Sterilisation, Desinfektion und Hygiene

Ziel Arbeitssicherheit und Gesundheitsschutz Umweltsicherheit Produktesicherheit

Sterilitt und Hygiene erlauben: Kontrolle ber Art und Anzahl der Mikroorganismen in Nhrmedienvorrten whrend des Produktionsprozesses in Reaktoren und Leitungen bei der Produkteaufarbeitung und bei der Behandlung von Abluft und Abfllen.

Sterilisation ...

bedeutet: Die Elimination (Abtrennung, Abttung) aller Mikroorganismen, sowie die Inaktivierung aller Viren, Plasmiden und DNS-Fragmenten, die sich in oder an einem Produkt oder Gegenstand befinden.

Desinfektion (Hygiene) ...

Die gezielte, partielle Verminderung der Keimzahl, vorzugsweise auf Oberflchen (Keimzahlerniedrigung)

Kontamination ...
Produkte oder Gegenstnde die nicht steril sind, werden als kontaminiert bezeichnet

Mikroorganismen
Dieser Begriff beinhaltet gemss ESV ausser Mikroorganismen im eigentlichen Sinn auch zellulre oder nichtzellulre biologische Agenzien, die fhig sind, sich zu vermehren oder genetisches Material weiterzugeben. Die CEN-Norm 12740 (S. 5) schliesst zustzlich biologische Agenzien, die Infektionen, Allergien oder toxische Wirkungen hervorrufen knnen mit ein. Nach diesen Definitionen gehren z.B. Viren, Viroide, Parasiten, Zellen aus mehrzelligen pflanzlichen und tierischen Organismen, Prionen, Plasmide auch unter den Begriff Mikroorganismen.

Inaktivierung / Sterilisation / Desinfektion

Inaktivierung: Praktisch vollstndige Zerstrung der biologischen Aktivitten von Mikroorganismen und biologischen Agenzien (CEN-Norm 12740). Sterilisation: Abttung praktisch aller Mikroorganismen. Inaktivierung durch Keimzahlreduzierung, so dass hchstens ein lebender Mikroorganismus in 106 sterilisierten Einheiten des Endprodukts auftritt. Sterilisation bezieht sich auf lebensfhige Organismen, whrend Inaktivierung auch nichtzellulre biologische Agenzien einschliesst. Desinfektion (Hygiene): Abttung oder Inaktivierung von pathogenen Mikroorganismen, so dass keine Gefhrdung mehr von ihnen ausgeht. Massnahme zur gezielten Verminderung der Keimzahl, die normalerweise nicht zur Sterilitt fhrt.

Kontamination
Produkte oder Gegenstnde die nicht steril sind, werden als kontaminiert bezeichnet

Sterilisationsverfahren
Thermisch (Flamme, trockene Luft, Sattdampf) Chemisch (Oxidationsmittel, Radikale, Alkohol, Formaldehyd etc.,) Strahlung (z.B. UV, ) Filtration Es gibt kein universelles Sterilisationsverfahren. Die Wahl des Verfahrens richtet sich nach: Den Eigenschaften des Sterilisationsgutes (z.B. Temperaturbestndigkeit) Art und Umfang der mikrobiellen Kontamination

 Merke:

Desinfektionsverfahren
Thermisch (Pasteurisation, UHT-Verfahren, Kochen) Chemisch (Alkohol, Formaldehyd, quarternre Ammoniumsalze etc.) Filtration

Kontaminationen werden gefrdert durch:

Kontaminationsgefahr gross

klein
0C 30C 60C 90C

pO2 tief

pO2 hoch

osmotischer Druck

~ 60% rel. Feuchte

pH 0

pH 4

pH 8

pH 12

Nhrstoffangebot hoch

niedrig

Hitzesterilisation: Feuchte Hitze

Das Ergebnis einer Sterilisation im Autoklaven wird wesentlich beeinflusst durch folgende Faktoren: die Art der Mikroorganismen und ihre physiologischen Zustnde (ihre Hitzeresistenz) die Ausgangskeimzahl den angestrebten Endzustand die Umgebungsbedingungen (z.B. pH-Wert des Mediums, Einschliessung der Keime in schtzende Schmutz- und Fetthllen) Dampfsttigung (Restluftanteil) Temperatur Behandlungszeit

Beispiele von Hitzeresistenz

Resistenzstufe I II III IV V VI

Organismus

Temperatur (C) 61,5 80 100 105 121 132

Zeit (min.) 30 30 5 - 30 5 15 60

Pathogene Streptokokken, Listerien, Polioviren die meisten vegetativen Bakterien, Hefen, Schimmelpilze, alle Viren ausser Hepatitis-B Hepatitis-B-Viren, die meisten Pilzsporen Bacillus anthracis-Sporen Bacillus stearothermophilus-Sporen Prionen

