DEUTSCHE NORM Februar 2021

DIN EN ISO 20130

D
ICS 13.080.30

Bodenbeschaffenheit –
Messung von Enzymaktivitätsmustern in Bodenproben mit
kolorimetrischen Substraten in Mikrotiterplatten (ISO 20130:2018);
Deutsche Fassung EN ISO 20130:2020
Soil quality –
Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using colorimetric substrates in
micro-well plates (ISO 20130:2018);
German version EN ISO 20130:2020
Qualité du sol –
Mesure de l’activité enzymatique dans des échantillons de sol en utilisant des substrats
colorimétriques (ISO 20130:2018);
Version allemande EN ISO 20130:2020

Gesamtumfang 39 Seiten

DIN-Normenausschuss Wasserwesen (NAW)

DIN EN ISO 20130:2021-02

Nationales Vorwort
Der Text von ISO 20130:2018 wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 190 „Soil quality“ der Internationalen
Organisation für Normung (ISO) erarbeitet und als EN ISO 20130:2020 durch das Technische Komitee
CEN/TC 444 „Prüfverfahren für die umweltbezogene Charakterisierung fester Matrices“ übernommen, dessen
Sekretariat von NEN (Niederlande) gehalten wird.

Das zuständige deutsche Normungsgremium ist der Unterausschuss NA 119-01-02-04 „Biologische

Verfahren“ des Arbeitsausschusses NA 119-01-02 AA „Abfall- und Bodenuntersuchung“ im DIN-Normen-
ausschuss Wasserwesen (NAW).

Für die in diesem Dokument zitierten Dokumente wird im Folgenden auf die entsprechenden deutschen
Dokumente hingewiesen:

ISO 5725-2 siehe DIN ISO 5725-2

ISO 10390 siehe DIN EN ISO 10390
ISO 10694 siehe DIN ISO 10694
ISO 18400-206 siehe DIN ISO 18400-206

Aktuelle Informationen zu diesem Dokument können über die Internetseiten von DIN (www.din.de) durch
eine Suche nach der Dokumentennummer aufgerufen werden.

Nationaler Anhang NA
(informativ)

Literaturhinweise

DIN EN ISO 10390, Boden, Schlamm und behandelter Bioabfall — Bestimmung des pH-Wertes

DIN ISO 5725-2, Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision) von Messverfahren und Messergebnissen —
Teil 2: Grundlegende Methode für Ermittlung der Wiederhol- und Vergleichpräzision eines vereinheitlichten
Messverfahrens

DIN ISO 10694, Bodenbeschaffenheit — Bestimmung von organischem Kohlenstoff und Gesamtkohlenstoff nach
trockener Verbrennung (Elementaranalyse)

DIN ISO 18400-206, Bodenbeschaffenheit — Probenahme — Teil 206: Anleitung zur Entnahme, Behandlung und
Lagerung von Boden für die Beurteilung von biologischen funktionalen und strukturellen Endpunkten im Labor

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EUROPÄISCHE NORM EN ISO 20130
EUROPEAN STANDARD
NORME EUROPÉENNE Mai 2020

ICS 13.080.30

Deutsche Fassung

Bodenbeschaffenheit —
Messung von Enzymaktivitätsmustern in Bodenproben mit
kolorimetrischen Substraten in Mikrotiterplatten
(ISO 20130:2018)
Soil quality — Qualité du sol —
Measurement of enzyme activity patterns in soil Mesure de l'activité enzymatique dans des échantillons
samples using colorimetric substrates in micro-well de sol en utilisant des substrats colorimétriques
plates (ISO 20130:2018) (ISO 20130:2018)

Diese Europäische Norm wurde vom CEN am 13. April 2020 angenommen.

Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschäftsordnung zu erfüllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter
denen dieser Europäischen Norm ohne jede Änderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten Stand
befindliche Listen dieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim CEN-CENELEC-Management-
Zentrum oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhältlich.

Diese Europäische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Französisch). Eine Fassung in einer anderen
Sprache, die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch Übersetzung in seine Landessprache gemacht und dem
Management-Zentrum mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen.

CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland, Estland, Finnland,
Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen,
Österreich, Polen, Portugal, der Republik Nordmazedonien, Rumänien, Schweden, der Schweiz, Serbien, der Slowakei, Slowenien,
Spanien, der Tschechischen Republik, der Türkei, Ungarn, dem Vereinigten Königreich und Zypern.

EUROPÄISCHES KOMITEE FÜR NORMUNG

EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION
COMITÉ EUROPÉEN DE NORMALISATION

CEN-CENELEC Management-Zentrum: Rue de la Science 23, B-1040 Brüssel

DIN EN ISO 20130:2021-02
EN ISO 20130:2020 (D)

Inhalt
Seite

Europäisches Vorwort .......................................................................................................................................................... 3

