ELEKTROPHORESE Info PDF

ELEKTROPHORESE
Labor L 035
Unterlagen zur Übungsvorbereitung
ANDREA PFITZNER
Höhere Bundes- Lehr- und Versuchsanstalt für Chemie

Abteilung für Biochemie, Biotechnologie und Gentechnik
Dezember 2003
INHALTSVERZEICHNIS
PROTEIN-ELEKTROPHORESE................................................................................... 1
GRUNDLAGEN.......................................................................................................... 1
TRENNPRINZIPIEN .................................................................................................. 4
PROBEN .................................................................................................................... 6
PUFFER..................................................................................................................... 6
ELEKTROOSMOSE .................................................................................................. 6
GEL-ELEKTROPHORESE............................................................................................ 7
AGAROSE GELE....................................................................................................... 7
POLYACRYLAMID-GELE (PAG) .............................................................................. 8
AGAROSE-ELEKTROPHORESE............................................................................... 13
SDS-DISK-ELEKTROPHORESE................................................................................ 14
WIRKUNG VON SDS .............................................................................................. 15
DAS DISK-ELEKTROPHORESE-PRINZIP............................................................. 17
WAS PASSIERT WÄHREND DER ELEKTROPHORESE...................................... 17
WAS PASSIERT IM SAMMELGEL ......................................................................... 17
WAS PASSIERT IM TRENNGEL ............................................................................ 19
AUSWERTUNG VON SDS-GELEN ........................................................................ 20
ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG (IEF) .............................................................. 21
pH-GRADIENT DURCH FREIE TRÄGERAMPHOLYTE (POLYAMPHOLYTE)..... 22
VORFOKUSSIERUNG ............................................................................................ 22
PROBENAUFBEREITUNG ..................................................................................... 24
PROBENAUFTRENNUNG ...................................................................................... 25
AUSWERTUNG VON IEF-GELEN .......................................................................... 26
IMMOBILISIERTE pH-GRADIENTEN (IPG)............................................................... 27
AGAROSE-IEF ........................................................................................................ 28
2-D-ELEKTROPHORESE ........................................................................................... 28
SICHTBARMACHEN DER BANDEN.......................................................................... 33
LABORÜBUNG ........................................................................................................... 34
SICHERHEIT ........................................................................................................... 34
DURCHFÜHRUNG .................................................................................................. 35
SDS-DISK-ELEKTROPHORESE ............................................................................ 35
PRINZIPIELLER AUFBAU DES GELGIEßSTANDES ...........................................................35
PROBENVORBEREITUNG ...................................................................................................36
ELEKTROPHORESE und FÄRBEN ......................................................................................36
AUSWERTUNG.....................................................................................................................37
ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG.................................................................... 38
BESCHREIBUNG DES GELGIEßSTANDES.........................................................................38
BESCHREIBUNG DER RICHTIGEN VERWENDUNG DER GEL-TRÄGERFOLIE ............... 38
TECHNIK DES GIEßENS EINES IEF-GELS ......................................................................... 39
AUFTRAGEN DER PROBEN AUF DAS VORFOKUSSIERTE IEF-GEL ............................... 40
ELEKTROPHORESEBEDINGUNGEN .................................................................................. 41
FÄRBUNG ............................................................................................................................. 42
FRAGEN...................................................................................................................... 43
ABKÜRZUNGEN......................................................................................................... 45
LITERATUR................................................................................................................. 46
LINKS .......................................................................................................................... 46
PROTEIN-ELEKTROPHORESE
GRUNDLAGEN:
Unter Elektrophorese versteht man die Wanderung von positiv oder negativ
geladenen Molekülen im elektrischen Feld in einer Trägermatrix.
Für die theoretische Behandlung der Elektrophorese ist es gleichgültig, um welche

Stoffklasse es sich handelt, entscheidend ist, dass geladene Teilchen vorliegen!
Die Wanderungsgeschwindigkeit (v) eines Proteins wird bestimmt durch die Stärke
des elektrischen Feldes (E), die Ladung (Q), die das Protein nach außen trägt, und
durch seinen Reibungskoeffizienten (f) in dem vorgegebenen Medium, in welchem
die Elektrophorese durchgeführt wird:
Dieses Gesetz entspricht formal dem Ohmschen Gesetz für den Stromfluss in
elektrischen Leitern I = U / R (I = Strom, R = Widerstand). D. h.: Ein geladenes
Teilchen wandert umso schneller, je stärker das elektrische Feld ist und je größer die
Ladung ist, die es trägt. Die Reibung hemmt die Geschwindigkeit. Für die
Beweglichkeit oder Mobilität (u) gilt als Definition:
Ein Gemisch verschiedener Substanzen lässt sich daher im elektrischen Feld

trennen, wenn die einzelnen Komponenten sich in ihrer Ladung oder/und in ihrer
Gestalt unterscheiden (Parameter wie Größe und Form gehen in den
Reibungskoeffizienten f ein). Große Moleküle mit geringer Ladung wandern im
elektrischen Feld mit einer geringeren Geschwindigkeit als kleine, stark geladene
Teilchen.
© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 1

Proteine besitzen Ladungen und können daher im elektrischen Feld wandern.
Die Ladung eines Proteins ist vom pH-Wert abhängig.
Die Nettoladung eines Proteins ist die Summe aller negativen und positiven
Ladungen seiner sauren (Asparagin- und Glutaminsäure) und basischen (Arginin,
Lysin, Histidin) Aminosäure-Seitenketten, sowie des Amino- und des Carboxy-
Teminus.
Der isoelektrische Punkt (pI, IEP) eines Proteins ist der spezifische pH-Wert, an
dem seine Nettoladung Null beträgt.
Dieses Protein hat mehr saure als

basische Aminosäure-Seitenketten.
Um dieses Protein zu einer Gesamtladung

Null zu bringen, muss der pH-Wert
gesenkt werden.

Dieses Protein hat also einen IEP im
sauren Bereich, z.B. IEP=6,1
Senkt man den pH weiter, erhält das

Protein eine positive Gesamtladung, es
wird also zum Kation.
Bei pH<IEP ist ein Protein ein Kation.
Steigt der pH auf Werte über dem IEP,

erhält das Protein eine negative
Gesamtladung, es wird zum Anion.
Bei pH>IEP ist ein Protein ein Anion .
Unterwirft man eine Mischung von Proteinen einer Elektrophorese, kann man
erwarten, dass die verschiedenen Proteine mit unterschiedlicher Geschwindigkeit
wandern. Basierend auf diesen unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten
können die Probenkomponenten so (auf)getrennt werden.

Trägermedium (z.B. Gel, Folie, Papier) und Probenmaterial müssen mit Puffer
(Elektrolyt) gesättigt sein, damit Strom fließen kann. Der Stromfluss wird über den
Stromkreis durch Elektrolyse aufrecht erhalten, die an den Elektroden (in getrennten
Pufferreservoirs) stattfindet :
Kathode (– - Pol): 2 e- + 2 H2O → 2 OHÖ + H2 (basisch)
Anode (+ - Pol): H 2O → ½ O2 + 2 H+ + 2 e- (sauer)
Je nach Gelqualität und Pufferwahl können unterschiedliche Faktoren die Trennung

der Probenproteine beeinflussen (z.B. kann eine Trennung ausschließlich nach
unterschiedlichen IEPs erfolgen, das heißt Proteine mit identischen IEPs können mit
dieser Methode nicht getrennt werden).
TRENNPRINZIPIEN:
1) NATIVE ELEKTROPHORESE (ZONEN-ELEKTROPHORESE):
Die native Elektrophorese findet in einem homogenen Puffersystem statt, der pH-
Wert bleibt während der gesamten Elektrophorese konstant.
Das Protein wird in seiner nativen, unveränderten Form auf das Gel aufgetragen,
die Wanderungsgeschwindigkeit hängt von allen oben genannten Faktoren ab.
2) ISOTACHOPHORESE (ITP) = Gleichgeschwindigkeits-Elektrophorese :
Die elektrophoretische Trennung findet in einem diskontinuierlichen Pufferfeld

statt. Die ionisierten Protein-Proben wandern zw. einem schnellen Leitelektrolyten
(z.B. ClÖ-Ionen) und einem langsamen Folgeelektrolyten (z.B. Glycinat-
Zwitterionen). Dabei sortieren sich die verschiedenen Probenkomponenten nach
ihren elektrischen Mobilitäten auseinander. Die schnellste (elektrophoretisch
mobilste) Komponente wandert direkt hinter dem Leition, die langsamste
Komponente direkt vor dem Folgeion. Die Probenkomponenten bilden einen
„Stapel“ entsprechend ihren Mobilitäten = „STACKING EFFECT“ (= Stapeleffekt)
Dieses Prinzip wird im Sammelgel bei der SDS-DISK-Elektrophorese eingesetzt.