Dampfsterilisation im Auotoklav

Feucht: gesttigter, gespannter Dampf 121C 1 bar 130C 2 bar Entweder das ganze System (Reaktor samt Zu- und Wegfhrungen) oder in einem Autoklaven (Bauteile, Instrumente, Flssigkeiten bis ca. 20 L) Abttung durch Denaturierung von Proteinen und Hitzezerstrung von Nukleinsuren Abttung ist ein dynamischer Prozess:

Nt = N0e kt
Nt ln = kt N0

N, Zahl der Mikroorganismen t, Behandlungszeit k, thermische Abttungskonstante (abhngig von Bakterienart und Milieu)

D-Wert
D-Wert: Die Zeit, welche bei einer festgelegten Temperatur die Keimzahl um einen Faktor 10 verringert, wird als D-Wert (Dezimalreduktionswert oder Destruktionswert) bezeichnet. Der DWert fr einen bestimmten Organismus in einem bestimmten physiologischen Zustand kann experimentell ermittelt werden. Wenn die Anzahl der berlebenden Organismen bei einer konstanten Temperatur gegen die Behandlungszeit aufgetragen wird, ergibt sich eine exponentielle Abttungskurve. Daraus lsst sich der D-Wert ablesen. Die D-Werte werden auch von weiteren Umgebungsparametern wie pH, Schmutz, Luftanteil in der Probe stark beeinflusst.
N0: (maximale) Ausgangskeimzahl N: zulssige Endkeimzahl

Keimzahl N
10 000 000

1 000 000

Bacillus stearothermophilusSporen: D121C = 1.5 Min. N 1 k = - ln t N0

Anzahl berlebender Sporen

100 000

10 000

1 000

100

10 0 9 Behandlungszeit mit Sattdampf 121C 3 6

Min.

Wahrscheinlichkeit fr Sterilitt
t D N0
6

P = (1 10 )
D121 = 1 Min.

Beispiel: N0 = 10

6 Min.: P = 1-10

( ) 8 Min.: P = (1-10 )

106 -6 106 -8

= 0.37 = 0.99

Parameter fr Effektivitt: F-Wert Erforderlicher Zeitraum in Minuten, um bei einer bestimmten Temperatur (bei den Hitzesterilisationsverfahren) oder sonstigen genau definierten Bedingungen alle Mikroorganismen abzutten. Neben der Ausgangskeimzahl wird zustzlich eine berlebenswahrscheinlichkeit, z.B. 10-6 bercksichtigt. Beispiel: Ausgangskeimzahl 106 pro Behlter Endkeimzahl 10-6 pro Behlter

F = (logN0 logNt )D logN0 logNt = n, Anzahl 10er Potenzen

F = 12 1.5 Min. = 18 Min. fr Bacillus stearothermophilus mit einem D121 = 1.5 Min.

Schlussfolgerung

 Vor der Sterilisation: Reduktion der Zahl der Mikroorganismen (Keimzahlverminderung) und Vermeidung von grsseren Kontaminationen durch: Reinigung (z.B. Seife und Wasser) Evtl. Desinfektion Sauberes Arbeiten (allgemeine Hygiene, Gute mikrobiologische Laborpraxis)

 Dadurch wird die berlebenswahrscheinlichkeit von Mikroorgansimen stark reduziert.  Bedenke: Die Herstellung von Sattdampf braucht viel Energie.

Sterilisationszeiten: Sattdampf
Laborstandard: 121C bei 1 bar, 15 bis 30 Min. Dieser Satndard ist geeignet fr Instrumente und kleinere Flssigkeitsvolumen Bei grsseren Massen Aufwrm- und Abkhlzeit bercksichtigen:

121C

Bei neuen Verfahren zuerst eine Validierung durchfhren.

Temperatur im Sterilgut

Temperatur im Autoklaven

50C 0 Min. 20 Min. 40 Min.

Sterilisationszeiten: Sattdampf (Forts.)

Beispiele fr Sterilisationszeiten im Autoklaven bei 121 - 123C bei nicht gerhrten wssrigen Lsungen: Richtwerte fr Gefsse:
Gefsse Reagenzglser Erlenmeyer-Kolben Erlenmeyer-Kolben Erlenmeyer-Kolben Erlenmeyer-Kolben Flasche Volumen 20 ml 50 ml 200 ml 1000 ml 2000 ml 9000 ml Expositionszeit (Min.) 12 - 14 12 - 14 12 - 15 20 - 25 30 - 35 50 - 55

Autoklaven: Beispiele (1)

Handventil Geschaltetes Ventil pT Druck, Temperatur Luftfilter (ab Klasse 2) M Motor Pumpe