Vorwort ...................................................................................................................................................................................... 4
Einleitung .................................................................................................................................................................................. 5
1 Anwendungsbereich............................................................................................................................................... 6
2 Normative Verweisungen ..................................................................................................................................... 6
3 Begriffe, Symbole und Abkürzungen................................................................................................................ 6
3.1 Begriffe ........................................................................................................................................................................ 6
3.2 Symbole und Abkürzungen.................................................................................................................................. 6
4 Kurzbeschreibung ................................................................................................................................................... 7
5 Reagenzien................................................................................................................................................................. 7
5.1 Pufferlösungen und Reagenzien ........................................................................................................................ 7
5.2 Substrate und Standards.....................................................................................................................................10
5.2.1 Herstellung von Standardlösungen ................................................................................................................10
5.2.2 Herstellung von Substratlösungen..................................................................................................................11
6 Geräte und Materialien........................................................................................................................................12
7 Durchführung.......................................................................................................................................................... 13
7.1 Erstellung von Kalibrierkurven .......................................................................................................................13
7.1.1 Allgemeines ............................................................................................................................................................. 13
7.1.2 PNP-Lösung.............................................................................................................................................................. 13
7.1.3 -Naphthylamin-Lösung...................................................................................................................................... 13
7.1.4 Ammoniumchlorid-Lösung ................................................................................................................................14
7.2 Probenahme ............................................................................................................................................................ 14
7.2.1 Probenvorbereitung............................................................................................................................................. 14
7.2.2 Substratzugabe....................................................................................................................................................... 15
7.2.3 Extinktionsmessungen ........................................................................................................................................ 17
7.2.4 Messungen von Urease-Aktivitäten ................................................................................................................17
8 Berechnung der Ergebnisse...............................................................................................................................17
9 Angabe der Ergebnisse ........................................................................................................................................ 18
10 Gültigkeitskriterien.............................................................................................................................................. 18
11 Methodenvalidierung Ringversuch.................................................................................................................19
12 Prüfbericht............................................................................................................................................................... 19
Anhang A (informativ) Validierung des Verfahrens und Ringversuche zur Bewertung von
Enzymaktivitäten im Boden mit einem kolorimetrischen Verfahren................................................20
Anhang B (informativ) Internationaler Ringversuch zur Bewertung von Enzymaktivitäten im
Boden mit einem kolorimetrischen Verfahren ..........................................................................................25
Literaturhinweise................................................................................................................................................................. 36

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 DIN EN ISO 20130:2021-02
EN ISO 20130:2020 (D)

Europäisches Vorwort
Der Text von ISO 20130:2018 wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 190 „Soil quality“ der Internationalen
Organisation für Normung (ISO) erarbeitet und als EN ISO 20130:2020 durch das Technische Komitee
CEN/TC 444 „Prüfverfahren für die umweltbezogene Charakterisierung fester Matrices“ übernommen, dessen
Sekretariat von NEN gehalten wird.

Diese Europäische Norm muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Veröffentlichung
eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis November 2020, und etwaige entgegenstehende
nationale Normen müssen bis November 2020 zurückgezogen werden.

Es wird auf die Möglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berühren
können. CEN ist nicht dafür verantwortlich, einige oder alle diesbezüglichen Patentrechte zu identifizieren.

Entsprechend der CEN-CENELEC-Geschäftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden

Länder gehalten, diese Europäische Norm zu übernehmen: Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland, die
Republik Nordmazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien,
Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, Österreich, Polen, Portugal, Rumänien,
Schweden, Schweiz, Serbien, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Türkei, Ungarn,
Vereinigtes Königreich und Zypern.

Anerkennungsnotiz

Der Text von ISO 20130:2018 wurde von CEN als EN ISO 20130:2020 ohne irgendeine Abänderung
genehmigt.

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EN ISO 20130:2020 (D)

Vorwort
ISO (die Internationale Organisation für Normung) ist eine weltweite Vereinigung nationaler Normungs-
organisationen (ISO-Mitgliedsorganisationen). Die Erstellung von Internationalen Normen wird üblicher-
weise von ISO Technischen Komitees durchgeführt. Jede Mitgliedsorganisation, die Interesse an einem Thema
hat, für welches ein Technisches Komitee gegründet wurde, hat das Recht, in diesem Komitee vertreten zu
sein. Internationale staatliche und nichtstaatliche Organisationen, die in engem Kontakt mit ISO stehen,
nehmen ebenfalls an der Arbeit teil. ISO arbeitet bei allen elektrotechnischen Themen eng mit der
Internationalen Elektrotechnischen Kommission (IEC) zusammen.

Die Verfahren, die bei der Entwicklung dieses Dokuments angewendet wurden und die für die weitere Pflege
vorgesehen sind, werden in den ISO/IEC-Direktiven, Teil 1 beschrieben. Es sollten insbesondere die
unterschiedlichen Annahmekriterien für die verschiedenen ISO Dokumentenarten beachtet werden. Dieses
Dokument wurde in Übereinstimmung mit den Gestaltungsregeln der ISO/IEC Direktiven, Teil 2 erarbeitet
(siehe www.iso.org/directives).

Es wird auf die Möglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berühren
können. ISO ist nicht dafür verantwortlich, einige oder alle diesbezüglichen Patentrechte zu identifizieren.
Details zu allen während der Entwicklung des Dokuments identifizierten Patentrechten finden sich in der
Einleitung und/oder in der ISO Liste der erhaltenen Patenterklärungen (siehe www.iso.org/patents).

Jeder in diesem Dokument verwendete Handelsname dient nur zur Unterrichtung der Anwender und bedeutet
keine Anerkennung.