In diesem Fall dient der stacking-effect der Erzeugung schmaler Probenbanden.
Dies garantiert scharfe Probenbanden im anschließenden Trenngel.
Die ITP wird hauptsächlich für quantitative Analysen eingesetzt.

3) ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG (IEF):
In diesem Fall findet die Elektrophorese in einem pH-Gradienten statt. Die

Proteine wandern je nach ihrer (pH-abhängigen!) Ladung zu Anode oder Kathode
und passieren auf ihrer Wanderung über den im Gel eingebetteten pH-Gradienten
jenen pH-Wert, bei dem sie nach außen ungeladen sind (IEP). Ohne Ladung
erfolgt keine weitere Wanderung mehr im elektrischen Feld. Wenn die
ungeladenen Moleküle durch Diffusion wieder wegwandern, werden sie durch den
anderen pH-Wert wieder geladen und wandern wieder zurück zu ihrem IEP. Das
ergibt einen Konzentrierungseffekt = FOKUSSIERUNG.
Man verwendet diese Methode für die qualitative Charakterisierung von

Proteinproben z.B. Bestimmung des IEP eines Reinstoffes, Identifizierung einer
Gewebeprobe anhand identischer Bandenmusters mit Referenzgeweben,
Reinheitsprüfung.
Legende: L- …. Leition (leading ion)

T- …. Folgeion (teminating (trailing) ion)

PROBEN:
Ein wichtiges Kriterium zur Auswahl der geeigneten Elektrophorese-Methode ist die
Art der Probensubstanz, die analysiert werden soll. Die Probenlösungen dürfen keine
festen Partikeln oder Fetttröpfchen enthalten, weil diese die Trennung stören, indem
sie die Poren der Matrix verstopfen.
Proteine sind teilweise gegenüber bestimmten pH-Werten oder Puffersubstanzen

empfindlich, es können Konfigurationsänderungen, Denaturierungen,
Komplexbildungen und zwischenmolekulare Wechselwirkungen auftreten.
Die Art des stabilisierenden Mediums z.B. eines Gels, muss von der Größe des
Probenmoleküls abhängig gemacht werden.
PUFFER:
Die elektrophoretische Trennung von Substanzgemischen erfolgt bei einem genau

eingestellten pH-Wert und bei konstanter Ionenstärke des Puffers. Die Ionenstärke
des Puffers wird möglichst niedrig gewählt, weil die ionischen Pufferkomponenten
ihrerseits im elektrischen Feld wandern und damit den Probenmolekülen „den Strom
wegnehmen“, die Wanderungsgeschwindigkeit der Probenmoleküle sinkt also mit
steigender Ionenstärke des Puffers. Es ist daher keinesfalls ratsam, beim pH-
Einstellen des Puffers mehrmals mit HCl bzw. NaOH korrigierend „übertitrierte“ Puffer
zurückzustellen, weil dadurch im Puffer störende zusätzliche Ionenstärke erzeugt
wird.
Es ist aber eine Mindest-Pufferkapazität erforderlich, damit der pH-Wert der

Probesubstanzen keinen Einfluss auf die Elektrophorese-Bedingungen nimmt.
ELEKTROOSMOSE:
Elektroosmose tritt auf, wenn statische Teile (z.B. Trägerfolie, Oberfläche der
Trennaparatur, Glasplatten etc.) od. Gelmaterial ebenfalls Ladungen tragen. Dann
wandert auch H2O und transportiert gelöste Substanzen mit. Dies führt zur
Überlagerung der elektrophoretischen und der elektroosmotischen Bewegung und
verschlechtert dadurch die Trennleistung.

GEL-ELEKTROPHORESE
Bei der Gelelektrophorese besteht die Trägermatrix aus Gel (z.B. Stärke, Agarose
Polyacrylamid).
Die Wanderung von Makromolekülen in solchen Gelen wird zusätzlich von der
Struktur des Gels beeinflusst. Durch die Porösität der Gelmatrix wird ein
Molekülsiebeffekt erreicht, der die Molekülgröße als Kriterium der
Wanderungsgeschwindigkeit im Vergleich zur Ladung stärker berücksichtigt und
damit eine verbesserte Auftrennung nach der Teilchengröße ermöglicht.
Unabhängig davon, welches Polymer als Matrix verwendet wird, kann der
Vernetzungsgrad variiert und damit die Maschenweite der Gele der Größe der zu
trennenden Moleküle angepasst werden.
GELE :
AGAROSE GELE:
Agarose-Gele sind mehrere Millimeter dick und haben große Poren. Sie werden für
große Moleküle (ab 10 nm Durchmesser) verwendet wie Nucleinsäuren (DNA, RNA)
und große Proteine. Die Porengröße wird von der Agarosekonzentration bestimmt.
Agarose ist ein Polysaccharid und wird aus roten Meeresalgen hergestellt. Durch
Entfernen des Agaropektins erhält man unterschiedliche Elektroosmose- und
Reinheitsstufen. Die Charakterisierung erfolgt durch die Schmelztemperatur (35°C bis
95°C) und den Grad der Elektroosmose (mr-Wert). Agarose LE (low
electroendoosmose) ist sehr teuer!
Die Gelherstellung ist relativ einfach: Agarose wird in Wasser bzw. Puffer unter
Erhitzen gelöst (ACHTUNG: Siedeverzug!), die heiße Lösung wird in das Gelbett
gegossen und erstarrt beim Abkühlen.

POLYACRYLAMID-GELE (PAG):
PAG sind dünner als Agarosegele, meist 0,5-2 mm dick. Sie werden für die
Auftrennung von Proteinen sowie für die DNA-Sequenzierung eingesetzt.
PAG entstehen durch chemische Kopolymerisation des Monomers Acrylamid mit

dem Vernetzer N,N´-Methylenbisacrylamid (Bis). Während die Polymerisierung der
Acrylsäureamid-Moleküle lineare Polymere ergibt, führt das Vorhandensein von N,N´-
Methylenbisacrylamid im Polymerisationsansatz zur Quervernetzung des Gels und
damit zu einer porösen Gelsubstanz. Die Acrylamidkonzentration im
Polymerisationsansatz bestimmt die Länge der Polyacrylamidketten, die
Bisacrylamidkonzentration den Vernetzungsgrad.
Die Polymerisation wird gestartet durch Zugabe von APS

(Ammoniumperoxodisulfat) als Radikalbildner und TEMED (N,N,N´,N´-
Tetramethylethylendiamin) als Katalysator.
TETRAMETHYLETHYLENDIAMIN (TEMED)

APS bildet in Wasser freie Radikale, welche die Polymerisation starten.
S2O82- → 2 SO4Ö•
Die Polymerisation erfolgt unter Luftausschluss, da O2 als Radikalfänger wirkt.

Manche Arbeitsvorschriften sehen aus diesem Grund ein Entgasen der
Reaktionslösungen vor der Zugabe von APS und TEMED vor, um gelösten Sauerstoff
aus den Reaktionslösungen zu entfernen. Will man dieses Entgasen unterlassen,
muss man für die Polymerisation entsprechend mehr APS und TEMED (1,5-2fache)
einsetzen. Zu schnelle Polymerisation (als Folge zu hoher APS- bzw. TEMED-
Dosierung) kann sich allerdings negativ auf die Homogenität des Geles auswirken.
Inhomogene Gele liefern schlechte bis keine Trennung und sind meist nicht
auswertbar.

