#;!8#
= #(
(06)

Tabelle 25: Kapazitätsfaktoren

k1 0,8558
k2 1,7105
k3 2,2752
k4 3,1254
k5 3,4507

Aufgabe 6
Nun wird die Bodenzahl aller Analyten berechnet. Dies geschieht durch Berechnungen anhand
des Mittelwertes der Messungen.
%
#(!
𝑁 = 5,54 &$ ' (07)
"
#

%
#!
𝑁!"" = 5,54 &$ ' (08)
"
#

Tabelle 26: Berechnung der Bodenzahl

Effektive Bodenhöhe
Analyt Bodenzahl
Bodenzahl [cm]
Toluol 17064,5850 3628,7118 0,0069
1-Methylnaphthalin 22069,4723 8789,1337 0,0028
Phenanthren 23254,3546 11221,8216 0,0022
Fluoranthen 25729,5076 14767,6868 0,0017
Pyren 24950,7244 14998,2350 0,0017

19
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HPLC 01.04.2021

Aufgabe 7

Im Folgenden wird der Selektivitätsterm bestimmt. Es handelt sich hierbei mehr oder weniger
um ein Maß der Trennbarkeit von mehreren Analyten. Zur Berechnung des Selektivitätsfaktors
wird folgende Formel verwendet:
>
𝛼 = ># (09)
"

In folgender Tabelle sind die berechneten Selektivitätsterme tabelliert.

Tabelle 27: Bestimmung des Selektivitätstherms (𝛼)

Analyten 𝜶
Toluol-1-
1,9989
Methylnaphthalin
1-Methylnaphthalin-
1,3301
Phehnanthren
Phenanthren-
1,3737
Flouranthen
Flouranthen-
1,1041
Pyren

Auffällig ist, dass alle Selektivitätsterme über 1 liegen. Dies verdeutlicht, dass die Peaks nicht
überlappen und somit voneinander getrennt sind und gut ablesbar sind.

Aufgabe 8

In diesem Aufgabenteil wird die Auflösung bestimmt. Mit Hilfe der Auflösung wird die
Fähigkeit des Systems beschrieben zwei Analyten zu trennen. Es wird immer versucht eine
Möglichst hohe Auflösung zu erzielen, da dies die Auswertung sowie die Genauigkeit
verbessert. Die Auflösung wird im Folgenden mit zwei verschiedenen Formeln berechnet. Es
folgen nun die Formeln:

%⋅(#!# <#_CD)
𝑅?" = $)# F$)"
(10)

D C<D >
𝑅?# = G ⋅ K C
L ⋅ K>FDL ⋅ M𝑁!"" (11)

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In der folgenden Tabelle wurden die berechneten Werte dokumentiert.

Tabelle 28: Auflösung (Rs) nach zwei Methoden

Analyten Rs1 Rs2

Toluol-1-
13,2052 48,9405
Methylnaphthalin
1-Methylnaphthalin-
7,1260 21,4762
Phehnanthren
Phenanthren-
9,0318 24,6188
Flouranthen
Flouranthen-
3,0255 7,9531
Pyren

Aufgabe 9
In Aufgabe 9 wird die Peakkapazität berechnet. Sie gibt an wie viele Peaks innerhalb eines
Intervalls aufgelöst werden. Zur Berechnung der Peakkapazität wird folgende Formel
verwendet.

√+ DF>
𝑛H = G⋅6 ⋅ ln K DF>+L (12)
* ,

In der folgenden Tabelle wurde der berechnete Wert festgehalten.

Tabelle 29: Peakkapazität

np 12,5508066

Aufgabe 10

In der letzten Aufgabe wird die Konzentration einer unbekannten Probe bestimmt. Hierzu
werden die Peakflächen des jeweiligen Analyten gegen die Konzentration aufgetragen. Es folgt
zunächst eine Tabelle mit den gemessenen Peakflächen und im Anschluss die jeweiligen
Diagramme.

Tabelle 30: Peakflächen der Lösung

1-
Verdünnung Toluol Phenanthren Flouranthen Pyren
Methylnaphthalin
100 525579 2917485 2009198 1169407 925297
50 55839 1000220 789021 464589 374275
20 12045 415624 343958 208298 167247
10 12131 219442 164664 94826 76006

21
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HPLC 01.04.2021

600000

500000

400000
Peakfläche
300000

200000
y = 5808,2x - 109972
100000 R² = 0,8795

-100000
0 20 40 60 80 100 120
Konzentration mg/l

Abbildung 13: Grafik zu Toluol

3500000

3000000

2500000
Peakfläche

2000000

1500000
y = 30080x - 215405
1000000 R² = 0,9742

500000

0
0 20 40 60 80 100 120
Konzentration mg/l

Abbildung 14: Grafik zu 1-Methylnaphthalin

22
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HPLC 01.04.2021

2500000

2000000

1500000
Peakfläche

1000000
y = 20426x - 92473
R² = 0,9872
500000

0
0 20 40 60 80 100 120
Konzentration mg/l

Abbildung 15: Grafik zu Phenanthren

1400000

1200000

1000000
Peakfläche

800000

600000

y = 11860x - 49420
400000
R² = 0,988

200000

0
0 20 40 60 80 100 120
Konzentration mg/l

Abbildung 16: Grafik zu Flouranthen

23
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HPLC 01.04.2021

1000000
900000
800000
700000
600000
Peakfläche

500000
400000 y = 9371,7x - 36020
R² = 0,9895
300000
200000
100000
0
0 20 40 60 80 100 120
Konzentration mg/l

Abbildung 17: Grafik zu Pyren

In der folgenden Tabelle sind die Steigungen und Achsenabschnitte der Regressionsgeraden
tabelliert.

Analyten Steigung m Achsenabschnitt b

Toluol 5808,3 -109972
1-Methylnaphthalin 30080,0 -215405
Phenanthren 20426,0 -92473
Fluoranthen 11860,0 -49420
Pyren 9371,7 -36020

Die tabellierten Werte werden für die weiteren Berechnungen benötigt. Sie werden in der
folgenden Formel eingesetzt.

J<K
𝑥= L
(13)

In der folgenden Tabelle sind die Mittelwerte der berechneten Konzentrationen der jeweiligen
Analyten dokumentiert.

Tabelle 31: Konzentration der unbekannten Probe

Mittelwert
Analyten Mittelwert Peakfläche Konzentration
mg
(l)
Toluol 275430 28,4870
1-Methylnaphthalin 1691525 49,0731
Phenanthren 1335462,5 60,8533
Fluoranthen 570520,5 43,9376
Pyren 475480,5 46,8923

24
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HPLC 01.04.2021

VII. Fazit

Die angewandte Methode zur Bestimmung der Konzentration der unbekannten Substanzen
anhand der vorher bestimmten bekannten Peaks führt zu zufriedenstellenden Ergebnissen.
Theoretisch ist die Bestimmung der Zusammensetzung aller, mit der Säule interagierenden
Substanzen, nach dem Verfahren der HPLC möglich.

25