Für eine Erläuterung des freiwilligen Charakters von Normen, der Bedeutung ISO spezifischer Begriffe und
Ausdrücke in Bezug auf Konformitätsbewertungen sowie Informationen darüber, wie ISO die Grundsätze der
Welthandelsorganisation (WTO, en: World Trade Organization) hinsichtlich technischer Handelshemmnisse
(TBT, en: Technical Barriers to Trade) berücksichtigt, siehe www.iso.org/iso/foreword.html.

Dieses Dokument wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 190, Soil quality, Unterkomitee SC 4, Biological
characterization erarbeitet.

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EN ISO 20130:2020 (D)

Einleitung
Mikroorganismen sind für viele Schlüsselprozesse im Kreislauf der Elemente verantwortlich. Dabei sind
Enzyme für den Abbau organischer Moleküle und deren Mineralisation verantwortlich. Die wichtigste
Grundvoraussetzung ist, dass die Enzyme im Boden mikrobieller Herkunft sind, auch wenn Ausscheidungen
von Pflanzenwurzeln Enzyme enthalten. Im Boden spielen extrazelluläre Enzyme eine wichtige Rolle beim
biologischen Abbau organischer Makromoleküle. Die gemeinsame Aktivitätsbestimmung verschiedener
Enzyme, die für den biologischen Abbau von organischen Verbindungen und die Mineralisation von
Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor und Schwefel im Boden wichtig sind, zeigt möglicherweise durch
Chemikalien und andere anthropogene Einflüsse bedingte schädliche Auswirkungen auf. Allerdings können
Enzymaktivitätsbestimmungen unter optimierten Laborbedingungen und unter Verwendung künstlicher
Substrate nicht die tatsächlichen enzymatischen Umsatzraten in Böden in situ wiedergeben.

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EN ISO 20130:2020 (D)

1 Anwendungsbereich
Dieses Dokument legt ein Verfahren zur gemeinsamen (oder getrennten) Messung verschiedener Hydrolase-
Aktivitäten (Arylamidase, Arylsulfatase, -Galactosidase, -Glucosidase, -Glucosidase, N-Acetyl-Glucosa-
minidase, saure, alkalische und globale Phosphatasen, Urease) in Bodenproben unter Verwendung von
kolorimetrischen Substraten fest. Die Enzymaktivitäten im Boden variieren je nach Jahreszeit und sind
abhängig von chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften des Bodens.

Diese Methode kann entweder zum Nachweis schädlicher Auswirkungen auf die Enzymaktivitäten im Boden
durch toxische Substanzen oder andere anthropogene Stoffe in kontaminierten Böden gegenüber einem
Kontrollboden oder zur Prüfung von Chemikalien angewendet werden.

2 Normative Verweisungen
Die folgenden Dokumente werden im Text in solcher Weise in Bezug genommen, dass einige Teile davon oder
ihr gesamter Inhalt Anforderungen des vorliegenden Dokuments darstellen. Bei datierten Verweisungen gilt
nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug
genommenen Dokuments (einschließlich aller Änderungen).

ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic
conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory

3 Begriffe, Symbole und Abkürzungen

3.1 Begriffe
Es werden keine Begriffe in diesem Dokument angegeben.

ISO und IEC stellen terminologische Datenbanken für die Verwendung in der Normung unter den folgenden
Adressen bereit:

— IEC Electropedia: verfügbar unter http://www.electropedia.org/

— ISO Online Browsing Platform: verfügbar unter http://www.iso.org/obp

3.2 Symbole und Abkürzungen

ARN Arylamidase
ARS Arylsulfatase
E.C. Enzymklassifikationsnummer nach den Empfehlungen des Nomenklaturkomitees der Interna-
tionalen Vereinigung für Biochemie und Molekularbiologie (Nomenclature Committee of the
International Union of Biochemistry and Molecular Biology, NC-IUBMB)
NAG N-Acetyl-Glucosaminidase
PAC saure Phosphatase
PAK alkalische Phosphatase
PHOS Phosphatase
URE Urease
GAL -Galactosidase
GLU -Glucosidase
GLU -Glucosidase

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 DIN EN ISO 20130:2021-02
EN ISO 20130:2020 (D)

4 Kurzbeschreibung
In diesem Dokument wird ein Verfahren zur gemeinsamen Aktivitätsbestimmung verschiedener Enzyme in
Bodenproben beschrieben (siehe Tabelle 1). Es beruht auf der Verwendung von Lösungen von Bodenproben
und von kolorimetrischen Substraten, welche für festgelegte Zeiträume bei (25 ± 2) °C oder (37 ± 2) °C in
Mikrotiterplatten inkubiert werden. Nach der Inkubation werden die Reaktionen gestoppt, die Platten zentri-
fugiert und die Überstände in neue Platten überführt. Die Färbungsintensitäten werden als Absorption mit
einem 96-Well-Mikrotiterplatten-Spektralphotometer für den UV- und sichtbaren Wellenlängenbereich
gemessen.