Die Porengröße der Polyacrylamidgele wird bestimmt durch
Totalacrylamidkonzentration T und Vernetzungsgrad C (crosslinking) und lässt
sich dadurch exakt und reproduzierbar einstellen. Das Verhältnis der beiden
Substanzen zueinander bestimmt die Eigenschaften des resultierenden Gels,
insbesondere Porengröße und Elastizität.
Bei konstantem C und steigendem T wird die Porengröße kleiner. Bei konstantem T
und steigendem C folgt die Porengröße einer parabolischen Funktion: bei hohen und
niedrigen C-Werten erhält man große Poren, die kleinsten Poren erhält man bei
4-5%C. Üblicherweise werden für Standardanwendungen Verhältnisse von 37,5:1
(Acrylamid:Bisacrylamid) verwendet. Die Dichte bzw. Festigkeit des Gels wird zudem
durch den Gesamtgehalt der beiden Substanzen im Ansatz bestimmt. Je nach Größe
der zu trennenden Substanzen kann man dabei zwischen 4%T (bis 1000kDa) und
20%T (5kDa) variieren. Konzentrationen außerhalb dieses Bereiches sind theoretisch
zwar einsetzbar, aber praktisch kaum zu handhaben.
Zur Charakterisierung der Gelqualität sind T- und C-Wert immer anzugeben.

Gradientengele entstehen durch Variation des T-Werts über die Gelstrecke. Diese Gele
werden im Verlauf der elektrophoretischen Trennstrecke immer engporiger. Auf ihrer
Wanderung durch das immer engporiger werdende Gel gelangen die Proteinmoleküle mit
der Zeit an einen Punkt, wo sie aufgrund ihrer Größe stecken bleiben.
Abb.: Gießen eines Gradientengels
Die nächste Abbildung zeigt das Schema einer Gelelektrophorese. Das Gel befindet
sich hier zwischen 2 Glasplatten, die Aussparungen am oberen Rand sind die
Probentaschen, in welche Proben und Standards unter den Elektrophoresepuffer
unterschichtet werden (in diesem Fall müssen die Proben durch Zugabe von Glycerin
beschwert werden, damit sie unter den Puffer sinken).

Obere und untere Pufferkammer werden mit Puffer gefüllt und Gleichstrom angelegt.
Den Proben oder dem Kathodenpuffer wird zur Sichtbarmachung der Lauffront der
Farbstoff Bromphenolblau zugesetzt.
Nach dem Abschalten des Stromes wird das Gel von den Glasplatten gelöst. die
aufgetrennten Proteine sind zu diesem Zeitpunkt normalerweise noch nicht sichtbar
(Ausnahme: vorgefärbte (prestained) Standardsubstanzen sind bereits während der
Elektrophorese sichtbar und erlauben so eine online-Kontrolle des
Elektrophoreseablaufs).
Je nach Anwendung werden die Proteine nach der Auftrennung angefärbt und
dadurch sichtbar gemacht. Erst dann erscheinen die hier bereits blau eingezeichneten
Probenbanden.

AGAROSE-ELEKTROPHORESE
Agarosegele sind meist dicker als Acrylamidgele (1-10 mm). Dünne Agarosegele
werden zur mechanischen Stabilisierung auf die hydrophile Seite spezielle
Trägerfolien (Gel Bond Film) gegossen.
Für die Protein-Elektrophorese sind Agarose-Gele wegen ihrer großen Poren

besonders geeignet zum immunologischen Proteinnachweis (z.B. Immunfixation,
Immunelektrophorese, Rocket Elektrophorese). Diese Techniken werden im Kapitel
Immunologie besprochen.
Elektrophorese von Nucleinsäuren erfolgt horizontal in einer puffergefüllten

Elektrophoresekammer.
Nucleinsäuren sind wegen des hohen Phosphatanteils negativ geladen, die Proben
werden daher kathodenseitig aufgetragen und wandern nach Anlegen eines
Stromfeldes zur Anode. Die Auftrennung erfolgt in der Regel nach Fragmentgröße,
die kürzesten Nucleinsäuren wandern am schnellsten.
! ACHTUNG !: Puffer und Gele können kanzerogenes Ethidiumbromid enthalten.

SDS-DISK-ELEKTROPHORESE
Die SDS-DISK-Elektrophorese trennt Proteingemische ausschließlich nach

unterschiedlichen Molekülgrößen auf. Sie kann zur Bestimmung der Molmasse
(Größe) eines Proteins sowie zur Bestimmung der Reinheit eingesetzt werden. Unter
bestimmten Bedingungen kann auch der Vergleich kompletter Bandenmuster mit den
Bandenmustern bekannter Vergleichsproben (Standards) zur Gewebsidentifikation
herangezogen werden. Die SDS-DISK-Elektrophorese ist außerdem die Grundlage
der Western-Blot-Technologie zum immunolgischen Nachweis von Proteinen.
SDS (Sodiumdodecylsulfat (Natriumlaurylsulfat) CH3-(CH2)11-SO4-Na+ ) ist ein

anionisches Detergens, das sich mit seinem hydrophoben „Schwanz“ an die
hydrophoben Regionen der Proteine anlagert, der hydrophile “Sulfat-Kopf“ des
Tensidmoleküls ragt in die Lösung und verleiht dem Protein eine negative Ladung.
Es binden etwa 1,4 g SDS/g Protein. Diese Bindungsrelationen sind weitestgehend

unabhängig von der Primärstruktur. Die Menge SDS, die an ein Proteinmolekül
bindet, steht damit in einer direkten linearen Proportion zu seinem Molekulargewicht
(je größer das Molekül, desto mehr SDS und desto größer die negative
Gesamtladung des Proteins nach der SDS-Behandlung).
DISK = diskontinuierlich: bei der SDS-DISK-Elektrophorese werden 2 verschiedene

Gele direkt aneinander gegossen, die sich in pH-Wert und Porengröße
unterscheiden. Die Proben wandern durch das Sammelgel, in dem die Fokussierung
auf eine scharfe Probenbande stattfindet, weiter ins Trenngel, in dem die Trennung
nach Proteingröße erfolgt.

WIRKUNG VON SDS
Durch den Zusatz von SDS im Überschuss zu Proteinlösungen werden:
5 die individuellen Ladungsunterschiede der Proteine überdeckt

5 der Einfluss der Eigenladung des Proteins auf die Wanderungsgeschwindigkeit
ausgeschalten
5 die Proteine zu starken Anionen
5 die Wasserstoffbrücken gespalten
5 die Proteinketten gestreckt (Aufhebung der Tertiärstuktur) und zu Ellipsoiden
umgeformt
5 Aggregatbildungen von Proteinen verhindert
5 die Untereinheitenstrukturen der Proteine aufgelöst (Quartärstruktur wird zerstört)
Um eine vollständige Entfaltung des Proteins und damit ein totales Ausschalten des
Einflusses der Form auf die Wanderungsgeschwindigkeit zu erreichen, wird die Probe
zusätzlich auch mit Mercaptoethanol (ME) oder Dithiotreitol (DTT) behandelt. ME
und DTT spalten die Disulfidbrücken der Proteine auf, es entstehen freie SH-Gruppen
und die Proteinkette kann sich vollständig entfalten.

Noch besser und dauerhafter geschützt werden die SH-Gruppen durch
anschließende Alkylierung mit Jodacetamid. Dadurch erhält man schärfere Banden.
Zudem verhindert man bei Silberfärbung auftretende Artefaktlinien, weil Jodacetamid
das überschüssige DDT abfängt.
Als Folge der Probenbehandlung mit SDS/DTT (Probenpuffer, sample buffer,

treatment buffer) werden die Proteinoberflächen mit negativen Ladungen abgesättigt.
SDS bricht Wasserstoffbrückenbindungen auf, die Proteinuntereinheiten dissoziieren
auseinander, die Proteine werden stark negativ geladen und entfaltet. Der Einfluss
der Eigenladung und der Form des Proteins auf die Wanderungsgeschwindigkeit wird
damit ausgeschaltet, die Mobilität der Proteine im elektrischen Feld ist nur mehr von
der Molekülgröße (und der Feldstärke) abhängig. Dies ermöglicht die Bestimmung
der Molmasse (Größe) der Probenproteine.
Unter diesen Umständen ergibt sich im diskontinuierlichen System eine lineare

Beziehung zwischen dem Logarithmus des Molekulargewichts und der Laufstrecke
der Polypeptide im Bereich von ca. 10 bis 200 kDa. Die kleinsten Proteine wandern
am schnellsten und zeigen daher die größten Laufstrecken bzw. Rf-Werte.
Mit der SDS-PAGE kann nicht das Molekulargewicht multimerer nativer Proteine
bestimmt werden kann, sondern grundsätzlich nur die Molekülgröße der
Proteinuntereinheiten.