Standautoklav altes Modell

Standautoklav Stand der Technik

Handentlftung pT Filter (ab SS 2) Filter ab SS 2)

Luftabscheider Abfall

Dampf Kondensatablass (Steril ab SS 2)

Prinzipschema eines Standautoklaven mit Dampf aus Dampferzeuger. Geeignet fr die Risikoklassen 1 bis 3. Wesentliche Punkte: a)Das Totvolumen beim Kondensatablass muss entweder mglichst klein sein, oder das Kondensat muss separat und kontrolliert sterilisierbar sein (ab Klasse 3). b) Entlftungsleitungen mssen ber einen Filter geleitet werden (ab Klasse 3). c) Die Befllung darf nicht zu kompakt sein

Normaler (lterer) Labor-Standautoklav: Geeignet fr Abfallbehandlung Klasse 2 nur dann, wenn Abflle aussen nicht kontaminiert sind, und keine Aerosolbildung mglich ist. Von Vorteil an diesem Typ ist, dass das Kondensat in situ mitsterilisiert wird (Im Wasservorrat). Mngel fr die Abfallsterilisation: Aerosole knnen ber die Entlftungsleitungen in die Umwelt entweichen.

Autoklaven: Beispiele (2)

Durchreicheautoklav
Prinzipschema eines Durchreicheautoklaven. Mit der integrierten Messsonde kann der Prozessberwachtund aufgezeichnet und optimal gesteuert werden (z.B. F-Wert-Steuerung). Da solche Autoklaven hufig bei Klasse 2 und 3 eingesetzt werden, muss die Abluft, bzw. die Vakuumleitung ber Filter geleitet werden. Besonders beachtet werden muss, ob das Kondensat kontrolliert mitautoklaviert wird. In manchen Fabrikaten wird das Kondensat unabhngig und nicht kontrolliert autoklaviert.

Dampfsterilisation: Beispiel (3)

Organismenhaltiges Abwasser Dampf

Fllstandsanzeige Gaspendelleitung Rhrer M Dampf Dampf Ventiltyp: Metallmembran- oder Faltenbalgventil bevorzugt (ab Klasse 3). Klasse 1-2 evtl. auch Kugelventil Zweitventil im Ablass vermindert Austrag von Mikroorganismen, wenn erstes Ventil leckt (ab Klasse 3) ARA pT Rcklauf Ablassstutzen: Totvolumen mglichst klein (Distanz < rund 7 cm, je nach ) p Probenahme

Sammelbehlter

Sterilisator

Druckmesser fr Dichtigkeitskontrolle mit Pressluft

Prinzipschema fr Abwassersterilisation im Batchverfahren. Mit Pfeilen sind die besonders heiklen Stellen und Armaturen bezeichnet: Als Ventiltypen sind Membran- oder Faltenbalgventile zu whlen. Das Totvolumen im Ablassstutzen muss so klein sein, dass es beim Autoklavieren gengend (lange) heiss wird. Ausserdem ist darauf zu achten, dass die Abluft ber Filter an die Umgebung abgegeben wird. Solche komplexen Anlagen knnen nicht "von der Stange" bestellt werden, sie werden bedarfsgerecht, "massgeschneidert" fr den Kunden zusammengestellt.

Sterilisation: Trockene Hitze Trockene Hitze dient vor allem zur Sterilisation von Instrumenten und hitzestabilen Gerteteilen. Sie ist weit weniger wirksam als luftfreier, gesttigter Wasserdampf, da Luft ein schlechterer Wrmeleiter ist als Wasserdampf. Deshalb sind hhere Temperaturen und lngere Einwirkungszeiten zur Sterilisation erforderlich. Ausserdem werden Proteine in feuchtem Milieu sehr viel leichter denaturiert als in wasserarmem Zustand. Zu den Sterilisationsverfahren mit trockener Hitze gehren: Heissluftsterilisation Ausglhen Abflammen

Heissluftsterilisation Die Erhitzung erfolgt in einem geschlossenen Raum ohne ussere Luftzufuhr, z. B. in Sterilisationsschrnken. Gemss Pharmakopen und WHO - Empfehlungen sollen Temperaturbereiche von 150 - 250C und Einwirkungszeiten von 30 - 180 Minuten angewendet werden. Je nach Hitzeempfindlichkeit des Sterilisiergutes werden in der Praxis alternativ folgende Bedingungen gewhlt (reine Sterilisationszeit, Aufheiz- und Abkhlzeiten mssen noch hinzugerechnet werden): 3 Stunden, 150C 2 Stunden, 160C 30 Minuten, 180C

Ausglhen Kleinere Instrumente, wie z.B. Impfsen aus glhfestem Metall, werden in der mikrobiologischem Arbeitspraxis vor und nach jedem Gebrauch durch Ausglhen in der offenen Flamme eines Bunsenbrenners sterilisiert. Beim Umgang mit pathogenem Material wird vorzugsweise ein Bunsenbrenner mit Schutzglocke oder ein ElektroLaborbrenner mit glhender Keramikrhre verwendet werden. Das Umherspritzen von infektisen Partikeln kann dadurch je nach Arbeitstechnik vermindert bis verhindert werden.