Tabelle 1 — Messungen der Enzymaktivität mit kolorimetrischem Verfahren

Boden-
Enzym Abkürzung Nr. abgebautes Makromolekül
kreislauf
Arylamidase ARN E.C. 3.4.11.2 Stickstoff
Arylsulfatase ARS E.C. 3.1.6.1 Schwefel Mineralisation von organischem Schwefel
-Galactosidase -GAL E.C. 3.2.1.22 Kohlenstoff Hemicellulose
-Glucosidase -GLU E.C. 3.2.1.20 Kohlenstoff Stärke und Glykogen
-Glucosidase -GLU E.C. 3.2.1.21 Kohlenstoff Cellulose
N-Acetyl- Chitin und andere -1,4-gebundene
NAG E.C. 3.2.1.52 Kohlenstoff
Glucosaminidase Glucosamin-Polymere
Phosphatase PHOS E.C. 3.1.4.1 Phosphor Phosphatester
Saure Phosphatase PAC E.C. 3.1.4.1 Phosphor Phosphatester
alkalische Phosphatase PAK E.C. 3.1.4.1 Phosphor Phosphatester
Urease URE E.C. 3.5.1.5 Stickstoff Harnstoff

Zur Validierung der Norm wurde ein Ringversuch durchgeführt; eine Zusammenfassung des internationalen
Ringversuchs ist in Tabelle 8 enthalten und die gesamten Daten der Ringversuche sind in Anhang B
beschrieben.

5 Reagenzien

5.1 Pufferlösungen und Reagenzien

5.1.1 Allgemeines

Als Medium wird deionisiertes Wasser verwendet, um die natürlichen Bodenenzymaktivitäten bei dem
pH-Wert des Bodens zu bewerten und auch die Analyse von mehreren Enzymen unter Verwendung derselben
Bodensuspension zu ermöglichen. Das Verhältnis von Boden (in g) zu Wasser (in ml) (4 : 25) wird optimiert,
um Reaktion und Empfindlichkeit zu maximieren und um die Pipettiertechnik zu erleichtern. Die Verwendung
derselben Bodenlösung für die Analyse mehrerer Enzyme führt außerdem zu einer besseren Vergleichbarkeit
der Ergebnisse. Arylamidase wird mit Tris-Pufferlösung, 50 mmol/l, pH-Wert 7,5 gemessen. Saure und
alkalische Phosphatase werden hinzugefügt unter Verwendung von Tris HCl 50 mmol/l mit pH von 5,5 und
Tris-Base 50 mmol/l mit pH 11.

ANMERKUNG Das Volumen kann bei Bedarf entsprechend angepasst werden.

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DIN EN ISO 20130:2021-02
EN ISO 20130:2020 (D)

5.1.2 Tris-Hydrochlorid, 50 mmol/l, pH-Wert 5,5 ± 0,1.

— Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Hydrochlorid (CAS-Nr.: 1185-53-1 — M: 157,6): 7,88 g;

— deionisiertes Wasser: 1 000 ml;

— Salzsäure (HCl) (CAS-Nr. 7647-01-0), 1 mol/l.

7,88 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Hydrochlorid werden in 800 ml deionisiertem Wasser gelöst und

mit Salzsäure (1 mol/l) auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt. Das Volumen wird auf 1 000 ml aufgefüllt. Die
Lagerdauer darf bei (4 ± 2) °C in Glas- oder Polypropylenflasche einen Monat nicht überschreiten.

5.1.3 Tris-Base, 50 mmol/l, pH-Wert 11 ± 0,1.

— Tris(hydroxymethyl)aminomethan (CAS-Nr.: 77-86-1 — M: 121,14): 6,06 g;

— deionisiertes Wasser: 1 000 ml;

— Natriumhydroxid (CAS-Nr. 1310-73-2) (1 mol/l).

6,06 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan werden in 800 ml deionisiertem Wasser gelöst und mit Natrium-
hydroxid (1 mol/l) auf einen pH-Wert von 11 eingestellt. Das Volumen wird auf 1 000 ml aufgefüllt. Die
Lagerdauer darf bei (4 ± 2) °C einen Monat nicht überschreiten.

5.1.4 Tris-Base, 50 mmol/l, pH-Wert 7,5 ± 0,1.

— Tris(hydroxymethyl)aminomethan (CAS-Nr.: 77-86-1 — M:121,14): 6,06 g;

— deionisiertes Wasser: 1 000 ml;

— Salzsäure (HCl) (CAS-Nr. 7647-01-0), 1 mol/l.

6,06 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan werden in 800 ml deionisiertem Wasser gelöst und mit Salzsäure
(1 mol/l) auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Das Volumen wird auf 1 000 ml aufgefüllt. Die Lagerdauer
darf bei (4 ± 2) °C einen Monat nicht überschreiten.

5.1.5 Tris-Base, 100 mmol/l, pH-Wert 12 ± 0,1.

— Tris(hydroxymethyl)aminomethan (CAS-Nr.: 77-86-1 — M: 121,14): 12,11 g;

— deionisiertes Wasser: 1 000 ml;

— Natriumhydroxid (CAS-Nr. 1310-73-2) (5 mol/l).

12,11 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan werden in 800 ml deionisiertem Wasser gelöst und mit Natrium-
hydroxid (5 mol/l) auf einen pH-Wert von 12 eingestellt. Das Volumen wird auf 1 000 ml aufgefüllt. Die
Lagerdauer darf bei (4 ± 2) °C einen Monat nicht überschreiten.

5.1.6 Calciumchlorid-Dihydrat, 0,5 mol/l

— Calciumchlorid-Dihydrat (CAS-Nr.: 10035-04-8 — M: 147,01): 14,7 g;

— deionisiertes Wasser: 200 ml.