DAS DISK-ELEKTROPHORESE-PRINZIP
Das Trennvermögen der diskontinuierlichen Elektrophorese beruht auf der

Kombination eines Molekularsiebeffektes (durch die Porösität des Gels) und eines
Konzentrierungseffektes (durch unterschiedliche Puffersysteme). Das typische Disk-
Elektrophoresesystem wird aus 2 verschiedenen Gelen zusammengesetzt:
1) SAMMELGEL (Stacking Gel) in dem die Konzentrierung der Probe erfolgt: Das
Sammelgel ist großporig, der Molekülsiebeffekt kommt hier also nicht zum
Tragen. Der pH des Sammelgels ist etwa 6,8, er liegt in der Nähe des pI des
Folgeions (z.B. Glycin, Tricin). Im Sammelgel soll das Folgeion nur eine
schwache bis keine Ladung tragen.
2) TRENNGEL (Seperating Gel) in dem die Auftrennung der Probenkomponenten

nach dem Molekulargewicht erfolgt. Das Trenngel ist engporig, die
Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine ist umso größer, je kleiner die Proteine
sind, Der pH-Wert des Sammelgels ist 8,8.
Der ELEKTRODENPUFFER (Tank Buffer) ist für beide Elektroden gleich. Er enthält
Chlorid als Leition (aus dem TRIS/HCl-Puffer) und Glycin (oder Tricin) als Folgeion.
WAS PASSIERT WÄHREND DER ELEKTROPHORESE?
Im Elektrodenpuffer (pH 8,8) liegt Glycin mit IEP=6,0 aufgrund pH>IEP als Anion vor.
Wird der Strom eingeschaltet, beginnen die Glycinat-Anionen in Richtung Anode und
damit ins Gel hinein zu wandern. Die Proteine liegen infolge SDS-Sättigung sowieso
als Anionen vor und wandern daher ebenfalls Richtung Anode.
WAS PASSIERT IM SAMMELGEL?
Nach dem Eintritt in das Sammelgel verschiebt sich das Glycin-Ionengleichgewicht

infolge des niedrigeren pH von 6,8 in Richtung ungeladenes Zwitterion, die Mobilität
von Glycin nimmt also stark ab, die Glycin-Moleküle werden zu den langsam
wandernden Folgeionen.
Glycinat-Zwitterion Glycinat-Anionen
bei IEP=6,0 bei pH > IEP

Die im Puffer vorhandenen Chlorid-Ionen sind auch bei niedrigerem pH starke
Anionen und wandern daher rasch Richtung Anode, sie übernehmen die Rolle der
rasch wandernden Leitionen. Zwischen Leit- und Folgeionen wandern die ebenfalls
stark negativ geladenen Proteinmoleküle als dichter Stapel (stack) in der
Reihenfolge ihrer Ladung, die Proteingröße ist infolge der großen Poren im
Sammelgel noch kein Wanderungshindernis.
Hinter den vorauswandernden Cl--Ionen entsteht eine Zone, in der ein Mangel an
Ladungsträgern herrscht (weil Glycin-Zwitterionen nicht wandern). Die Folge dieses
Mangels an Ladungsträgern wäre eine Herabsetzung des Stromflusses. Die externe
Spannungsquelle (power supply) zwingt das System aber, weiter Strom fließen zu
lassen, also Ladung zu transportieren.
Um konstanten Stromfluss im gesamten elektrischen System aufrechtzuerhalten,

kommt es zu einer lokalen Erhöhung der Feldstärke in jenen Bereichen, in denen
weniger Ladungsträger vorhanden sind, d. h. die Feldstärke wird im Bereich des
„Stapels“ nach hinten zu immer höher. Dadurch steigt die relative Beweglichkeit aller
Ionen, je weiter sie hinten (vor dem Folgeion) sind.
Dieser Feldstärkegradient bewirkt ein Abbremsen der Proteine, wenn sie sich der
Chloridfront (und damit Bereichen niedriger Feldstärke) nähern und eine
Beschleunigung, wenn sie an das Ende des „Stapels“ in die Nähe des Folgeions
(Bereich hoher Feldstärke) zurückfallen. Es bildet sich in der Reihenfolge der Mobilität
ein Stapel unmittelbar aufeinander folgender Molekülschichten = Stapeleffekt
(„stacking effect“).
Die schnelle Wanderung am hinteren Ende des Stapels und die starke
Verlangsamung an der Chlorid-Front führen zu einer Konzentrierung der
Substanzen in einer schmalen Bande zwischen dem Chlorid- und dem Glycinat-Ion.
Die Aufgabe des Sammelgels ist also, wie der Name schon sagt, die Konzentrierung
(Sammlung) der Probenkomponenten zu einer scharfen Bande, die als solche dann
ins Trenngel eintritt. Breite Banden würden bei der anschließenden Trennung im
Trenngel schlecht bis nicht auswertbare diffuse Flecken ergeben.

WAS PASSIERT IM TRENNGEL?
Der Proteinstapel tritt als schmale, gesammelte Bande in das Trenngel ein. Dort
herrscht ein anderer pH-Wert und die Porengröße ist wesentlich kleiner als im
Sammelgel. Durch den höheren pH-Wert von 8,8 wird Glycin wieder zum Anion und
wandert, da es sehr klein ist, am Proteinstapel vorbei und gemeinsam mit den kleinen
Chlorid-Ionen vorne weg Richtung Anode. Somit besteht ab hier wieder eine
konstante Feldstärke im gesamten Gel, es existiert kein Stapeleffekt mehr.
Die infolge SDS-Sättigung negativ geladenen Proteinmoleküle werden beim Eintritt

ins Trenngel wegen der kleineren Poren verlangsamt. Im engeren Maschennetz des
Trenngels werden die Proteine jetzt nach Molekülgröße aufgetrennt.

AUSWERTUNG VON SDS-GELEN:
Lässt man in einer Probentasche einen Proteinstandard (Molmarker) mit bekannten

Molekulargewichten mitlaufen, kann über eine Eichgerade log MM gegen Laufstrecke
die Molmassen der Probenkomponenten bestimmen.

ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG (IEF)
Wie bereits in der Einleitung beschrieben, erfolgt die Auftrennung der Proteine in der
IEF nach den Isoelektrischen Punkten, d.h. Proteine mit gleichem IEP können mit
dieser Methode nicht voneinander getrennt werden und erscheinen als eine einzige
Probenbande im Gel.
Proteine sind Ampholyte, ihre Ladung ist vom pH-Wert abhängig (siehe Seite 1-2).
Der isoelektrische Punkt (pI, IEP) eines Proteins ist der spezifische pH-Wert, an
dem seine Nettoladung Null beträgt.
Bei der IEF werden native Proteine in einem pH-Gradienten elektrophoretisch

aufgetrennt.
Grundvoraussetzung zur Erzielung hochauflösender und reproduzierbarer

Trennergebnisse ist ein stabiler und kontinuierlicher pH-Gradient mit gleichmäßiger,
konstanter Leitfähigkeit und Pufferkapazität.
Es gibt zwei verschiedene Konzepte, die diese Anforderungen erfüllen: pH-

Gradienten, die erst nach Anlegen eines elektrischen Feldes durch amphotere Puffer,
die Trägerampholyte (Polyampholyte), gebildet werden oder immobilisierte pH-
Gradienten, bei welchen die puffernden Gruppen kovalent an die Trägermaterialien
gebunden sind. Letztere liefern stabilere pH-Gradienten und daher auch Ergebnisse
höherer Reproduzierbarkeit.

pH-GRADIENT DURCH FREIE TRÄGERAMPHOLYTE (POLYAMPHOLYTE):
Im elektrischen Feld wird durch Einbettung der Polyampholyte in die Gelmatrix ein
pH-Gradient aufgebaut.
Als Trägerampholyte fungieren aliphatische Polyaminopolycarbonsäuren folgender

Grundstruktur:
Diese Trägerampholyte sind niedermolekular und haben an ihrem IEP hohe

Pufferkapazität, hohe und gleichmäßige Leitfähigkeit und gute Löslichkeit. Diese
Eigenschaften haben Proteine, die ja auch amphotere Stoffe sind, nicht!
Die Polyampholyte werden vor der Polymerisation in die Monomerlösung gemischt.