Abflammen Die Keimzahl an Oberflchen von Metall- und Glasgerten kann durch Abflammen vermindert werden. Das Gert wird in 70%igen Ethanol oder Methanol eingetaucht und der anhaftende Alkohol entzndet. Die Nachteile dieser Methode sind, dass Endosporen von Bakterien hufig nicht abgettet werden, und dass Keime in Luftpolstern berleben knnen. Ein weiterer Nachteil ist auch die Brandgefahr. Es sind Flle von Laborbrnden bekannt, bei denen sich das Alkoholreservoir entzndet hat. In sterilen Werkbnken mit Umluftzirkulation besteht zudem Explosionsgefahr.

Sterilisation: Gase
Mikrobizide Gase: Geeignet fr Oberflchen, porse Materialien und Textilien

Formaldehyd 2 - 5% Als einziges Gas geeignet fr Bakterien und Bakteriensporen toxisch, ziemlich sicher krebserregend stechender Geruch Durchdringt PVC und Gummi Denaturierung von Proteinen (chem. Reaktion mit Aminosuren) Ethylenoxid Geeignet fr Pilze, Bakterien und Viren toxisch; bildet mit Luft explosive Gemische (zwischen 3 und 80%),  Vakuumverfahren geruchslos zersetzt sich rasch in Wasser und feuchter Luft Radikalbildung: Reaktion mit Aminosuren, RNS und DNS Ozon Geeignet fr Pilze, Bakterien und Viren toxisch, starker charakteristischer Geruch wenig stabil nur bei der Aufbereitung von Trink- und Badewasser verwendet

Ionisierende Strahlung
Kobalt Co 60

UV

z.T. hohe Dosen notwendig, die das Sterilgut verndern (z.B. manche Kunststoffe) Einsatz: Behlter, verpackte Gegenstnde, insbesondere Einwegartikel pharmazeutische Produkte Lebensmittel (in der Schweiz nicht zugelassen)

Nur Oberflchenbehandlung, geringe Eindringtiefe (Poren, Schmutz etc.) Abstand und Schattenwurf bercksichtigen Luft (klinischer Bereich) und Wasser (Wasseraufbereitung) : Nur bei gengend langer Kontaktzeit wirksam

Filtrationsverfahren
Je nach Porengrsse und Filtrationsverfahren: Keimzahlreduktion Keimentfernung Porengrssen fr Filtration von Flssigkeiten: 0.2m oder 0.45m Scheibenfilter oder Filterkerzen fr Flssigkeiten Tiefenfilter (z.B. HEPA oder Hosch) fr Luftfiltration (Adsorption von Partikeln) Luftfilter funktionieren nur im trockenen Zustand! Fr Viren spezielle Adsorptions- und Ultrafilter

Desinfektion: Pasteurisation /UHT-Verfahren

Nur Abttung von vegetativen Keimen thermoresistente Sporen (Bacillus sp. und Clostridium sp.) berleben der Sporen zu verhindern Dauererhitzung Kurzzeiterhitzung Hocherhitzung UHT Tyndallisierung anschliessend 4 Std. Zyklus 2mal wiederholen ~30 Min. ~20 Sek. 3 - 5 Sek. 1 - 3 Sek. 30 Min. 30C 62C 70 - 74C 85 - 87C 130 - 150C 100C

 Nahrungsmittelindustrie: Einsatz von Konservierungsmitteln um Auskeimen

Besonders geeignet um Sporenbildner abzutten, wenn das Sterilgut hitzeempfindlich ist. Die Sporen werden durch die Hitze (100C) zum Auskeimen (bei 30C) gebracht, die anschliessende Temperaturerhhung ttet die vegetativen Keime ab.

Desinfektionsmittel
schnell wirksame Mittel *: wssrige Alkohollsungen (30%) 70% (90%) Aethylalkohol oder Propylalkohol Schmales Spektrum: Nur fr vegetative Bakterien! Achtung: Brennbar, explosible Gemische mit Luft bereits bei Raumtemperatur Natriumhypochlorit bei pH 4 bis 6.5: Chlorbildung Breites Spektrum: Bakterien, Bakteriensporen, Viren Peressigsure bei pH 2 bis 3.5 Sehr breites Spektrum: Bakterien, Bakteriensporen, Viren, Pilze * schnell wirksam heisst: Mind. 2 Min. Einwirkungszeit fr vegetative Keime.