14,7 g Calciumchlorid-Dihydrat werden in 200 ml deionisiertem Wasser gelöst. Die Lagerdauer darf bei
(4 ± 2) °C einen Monat nicht überschreiten.

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 DIN EN ISO 20130:2021-02
EN ISO 20130:2020 (D)

5.1.7 Salicylat-Reagens

— Natriumsalicylat, 270 mmol/l (CAS-Nr.: 54-21-7 — M: 160,1): 865 mg

— tri-Natriumcitrat-Dihydrat, 145 mmol/l (CAS-Nr.: 6132-04-3 — M: 294,1): 853 mg

— di-Natriumtartrat-Dihydrat, 60 mmol/l (CAS-Nr.: 6106-24-7 — M: 230,08): 276 mg

— Nitroprussid-Natrium-Dihydrat, 2 mmol/l (CAS-Nr.: 13755-38-9 — M: 297,95): 12 mg

— deionisiertes Wasser: 20 ml.

Das Salicylat-Reagens wird unmittelbar vor der Analyse aus den vorstehend aufgeführten 4 Verbindungen
hergestellt; 865 mg Natriumsalicylat, 853 mg tri-Natriumcitrat-Dihydrat, 276 mg di-Natriumtartrat-Dihydrat
und 12 mg Nitroprussid-Natrium-Dihydrat werden in 20 ml deionisiertem Wasser gelöst.

5.1.8 Cyanurat-Reagens

— tri-Natriumcitrat-Dihydrat, 580 mmol/l (CAS-Nr.: 6132-04-3 — M: 294,1): 3,4 g

— di-Natriumtartrat-Dihydrat, 90 mmol/l (CAS-Nr.: 6106-24-7 — M: 230,08): 414 mg

— Lithiumhydroxid, 280 mmol/l (CAS-Nr.: 1310-65-2 — M: 23,95): 134 mg

— Natriumdichlorisocyanurat-Dihydrat 10 mmol/l (CAS-Nr.: 51580-86-0 — M: 255,98): 51 mg

— deionisiertes Wasser: 20 ml.

Das Cyanurat-Reagens wird unmittelbar vor der Analyse aus den vorstehend aufgeführten 4 Verbindungen
hergestellt; 3,4 g tri-Natriumcitrat-Dihydrat, 414 mg di-Natriumtartrat-Dihydrat, 134 mg Lithiumhydroxid
und 51 mg Natriumdichlorisocyanurat-Dihydrat werden in 20 ml deionisiertem Wasser gelöst.

5.1.9 Ethanol, 96%ig

— Ethanol 96 %ig (CAS-Nr. 41340-36-7).

5.1.10 Angesäuertes Ethanol (0,26 mol/l HCl)

— Salzsäure, ACS-Reinheitsgrad (ACS: American Chemical Society), 37%ig (CAS-Nr. 7647-01-0) 4,32 ml;

— Ethanol, 96%ig (CAS-Nr. 41340-36-7).

4,32 ml konzentrierte HCl werden in 200 ml Ethanol, 96%ig, verdünnt. Die Lagerdauer darf bei (4 ± 2) °C
einen Monat nicht überschreiten.

5.1.11 p-Dimethylaminozimtaldehyd (DMCA) (3,5 mmol/l)

— DMCA (CAS-Nr.: 6203-18-5 — M:175,23): 0,12 g;

— Ethanol, 96%ig (CAS-Nr. 41340-36-7)

0,12 g DMCA werden in 200 ml Ethanol, 96%ig, gelöst. Die Lagerdauer darf bei ( 20 ± 2) °C eine Woche nicht
überschreiten.

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DIN EN ISO 20130:2021-02
EN ISO 20130:2020 (D)

Tabelle 2 — Einsatz von Pufferlösungen für die Messung der Enzymaktivitäten

ARS, -GLU, -GLU, -GAL,
ARN URE PAC PAK
NAG, PHOS
Boden- Tris-Base, 50 mmol/l, deionisiertes Tris-HCl, Tris-Base,
deionisiertes Wasser
lösung pH 7,5 Wasser 50 mmol/l, pH 5,5 50 mmol/l, pH 11
Ethanol, 96%ig Salicylat-
Stopp der Tris, 100 mmol/l, pH 12 Trizma, 100 mmol/l, pH 12
Angesäuertes Ethanol Reagens
Enzym-
reaktion CaCl2 0,5 mol/l Cyanurat- CaCl2, 0,5 mol/l
DMCA
Reagens

5.2 Substrate und Standards

5.2.1 Herstellung von Standardlösungen

5.2.1.1 Para-Nitrophenol (CAS-Nr.: 100-02-7 — PNP) mit einer Konzentration von 3,6 mmol/l

— para-Nitrophenol (PNP) (M: 139,11): 10 mg;

— deionisiertes Wasser: 20 ml.