Beim Gießen des Gels werden sie somit homogen über das gesamte Gel verteilt.
VORFOKUSSIERUNG:
Vor dem Anlegen einer Spannung hat das Gel einen einheitlichen Durchschnitts-pH-
Wert in Abhängigkeit von der eingemischten Ampholytmischung (z.B. Polyampholyte
pH 3-10). Fast alle Ampholyte sind bei diesem pH geladen: die mit höherem pI
positiv, die mit niedrigerem pI negativ.
Beim Anlegen des elektrischen Feldes beginnen die Trägerampholyte in Abhängigkeit

von ihrer Ladung zu wandern: Amph.1 mit niedrigstem pI ist negativster und wandert
daher am schnellsten Richtung Anode. An der Anode entstehen infolge der
Anodenreaktion H+
Anode (+ - Pol) : H 2O → ½ O2 + 2 H+ + 2 e- (sauer)
Kathode (– - Pol) : 2 e- + 2 H2O → 2 OHÖ + H2 (basisch)
d.h. die unmittelbare Anodennähe ist sehr sauer, der sich nähernden Amph.1 wird
daher in der Nähe der Anode ladungsneutralisiert (nach außen ungeladen) und
wandert daher nicht mehr im elektrischen Feld, er bleibt an dieser Stelle stehen, in

seiner Umgebung herrscht (wegen der hohen Pufferkapazität der Ampholyte) der pH,
der seinem pI entspricht = pI1 .
Der unmittelbar nachfolgende, etwas geringer negativ geladenen Amph.2 wird

seinerseits von dem um Amph.1 aufgebauten pH neutralisiert und bleibt etwas weiter
weg von der Anode stehen, in seiner Umgebung wird pH=pI2 aufgebaut .
Analoges passiert mit Ampholyten hoher pI, diese wandern zur Kathode, die
Kathodenreaktion ist basisch und führt daher zur Ladungsneutralisation des sich
nähernden basischen Ampholyten usw. .
Weil Trägerampholyte niedermolekular sind, haben sie im Gel eine hohe

Diffusionsrate. Daraus resultiert, dass sie von ihren pIs wieder wegdiffundieren.
Sobald sie den pH-Bereich, der ihrem pI entspricht, verlassen, werden sie aber
wieder elektrisch geladen und durch das angelegte Stromfeld dazu gezwungen, an
den Platz der Ladungsneutralität zurückzuwandern = FOKUSSIERUNG.
Je mehr verschiedene Ampholyte man ins Gel einmischt, umso glatter wird der pH-
Gradient. Die auf dem Markt erhältlichen Ampholyt-Präparate enthalten 600-700
homologe Substanzen im pI-Bereich 3-10 (und sind sehr teuer). Sie werden zu
2-3%(w/v) in die IEF-Gele gemischt.

PROBENAUFBEREITUNG:
Ziel ist es, eine hohe Auftrennung des Proteingemisches in der Elektrophorese zu
erreichen. Jedes Protein sollte im Idealfall am Ende der Elektrophorese eine eigene
Bande bilden. Für diese hohe Auflösung ist es wichtig die Tertiärstruktur eines
Proteins zu zerstören, um die Ladungsträger im Inneren eines Proteins „sichtbar“ zu
machen, denn nur so kann die Nettoladung bestimmt werden.
Da jedes Fremdion einen pH-Gradienten beeinträchtigt, werden zur Denaturierung

nur nichtionische Agenzien verwendet. Man verwendet routinemäßig Urea
(Harnstoff). Er liegt im Probenpuffer (oder Lysispuffer) in beinahe gesättigter Form
vor (9,8 M). Da es sich dabei um ein nichtionisches Agens handelt, bleibt es bei der
Elektrophorese am Startpunkt liegen und die Proteine würden sich im Laufe der IEF
renaturieren. Urea und andere Reagenzien müssen daher auch im Gel in hoher
Konzentration vorliegen.
Salze in einer Konzentration von 10 mM und höher sind „tödlich“ für den pH-
Gradienten. Andererseits präzipitieren viele Proteine unterhalb einer gewissen
Salzkonzentration und sind dann auch nicht mehr in Lösung zu bringen. In diesem
Bereich befindet man sich also auf einer Gratwanderung, die Proteine sollen in
Lösung bleiben, aber die Salzkonzentration darf den pH-Gradienten nicht zerstören.
Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Temperatur: Sie soll in allen Schritten von der
Probenaufbereitung bis zum Ende der Elektrophorese 35°C nicht überschreiten, da
sonst der pH-Gradienten zerstört werden kann.
Das Proteingemisch wird am basischen Ende der IEF aufgetragen. Der

Kathodenpuffer ist routinemäßig Natronlauge (0,02 M NaOH, pH 10). Kämen die
Proteine in direkten Kontakt mit dem Kathodenpuffer, so würden sie präzipitieren und
nicht ins Gel einwandern, sondern an der Oberfläche des Gels steckenbleiben.
Darum ist es wichtig die Proteine (im Lysispuffer) vor dem Kathodenpuffer zu
schützen. dazu wird eine geringe Menge an Schutzpuffer (Overlaybuffer) über der
Probe aufgetragen. Der Schutzpuffer ist so wie der Lysispuffer zusammengesetzt, hat
aber eine geringere Konzentration an Urea. Er ist dadurch leichter und lässt sich
relativ problemlos auf die Probe aufsetzen.

PROBENAUFTRENNUNG:
Nach der Vorfokussierung werden die Proben (und ein IEF-Standard) aufs Gel
aufgetragen und neuerlich Strom angelegt. Die in Abhängigkeit vom Auftragspunkt
(pH) und IEP geladenen Probenkomponenten wandern nun über das Gel, bis sie an
jenen pH gelangen, der ihrem IEP entspricht. Dort werden sie ladungsneutralisiert
und wandern daher nicht mehr im elektrischen Feld. Verlassen sie den Platz ihres
IEPs infolge Diffusion, werden sie wieder geladen und elektrophoretisch wieder
zurücktransportiert, sie fokussieren also am pH-Wert ihres IEP.
Trägerampholyt-Gradienten beginnen bei langen Laufzeiten in beide Richtungen zu

driften (diese Drift erfolgt besonders stark in Richtung Kathode), dabei entsteht in der
Mitte ein Plateau mit Leitfähigkeitslücken (Plateauphänomen bzw. kathodische
Drift).

AUSWERTUNG VON IEF-GELEN:
Die Auswertung erfolgt über mitgelaufene Standardproteine bekannter IEPs (pI-

Marker). Es wird eine Eichgerade pH gegen Laufstrecke erstellt.

IMMOBILISIERTE pH-GRADIENTEN (IPG):
IPG-Gele werden durch Kopolymerisation von Acrylamid-Monomeren mit puffernden

Säuren bzw. Basen, sogenannten Immobilinen, hergestellt. Weil der Gradient fest an
die Gelmatrix gebunden ist, bleibt er über die gesamte Trennzeit unverändert, es tritt
keine kathodische Drift auf. Außerdem gibt es keine verzogenen Iso-pH-Linien, der
Gradient wird durch die Proteine und Salze in den Proben nicht beeinflusst.
Abb.: Schema eines Polyacrylamid-Gels mit kopolymerisierten

Immobilinen
Um einen bestimmten pH-Wert zu puffern, braucht man mindestens ein saures und
ein basisches Immobiline. Ein pH-Gradient wird durch kontinuierliches Verändern des
Immobiline-Mischungsverhältnisses hergestellt.
In der Praxis werden immobilisierte pH-Gradienten durch lineares Mischen von zwei
verschiedenen Polymerisationslösungen mit einem Gradientenmischer hergestellt
(siehe auch Gradientengele).
Immobilisierte pH-Gradienten kann man exakt vorausberechnen und dem

Trennproblem anpassen. Man kann so hoch auflösende Gele mit sehr flachen pH-
Gradienten bis zu 0,01 pH-Einheiten pro cm herstellen.