PNP in Pulverform sollte bei ( 20 ± 2) °C und lichtgeschützt aufbewahrt werden. PNP wird sorgfältig
eingewogen und in deionisiertem Wasser gelöst. Die Arbeitskonzentration beträgt 0,36 mM (d. h. Verdünnung
der konzentrierten Lösung 1/10). Die Lagerdauer der konzentrierten Arbeitskonzentration darf bei
( 20 ± 2) °C zwei Jahre nicht überschreiten. Lösungen können für einen einmaligen Gebrauch oder maximal
3 Gefrier-/Auftauzyklen gleichmäßig aufgeteilt werden

ANMERKUNG Paranitrophenol kann durch längere oder wiederholte Einwirkung beim Verschlucken (H373) Organe
schädigen und bei Kontakt mit der Haut oder beim Einatmen (H302, H312 und H332) schädlich sein. Es müssen geeignete
Lüftungs- und Schutzvorrichtungen verwendet werden.

5.2.1.2 Ammoniumchlorid (NH4Cl) mit einer Konzentration von 62 mmol/l

— Ammoniumchlorid (CAS-Nr.: 12125-02-9 — M: 53,49): 66,4 mg;

— deionisiertes Wasser: 20 ml.

Ammoniumchlorid in Pulverform kann lichtgeschützt bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Ammonium-

chlorid wird sorgfältig eingewogen und in Wasser gelöst. Die konzentrierte Lösung sollte bei ( 20 ± 2) °C für
zwei Jahre aufbewahrt werden. Die Lagerdauer der konzentrierten Lösung darf bei ( 20 ± 2) °C zwei Jahre
nicht überschreiten. Die Arbeitskonzentration beträgt 0,62 mmol/l (Verdünnung 1/100). Die Lagerdauer der
Arbeitskonzentration darf bei ( 20 ± 2) °C zwei Jahre nicht überschreiten.

5.2.1.3 -Naphthylamin, 1 mmol/l

— -Naphthylamin (CAS-Nr.: 91-59-8 — M: 143,19): 35,8 mg;

— Ethanol, 96%ig: 20 ml;

— deionisiertes Wasser.

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 DIN EN ISO 20130:2021-02
EN ISO 20130:2020 (D)

35,8 mg -Naphthylamin werden in 50 ml Ethanol, 96%ig (0,071 %), gelöst. Diese 5 mmol/l Stammlösung
muss bei 20 °C für ein Jahr aufbewahrt werden. Die Arbeitskonzentration beträgt 1 mmol/l (Verdünnung
1/5 in Wasser) und muss bei ( 20 ± 2) °C für ein Jahr aufbewahrt werden.

ANMERKUNG -Naphthylamin hat eine akute Toxizität (oral, dermal, Inhalation), Kategorie 4, Sensibilisierung der
Atemwege, Kategorie 1 und ist gefährlich für die aquatische Umwelt. Augenschilde 1, Vollpartikel-Atemschutzmaske
Typ N100 (US) 2, geeignete Belüftung, spezielle Handschuhe 3, Brille und Schutzschild müssen verwendet werden.

5.2.2 Herstellung von Substratlösungen

Handelsübliche kolorimetrische Substrate werden in Pulverform geliefert und sollten entsprechend den
Spezifikationen in gefrorenem Zustand bei ( 20 ± 2) °C, gekühlt bei (4 ± 2) °C oder bei Raumtemperatur (RT)
aufbewahrt werden. Sämtliche Substrate sollten im Voraus entsprechend den in Tabelle 3 aufgeführten
Anforderungen hergestellt werden.

ANMERKUNG Das Volumen muss hinreichend sein, um eine zuverlässige Einwaage und Messung von Substraten zu
ermöglichen. Es hängt außerdem von der Anzahl der benötigten Platten ab. Beispiele sind in Tabelle 3 angeführt.

Tabelle 3 — Handelsübliche kolorimetrische Substrate für Messungen der Enzymaktivität und deren
Ansatz zum Messen

Mol- Konzen- Lagerung von

Substrata masse tration Beispiele für Lösungen
Enzym
(Lagerungstemperatur) Ansätze (Temperatur,
g/mol mol/l
Dauer)
Arylamidase (S)-2-Amino-4-methyl-N-2-naphthyl- 292,8 0,008 0,234 2 g sind in ( 20 ± 2) °C
valeramidmonohydrochlorid 50 ml deionisier-
tem Wasser zu
( 20 ± 2) °C lösen 1 Jahr
CAS-Nr.: 893-36-7
Arylsulfatase Kalium-4-nitrophenylsulfat 257,26 0,025 0,322 g sind in ( 20 ± 2) °C
50 ml deionisier-
( 20 ± 2) °C tem Wasser zu 1 Jahr
CAS-Nr.: 6217-68-1 lösen

-Galactosidase p-Nitrophenyl- -D-galactopyranosid 301,25 0,05 0,753 g sind in ( 20 ± 2) °C

50 ml deionisier-
( 20 ± 2) °C tem Wasser zu 1 Jahr
CAS-Nr.: 3150-24-1 lösen

-Glucosidase 4-Nitrophenyl- -D-glucopyranosid 301,25 0,025 0,375 g sind in ( 20 ± 2) °C

50 ml deionisier-
( 20 ± 2) °C tem Wasser zu 1 Jahr
lösen
CAS-Nr.: 3767-28-0

1 https://www.sigmaaldrich.com/labware/labware-products.html?TablePage=20009868

2 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=Substance&term=msaadvantageseries1000fullfacerespirator12345
98765+OR+msaultratwinfullfacerespirator1234598765&focus=product&mode=boolean
3 http://www.sigmaaldrich.com/labware/labware-products.html?TablePage=9577418