AGAROSE-IEF:
Es gibt eine Reihe von Gründen für die Verwendung von Agarose als Trennmedium:
5 man benötigt keine toxische Monomerlösung

5 es gibt keine Katalysatoren, die die Trennung stören könnten
5 man muss keine Polymerisationslösung ansetzen und lagern
5 die Matrix ist großporig, deshalb ergeben sich kürzere Trennzeiten
5 die Färbezeiten sind kürzer
5 man kann im Gel die Immunfixation durchführen
Bei Agarose gibt es allerdings auch einige Probleme:
5 Die Gele sind nicht absolut elektroosmosefrei, weil beim Reinigen der Agarose
nicht alle Carboxyl- und Sulfatgruppen entfernt werden können.
5 Aus diesem Grund können auch keine extremen pH-Bereiche in Agarose-Gelen
verwendet werden.
5 Harnstoffgele sind schwierig herzustellen, weil der Harnstoff die Agarosestruktur
unterbricht.
2-D-ELEKTROPHORESE
Während die Genomwelle allmählich abebbt, ist bereits eine neue Welle im
Entstehen: Proteomics. Hierbei geht es um die Aufklärung der Proteinmuster eines
Organismus, da die Anzahl und Struktur der Proteine sehr viel komplexer als die
jenige der Gene ist.
Unter Proteomics versteht man die Analyse aller Proteine (Proteom) einer Zelle,
eines Organismus oder einer biologischen Flüssigkeit. Es handelt sich um einen
Prozess, der eine streng kontrollierte Probenaufbereitung, die Technik der 2D-
Elektrophorese, Analyse der Gele, Identifikation der Proteinspots und
Datenbank-Recherchen umfasst.
Das Herzstück der „Proteomics“ ist die 2D-Elektrophorese. Bei dieser Technik werden
die Proteine in zwei voneinander unabhängigen Schritten getrennt: in der
1. Dimension, der isoelektrischen Fokussierung (IEF), nach ihrem

isoelektrischen Punkt (pI), und in der 2. Dimension, einer SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese (SDS-PAGE), nach ihrem Molekulargewicht (MW). Jeder Spot auf
dem hierbei entstehenden Gel stellt ein bestimmtes Protein in der Probe dar. Es
können Tausende von Proteinen getrennt und Informationen über ihren pI, ihr MW
und ihre Menge in der Probe gewonnen werden. Die anschließende Identifikation der
Proteine eröffnet viele verschiedene Möglichkeiten; im medizinischen Bereich
beispielsweise die Entwicklung von speziellen Inhibitoren oder Arzneimitteln.
Das wirkliche Leben, Funktionieren und Reagieren einer Zelle oder eines Organismus
findet auf der Proteinebene statt. Die Technik, mit der sich hunderte und, heutzutage
weiterentwickelt, tausende Proteine eines Zelltyps in einem einzigen Experiment
analysieren lassen, die 2-dimensionale Elektrophorese, wurde gleichsam mit den
Proteinen nach 2 Jahrzehnten wieder entdeckt. Gleichzeitig wurden aber auch die
Limitierungen dieser Technik deutlich. Sie begründen sich zum einen darauf, dass
Proteinspots aus 2-D Gelen einen sehr geringen Proteingehalt haben, der für
analytische Techniken zur Identifizierung des Proteins wie Edman-Sequenzierung
oder Aminosäureanalyse meist nicht ausreichte. Ein weiterer Grund bestand in der
geringen Reproduzierbarkeit eines 2D-Musters, wenn eine Proteinprobe in
verschiedenen Laboratorien aufgetrennt wurde. Aber selbst mit ein und demselben
Gelsystem waren Unterschiede der Muster nicht völlig zu vermeiden.
Die Analyse, der Vergleich der Muster, enthält Elemente qualitativer ja/nein
Information, der Grossteil der erzielten Daten ist jedoch von quantitativer Natur. Der
Vergleich von 2D-Mustern zur Ermittelung von Spotvolumina erfordert
computergestützte Spoterkennung mit zeitaufwendiger Editierung einzelner Spots,
besonders in Regionen hoher Spotdichte, sowie zeitaufwendigem Zuordnen der
entsprechenden Spots verschiedener Gele (Spotmatching).
Für die Durchführung der 2D-Elektrophorese sind heute zwei unterschiedliche

technische Systeme in Gebrauch. Sie unterscheiden sich in der Durchführung der
isoelektrischen Fokussierung, d.h. der Trennung der Proteine aufgrund ihres
Isoelektrischen Punktes in der ersten Dimension.

Nach dem ursprünglichen Verfahren werden für den Aufbau des pH-Gradienten
freibewegliche Trägerampholyte (carrier ampholytes, CA-Technik) verwendet, nach
dem neueren Verfahren immobilisierte pH-Gradienten (Immobiline, IPG-Technik).
Beide Techniken haben Vor- und Nachteile. Bei der IPG-Technik kann sich der pH-
Gradient nicht durch Kathodendrift verschieben, was einen Vorteil im Hinblick auf die
Reproduzierbarkeit der Trennung darstellt. Der Transfer der isoelektrisch fokussierten
Proteine aus dem 1D-Gel in das 2D-Gel ist jedoch dadurch erschwert, dass die
Immobiline nicht mit den Proteinen aus dem 1D-Gel herauswandern können. Das
führt zu unsauberer Trennung der Proteinspots in der zweiten Dimension (vertikale
Streaks).

Der große Vorteil der Trägerampholyt-Gele besteht in der hohen Auflösung der
Trennung. Der pH-Gradient lässt sich auf eine Gellänge von 40 cm strecken.
Die IPG-Technik ist heute weiter verbreitet als CA-Techniken, da sie

benutzerfreundlicher angeboten wird. Fertige IPG-Gele und zugehörige Puffer können
von verschiedenen Firmen (Amersham Pharmacia Biotech, Biorad) bezogen werden.
Immobilingele werden als besser reproduzierbar angesehen, Gele verschiedener
Labors können angeblich computerunterstützt ausgewertet und verglichen werden.
Die Trennungsergebnisse sind jedoch genau wie bei der CA-Technik von der
verwendeten Charge der Ampholyte abhängig.
IPG-basierte Referenzkarten verschiedener Gewebe und Organismen werden im

Internet veröffentlicht. Mit der Zeit wurde jedoch erkennbar, dass sich die Idee der
Referenzkarte für ein Gewebe oder einen Organismus, an dem sich alle Labors
weltweit orientieren, nicht realisieren lässt. Es stellte sich heraus, dass
Referenzkarten /-muster nur für eine exakt definierte Technik innerhalb eines Labors
geeignet sind. Die Reproduzierbarkeit der CA- sowie der IPG-Technik hängt zum
größten Teil von den Ampholyten ab, die für die Isoelektrische Fokussierung
eingesetzt werden. Die Synthese der Ampholyte – der Carrierampholyte sowie der
Immobiline – kann von Charge zu Charge variieren. Für Experimente mit käuflich
erworbenen Immobilingelen besteht daher immer das Risiko, von Bestellung zu
Bestellung Gele mit leicht unterschiedlichen pH-Gradienten zu erhalten. Anwender
der Carrierampholyttechnik profitieren davon, dass sie ihre Ampholyte selbst
zusammenstellen und Aliquote einfrieren und damit die eigene Ampholyt-Charge für
eine große Zahl von Experimenten über Jahre hinweg verwenden können. Der
weitere große Vorteil der CA-Technik liegt in der höheren Auflösung, sie liegt mit etwa
der doppelten Anzahl von Spots weit über derjenigen von IPG-Gelen.
Die Auswertung von 2D-Elektrophoresen mit mehreren 100 „Spots“ ist kompliziert und
zeitraubend, dazu setzt man Computer ein. Die Muster werden mit Hilfe von
Densitometer, Videokamera oder Scanner aufgenommen.

Ein Densitometer ist ein bewegliches Photometer, das Elektrophoresegele oder
Dünnschichtchromatogramme abtastet und so zusätzlich zur qualitativen auch eine
quantitative Auswertung ermöglicht (Fläche unter den peaks ist proportional zur
aufgetragenen Menge). Wahlweise kann Durchlicht, Reflexion oder Fluoreszenz
erfasst werden.