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Mol- Konzen- Lagerung von

Substrata masse tration Beispiele für Lösungen
Enzym
(Lagerungstemperatur) Ansätze (Temperatur,
g/mol mol/l
Dauer)
-Glucosidase 4-Nitrophenyl- -D-glucopyranosid 301,25 0,05 0,753 g sind in ( 20 ± 2) °C
50 ml deionisier-
( 20 ± 2) °C tem Wasser zu 1 Jahr
lösen
CAS-Nr.: 2492-87-7
N-Acetyl- para-Nitrophenyl-N-acetyl- -D- 342,31 0,01 0,171 g sind in ( 20 ± 2) °C
Glucosaminidase glucosaminid 50 ml deionisier-
( 20 ± 2) °C tem Wasser zu 1 Jahr
lösen
CAS-Nr.: 3459-18-5
Phosphatase, 4-Nitrophenylphosphat-Dinatriumsalz- 371,12 0,05 0,928 g sind in ( 20 ± 2) °C
saure Phos- Hexahydrat 50 ml deionisier-
phatase und (+4 ± 2) °C tem Wasser zu 1 Jahr
alkalische lösen
Phosphatase CAS-Nr.: 333338-18-4
Urease Harnstoff > 98 % 60,06 0,4 0,480 5 g sind in +4 °C
20 ml
(RT) deionisiertem 1 Woche
Wasser zu lösen
CAS-Nr.: 57-13-6
a Sigma-Aldrich ist ein Beispiel für einen Hersteller von kolorimetrischen Substraten. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung
der Anwender dieser Internationalen Norm und bedeutet keine Anerkennung der genannten Produkte durch ISO. Gleichwertige
Produkte dürfen verwendet werden, wenn sie nachweisbar zu identischen Ergebnissen führen.

ANMERKUNG Alle Substrate müssen mit geeigneter Belüftung, speziellen Handschuhen und Schutzschild bearbeitet
werden.

6 Geräte und Materialien

Zusätzlich zur üblichen Laborausrüstung sind folgende Geräte erforderlich:

6.1 Siebe, mit einer Maschenweite von 2 mm, bis zu 5 mm je nach Bodenstruktur und -feuchtigkeit.
ANMERKUNG In Abhängigkeit von der Bodenstruktur können andere Maschenweiten verwendet werden.

6.2 Waage (±0,001 g).

6.3 Kreisschüttler.

6.4 Mikrotiterplatten, 96-Well, Polystyrol, mit unbehandeltem flachem Boden und Deckeln.

6.5 Automatischer Probengeber für Wasser (optional).

ANMERKUNG Im Vergleich zum manuellen Pipettieren verringert ein automatischer Probengeber wesentlich die
Messunsicherheit eingesetzter Volumina.

6.6 Mehrkanal-Mikro(liter)pipetten (50 µl und 200 µl).

6.7 Brutschränke, eingestellt auf (25 ± 2) °C und (37 ± 2) °C.

6.8 Mikrotiterplattenzentrifuge, mit einer Temperaturregelung bei 20 °C und einer Beschleunigung von
1 500 g.

6.9 Mikrotiterplatten-Spektralphotometer, mit Ablesung bei 405 nm ± 5 nm, 540 nm ± 5 nm und

650 nm ± 5 nm (Monochromator oder BP ±10 nm).

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7 Durchführung

7.1 Erstellung von Kalibrierkurven

7.1.1 Allgemeines

Kalibrierkurven erfordern mindestens die Doppel-, vorzugsweise die Dreifachbestimmung mehrerer Kon-
zentrationen von para-Nitrophenol (PNP), Ammoniumchlorid (NH4Cl) oder -Naphthylamin; alle Volumina
sind pro Vertiefung angegeben. Homogenisierungen werden mit einer Mikropipette und 2 oder 3 Ansaug-/
Entleerungsvorgängen durchgeführt. Während der Erstellung der Kalibrierkurven muss die Einwirkung von
Licht begrenzt werden. Beispiele für Kalibrierkurven sind in Anhang B angeführt.

7.1.2 PNP-Lösung

Zur Erstellung der Kalibrierkurve wird die Stammlösung von PNP mit einer Konzentration von 0,36 mmol/l
verwendet. In die Vertiefungen der Mikrotiterplatte werden die für die Mehrfachbestimmung benötigten
Volumina verteilt, um Konzentrationen von 0 nmol/ml, 14 nmol/ml, 29 nmol/ml, 72 nmol/ml, 140 nmol/ml,
220 nmol/ml, 290 nmol/ml und 360 nmol/ml zu erhalten (Tabelle 4).

Tabelle 4 — Erstellung der Kalibrierkurve für para-Nitrophenol in einer 96-Well-Mikrotiterplatte

[PNP]
0 14 29 72 140 220 290 360
nmol/ml
PNP (µl) 0 5 10 25 50 75 100 125
Wasser (µl) 125 120 115 100 75 50 25 0

Um die gelbe Färbung von PNP sichtbar zu machen, werden 25 µl Wasser, 25 µl Calciumchlorid und 100 µl
basischer Tris-Base 100 mmol/l, pH-Wert 12, hinzugefügt. Nach dem Homogenisieren werden 200 µl in neue
Platten überführt und die Messung der Extinktion erfolgt bei 405 nm mit einem Mikrotiterplatten-Spektral-
photometer.