SICHTBARMACHEN DER BANDEN
1) ANFÄRBEN
Für die Färbung der Proteinbanden in PAGE-Gelen sind vor allem zwei Methoden
gebräuchlich: die Färbung mit Coomassie Brilliant Blau und die hochsensitive
Silberfärbung.
Das Färben mit Coomassie Brilliant Blau geschieht in saurer Lösung

(Essigsäure/Methanol), wobei eine erhöhte Temperatur den Färbungsprozess
beschleunigt. Durch die Essigsäure werden die Proteine im Gel fixiert und positiv
geladen. Die positive Ladung bewirkt eine verstärkte Farbstoffbindung, allerdings
machen hydrophobe Interaktionen den Hauptanteil der Farbstoffbindungskapazität
aus. An den Färbungsvorgang schließt sich ein Entfärbungsprozeß des
Gelhintergrunds an. Dabei wird aus dem Gelbereich, der kein Protein enthält, der
Farbstoff ausgewaschen, der proteingebundene Farbstoff bleibt im Gel, wodurch
letztlich die Proteine als blaue Banden sichtbar werden.
Die Silberfärbung ist im Vergleich zur zuvor beschriebenen Methode sehr viel
aufwendiger, aber auch sehr viel sensitiver. Sie beruht auf der Reduktion von Ag+ zu
metallischem Silber, wahrscheinlich durch schwefelhaltige (Cys,Met) und basische
Aminosäurereste (Arg, Lys, His). Es gibt verschiedene Färbevarianten, sie beinhalten
aber alle eine Fixierung im Gel (Essigsäure), eine Behandlung mit Glutar- oder
Formaldehyd und anschließend eine Behandlung mit AgNO3-Lösung. Die
Entwicklung erfolgt mit Natriumcarbonatlösung.
Die Sensitivität der Coomassie-Färbung liegt bei ca. 0,05 µg/Bande, mit der
Silberfärbung können Banden von weniger als 1 ng Protein sichtbar gemacht werden.
2) IMMUNOLOGISCHE NACHWEISVERFAHREN
Mit immunologischen Färbeverfahren werden nur jene Proteine nachgewiesen, die

vom jeweils eingesetzten Antikörper gebunden werden können. Die verschiedenen
Methoden (z. B. Western Blot, Immunfixation, Rocket-Elektrophorese) werden im
Rahmen der Laborübung „Immunologie“ beschrieben.

LABORÜBUNG
LABORÜBUNG
SICHERHEIT:
1) Praktisch alle für die PAGE verwendeten Chemikalien (Acrylamid, Bisacrylamid,

APS, TEMED) sind hochgiftig, Hautkontakt ist auf jeden Fall zu vermeiden
(Handschuhe tragen). Auch fertige Gele enthalten noch bis zu 10 % toxischen
Monomeranteil und sollten keinesfalls mit bloßen Händen berührt werden! Reste
von Acrylamidlösungen müssen vor dem Verwerfen auspolymerisiert werden.
2) Da bei Protein-Elektrophoresen hohe Spannungen und Stromstärken

verwendet werden, sind die für den Umgang mit Strom üblichen
Sicherheitsvorkehrungen einzuhalten:
a) Der Arbeitsplatz und der Fußboden müssen trocken sein.
b) Prinzipiell ist bei jeder Tätigkeit an der Elektrophorese-Zelle der Strom vorher
abzuschalten, im Zweifelsfall power-supply abschalten oder/und abstecken!
Dies gilt insbesondere für den Zusammenbau bzw. das Zerlegen der
Elektrophoresekammern. Ebenso ist beim Nachfüllen von Pufferlösungen der
Strom abzuschalten.
c) Die Stecker müssen vollständig isoliert sein, keine blanken Drähte zur
Stromversorgung verwenden.
d) Die Elektrophoresezellen müssen während des Betriebs soweit abgedeckt

bzw. geschlossen sein, dass ein Kontakt mit leitenden Pufferlösungen oder
Steckern ausgeschlossen werden kann (Originalabdeckungen verwenden,
nicht mit freien Kabelverbindungen improvisieren).
e) Beim An- und Abstecken nur die rechte Hand verwenden, mit der linken Hand
kein leitendes Material berühren.
f) Beim Beenden der Elektrophorese immer zuerst Spannung und Stromstärke

auf Null stellen, erst dann das Gerät abschalten. (Grund: Power supplies
können nach dem Abschalten noch elektrische Ladung speichern. Diese
gespeicherte Ladung kann bei Berührung der Elektroden einen elektrischen
Schlag verursachen.)

DURCHFÜHRUNG:
Die verschiedenen Übungsbeispiele unterscheiden sich je nach Aufgabenstellung in

Gelzusammensetzung (T-Wert, C-Wert), Pufferwahl und Probenaufbereitung.
Das Repertoir der im L035 durchgeführten Übungen ändert sich laufend, wir
probieren oft neue Arbeitsvorschriften aus.
Wir laden unsere Schüler ein, ihrerseits Vorschläge für Anwendungen zum
Themenbereich Protein-Elektrophorese einzubringen (z.B. aus der Ferialpraxis, aus
der Literatur, aus dem internet) und ihre Ideen mit den betreuenden Lehrern zu
besprechen.
In der Folge werden die grundsätzlichen Gemeinsamkeiten oft verwendeter

Übungsbeispiele vorgestellt.
SDS-DISK-ELEKTROPHORESE
Die Durchführung der Übung kann je nach verwendeter Elektrophoresezelle etwas

abweichen, die grundsätzlichen Schritte sind aber bei allen SDS-Gelen gleich.
PRINZIPIELLER AUFBAU DES GELGIEßSTANDES:
Das Polyacrylamid-Gel wird zwischen 2

Platten, die durch Spacer (Abstandhalter) mit
definierter Dicke getrennt werden, gegossen.
Die unteren zwei Drittel dieses Sandwiches

werden mit Trenngel, das obere Drittel mit
Sammelgel gefüllt.
In das noch nicht polymerisierte Sammelgel

wird sofort nach dem Gießen ein
Probenkamm gesteckt. Dieser Kamm wird
nach erfolgter Polymerisation entfernt, die
durch den Kamm erzeugten Aussparungen
im Gel bilden die Probentaschen.

Details über den Auf- und Zusammenbau der verschiedenen im L035 verwendeten
Elektrophorese-Apparaturen werden am besten vor Ort mit dem betreuenden Lehrer
direkt am Gerät besprochen. Auch das Hinzuziehen der entsprechenden Original-
Bedienungsanleitungen kann hilfreich und nützlich sein.
PROBENVORBEREITUNG:
Feststofffreie und fettfreie Probenextrakt 1:1 mit SDS und DTT (ME) hältigem
Probenpuffer (sample buffer, treatment buffer) versetzen und 2 min im kochenden
Wasserbad erhitzen. 1 Tropfen 0,1%ige Bromphenolblaulösung zur Sichtbarmachung
der Lauffront zugeben, 1 Tropfen Glycerin zur Probenbeschwerung zugeben (nicht bei
Phast-Gel). Die so beschwerten und blau gefärbten Proben können in die
puffergefüllten Probentaschen unterschichtet werden (siehe Abbildung). In mindestens
eine Probentasche wird für die spätere Auswertung ein geeigneter Standard
(Molmarker, SDS-Standard, prestained standard etc.) aufgetragen.
ELEKTROPHORESE und FÄRBEN:
Die Elektrophoresebedingungen (Stromstärke, Spannung, Zeit) variieren in

Abhängigkeit von Gelgröße und Gelqualität und sind den jeweiligen
Arbeitsvorschriften zu entnehmen. Dasselbe gilt für das Färben der Gele.

AUSWERTUNG:
Zur Auswertung werden die Laufstrecken der Standard-Banden abgemessen und

gegen den Logarithmus der Molmassen (siehe Beipacktext des Standards)
aufgetragen. An der so erhaltenen Eichgerade werden die Molmassen der
Probenbanden aus deren Laufstrecken abgelesen.

ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG
Nachfolgend sind wichtige arbeitstechnische Passagen aus dem Handbuch des im

L035 verwendeten IEF-Systems der Fa. BIORAD wiedergegeben.
1) Beschreibung des Gelgießstandes (casting tray):
2) Beschreibung der richtigen Verwendung der Gel-Trägerfolie ( Gel Support Film):

3) Technik des Gießens eines IEF-Gels:

4) Auftragen der Proben auf das vorfokussierte IEF-Gel:

5) Elektrophoresebedingungen:
Bei der hier vorgestellten IEF-Zelle werden die Graphitelektroden mit Deionat
befeuchtet und dann direkt auf das IEF-Gel aufgelegt. Die Verwendung von
Elektrodenpuffern entfällt.

6) Färbung:

FRAGEN
Im Anschluss hier einige Fragen zur Vorbereitung auf die Laborvorbesprechung.

Diese Liste erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit, Vorschläge zur Erweiterung
der Liste werden gerne entgegengenommen.
FRAGE: Welche Ladung hat ein Protein?
FRAGE: Warum laufen Polyampholyte bei fortlaufender Elektrophorese nicht vom

Gel herunter?
FRAGE: Wie muss bei einer SDS-Elektrophorese der Strom angeschlossen werden?
FRAGE: Wie muss bei einer IEF-Elektrophorese der Strom angeschlossen werden?
FRAGE: Wie werden Acrylamidgele hergestellt, welche Kenngrößen beschreiben die

Geleigenschaften.
FRAGE: Was versteht man unter „stacking effect“? Wie funktioniert das?
FRAGE: Wie werden SDS-Gele (IEF-Gele, 2D-Gele) ausgewertet
FRAGE: Was versteht man unter „Nativer Elektrophorese“?
FRAGE: Skizziere eine typische IEF-Eichgerade pH 3-10 und trage Anode und
Kathode auf der Laufstrecken-Achse ein.
FRAGE: Werte folgendes SDS-Gel aus.

FRAGE: Es ist ein SDS-DISK-Acrylamidgel (10% T, 2,7 % C) herzustellen. Das
gesamte Gelvolumen (nach Zugabe aller Puffer, SDS, H2O etc.)beträgt 20
ml.
Die Monomer-Stammlösung wurde nach folgender Vorschrift hergestellt:
Monomer Solution (30,8 %T 2,6% Cbis)
60 g acrylamide (FW 71,08)

Caution: Acrylamide is neurotoxic and should be handled with care.
1,6 g bisacrylamide (FW 154,2)
ddH2O to 200 ml
Store up to 3 months at 4°C in the dark.
Wieviel ml Stammlösung müssen zur Bereitung des Gels vorgelegt

werden?
FRAGE: Ein IEF-Acrylamidgel wird nach folgender Vorschrift hergestellt:
Die Monomer-Stammlösung wurde nach folgender Vorschrift hergestellt:
Gib C- und T-Wert des fertigen IEF-Gels an?

ABKÜRZUNGEN
2D zweidimensional
APS Ammoniumperoxodisulfat
CA Carrier Ampholyte
DTT Dithiotreitol
IEF Isoelektrische Fokussierung
IEP Isoelektrischer Punkt
IPG Immobilisierter pH-Gradient
ITP Isotachophorese
ME Mercaptoethanol
MM Molmasse
PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese
pI Isoelektrischer Punkt
SDS Sodiumdodecylsulfat, Natriumdodecylsulfat
TEMED Tetramethylethylendiamin

LITERATUR
Cooper, Biochemische Arbeitsmethoden Walter de Gruyter & Co
Hoefer, Protein Electrophoresis Application Guide Hoefer Scientific Instruments
Westermeier, Elektrophorese-Praktikum VCH-Verlag
internet: siehe unten
LINKS
Die links dieser Liste liefern zusätzliche Informationen zum Thema, der Inhalt dieser
Seiten ist aber nicht zusätzlicher Besprechungsstoff.
SDS PAGE:
http://www.weihenstephan.de/blm/deg/manual/manualwork2html02testp3.htm
http://www.davidson.edu/academic/biology/courses/Molbio/SDSPAGE/SDSPAGE.ht
ml
http://ww4w.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/(FileDownload)?OpenAg
ent&docid=46DB9C271D850088C1256A5E0053ACA5&file=1Dbrochure.pdf
(Electrophoresis Handbook, Amersham Pharmacia)
http://www4.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/(FileDownload)?OpenAg
ent&docid=1EEF45659BE6AAEEC1256A5E00539743&file=MightySmallum.pdf
(manual SDS-Gießstand)
IEF:
ent&docid=2FE864B6EB3BE170C1256A5E00536894&file=iefproto.pdf (Guide to IEF,
Amersham Pharmacia)
ent&docid=46DB9C271D850088C1256A5E0053ACA5&file=1Dbrochure.pdf
http://www.bio-rad.com/LifeScience/pdf/Bulletin_9108.pdf (manual IEF-Gießstand, Biorad)
2D-Elektrophorese:
http://www4.amershambiosciences.com/applic/upp00738.nsf/vLookupDoc/172581038
-R140/$file/80-6429-60AB_Version_May_2002.pdf (2D-Elektrophoresis handbook
Amersham Biosciences)
http://webdoc.gwdg.de/ebook/w/2002/nock/pdfEinleitung.pdf (Proteomics)

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ELEKTROPHORESE

Unterlagen zur Übungsvorbereitung

Höhere Bundes- Lehr- und Versuchsanstalt für Chemie

Für die theoretische Behandlung der Elektrophorese ist es gleichgültig, um welche

Ein Gemisch verschiedener Substanzen lässt sich daher im elektrischen Feld

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 1

Die Ladung eines Proteins ist vom pH-Wert abhängig.

Dieses Protein hat mehr saure als

Um dieses Protein zu einer Gesamtladung

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 2

Senkt man den pH weiter, erhält das

Bei pH<IEP ist ein Protein ein Kation.

Steigt der pH auf Werte über dem IEP,

Bei pH>IEP ist ein Protein ein Anion .

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 3

Kathode (– - Pol): 2 e- + 2 H2O → 2 OHÖ + H2 (basisch)

Anode (+ - Pol): H 2O → ½ O2 + 2 H+ + 2 e- (sauer)

Je nach Gelqualität und Pufferwahl können unterschiedliche Faktoren die Trennung

1) NATIVE ELEKTROPHORESE (ZONEN-ELEKTROPHORESE):

2) ISOTACHOPHORESE (ITP) = Gleichgeschwindigkeits-Elektrophorese :

Die elektrophoretische Trennung findet in einem diskontinuierlichen Pufferfeld

Dieses Prinzip wird im Sammelgel bei der SDS-DISK-Elektrophorese eingesetzt.

Die ITP wird hauptsächlich für quantitative Analysen eingesetzt.

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 4

In diesem Fall findet die Elektrophorese in einem pH-Gradienten statt. Die

Man verwendet diese Methode für die qualitative Charakterisierung von

Legende: L- …. Leition (leading ion)

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 5

Proteine sind teilweise gegenüber bestimmten pH-Werten oder Puffersubstanzen

Die elektrophoretische Trennung von Substanzgemischen erfolgt bei einem genau

Es ist aber eine Mindest-Pufferkapazität erforderlich, damit der pH-Wert der

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 6

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 7

PAG entstehen durch chemische Kopolymerisation des Monomers Acrylamid mit

Die Polymerisation wird gestartet durch Zugabe von APS

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 8

Die Polymerisation erfolgt unter Luftausschluss, da O2 als Radikalfänger wirkt.

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 9

Zur Charakterisierung der Gelqualität sind T- und C-Wert immer anzugeben.

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 10

Abb.: Gießen eines Gradientengels

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 11

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 12

Für die Protein-Elektrophorese sind Agarose-Gele wegen ihrer großen Poren

Elektrophorese von Nucleinsäuren erfolgt horizontal in einer puffergefüllten

! ACHTUNG !: Puffer und Gele können kanzerogenes Ethidiumbromid enthalten.

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 13

Die SDS-DISK-Elektrophorese trennt Proteingemische ausschließlich nach

SDS (Sodiumdodecylsulfat (Natriumlaurylsulfat) CH3-(CH2)11-SO4-Na+ ) ist ein

Es binden etwa 1,4 g SDS/g Protein. Diese Bindungsrelationen sind weitestgehend

DISK = diskontinuierlich: bei der SDS-DISK-Elektrophorese werden 2 verschiedene

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 14

Durch den Zusatz von SDS im Überschuss zu Proteinlösungen werden:

5 die individuellen Ladungsunterschiede der Proteine überdeckt

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 15

Als Folge der Probenbehandlung mit SDS/DTT (Probenpuffer, sample buffer,

Unter diesen Umständen ergibt sich im diskontinuierlichen System eine lineare

© A. PFITZNER Laboratorium L035 – Elektrophorese Seite 16

Das Trennvermögen der diskontinuierlichen Elektrophorese beruht auf der

2) TRENNGEL (Seperating Gel) in dem die Auftrennung der Probenkomponenten

WAS PASSIERT WÄHREND DER ELEKTROPHORESE?

WAS PASSIERT IM SAMMELGEL?

Nach dem Eintritt in das Sammelgel verschiebt sich das Glycin-Ionengleichgewicht