7.1.3 -Naphthylamin-Lösung

Zur Erstellung der Kalibrierkurve wird die Arbeitslösung von -Naphthylamin mit einer Konzentration von
1 mmol/l verwendet. In die Vertiefungen der Mikrotiterplatte werden die benötigten Volumina verteilt, um
Konzentrationen von 0 nmol/ml, 10 nmol/ml, 20 nmol/ml, 50 nmol/ml, 100 nmol/ml, 200 nmol/ml zu
erhalten (Tabelle 5).

Tabelle 5 — Erstellung der Kalibrierkurve für -Naphthylamin in einer 96-Well-Mikrotiterplatte

[ -Naphthylamin]
0 10 20 50 100 200
nmol/ml
-Naphthylamin (µl) 0 1 2 5 10 20
Tris-Pufferlösung, 50 mmol/l, pH 7,5 (µl) 50 49 48 45 40 30
Ethanol, 96%ig (µl) 50 50 50 50 50 50

Um die Färbung von -Naphthylamin sichtbar zu machen, werden 100 µl angesäuertes Ethanol und 100 µl
p-Dimethylaminozimtaldehyd (DMCA) hinzugefügt und gemischt. Nach einer 20-minütigen Inkubation im
Dunklen bei Raumtemperatur erfolgt die Messung der Extinktion bei 540 nm mit einem Mikrotiterplatten-
Spektralphotometer für den UV- und sichtbaren Wellenlängenbereich.

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7.1.4 Ammoniumchlorid-Lösung

Die Stammlösung von Ammoniumchlorid mit einer Konzentration von 62 mmol/l wird 1/100 verdünnt und
die Arbeitslösung mit 0,62 mmol/l (620 nmol/ml) wird für die Erstellung der Kalibrierkurve verwendet. In
die Vertiefungen der Mikrotiterplatte werden die für die Mehrfachbestimmung benötigten Volumina verteilt,
um Konzentrationen von 0 nmol/ml, 6 nmol/ml, 16 nmol/ml, 31 nmol/ml, 62 nmol/ml, 155 nmol/ml,
233 nmol/ml und 310 nmol/ml (Tabelle 6) zu erhalten.

Tabelle 6 — Erstellung der Kalibrierkurve für Ammoniumchlorid in einer 96-Well-Mikrotiterplatte

[NH4Cl]
0 6 16 31 62 155 233 310
nmol/ml
NH4Cl (µl) 0 2 5 10 20 50 75 100

Wasser (µl) 200 198 195 190 180 150 125 100

Zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von NH4Cl werden zu jeder Vertiefung 40 µl Salicylat-
Reagens hinzugefügt. Nach einer Reaktionsdauer von 3 min werden in jede Vertiefung 40 µl Cyanurat-Reagens
gegeben, jeweils gut homogenisiert und anschließend im Dunkeln für 30 min inkubiert (die Extinktion ist für
zwei Stunden stabil). Nach der Inkubation werden die Platten mit einer Mikropipette homogenisiert (2 oder
3 Ansaug-/Entleerungsvorgänge), 200 µl werden in neue Platten überführt und die Messung der Extinktionen
erfolgt bei 650 nm mit einem Mikrotiterplatten-Spektralphotometer für den UV- und sichtbaren
Wellenlängenbereich.

7.2 Probenahme

7.2.1 Probenvorbereitung

7.2.1.1 Homogenisiere

Bodenproben sind nach den Festlegungen von ISO 18400-206 zu entnehmen und zu behandeln. Bei Misch-
proben, die vom Feld entnommen, homogenisiert und durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 2 mm (bis
zu 5 mm je nach Bodenstruktur und -feuchtigkeit) gesiebt wurden, wurde festgestellt, dass sie eine für
Bodenproben angemessen geringe Messunsicherheit erreichten.

Zur Verbesserung der Verbindung zwischen den Aktivitäten in-situ sollten die Proben bis zu vier Tage bei
(15 ± 2) °C gelagert werden. Wenn das nicht möglich ist, treten jedoch die geringsten Änderungen bei einer
Lagerung bei ( 80 ± 5) °C auf. Die Lagerung bei ( 20 ± 2) °C vor oder nach dem Sieben ist nicht geeignet.

Der gesiebte Boden wird homogenisiert und Dreifachproben von genau 4 g werden eingewogen und in
Stehkolben (30 ml bis 60 ml) gegeben. 25 ml deionisiertes Wasser und kreuzförmige Rührstäbchen werden
hinzugefügt. Die Behälter werden verschlossen und der Inhalt wird 10 min in einem Orbitalschüttelgerät
(250 min 1) homogenisiert.

7.2.1.2 Vorbereitung von Proben-Platten

In die Stehkolben werden kreuzförmige Rührstäbchen gegeben und die Bodensuspension muss während des
Pipettierens gerührt werden. Für die Verteilung von parallelen Ansätzen eines festgelegten Volumens nach
Tabelle 7 (Teil A) jeder Bodensuspension in jeweils vier Vertiefungen von Mikrotiterplatten werden
mehrkanalige Mikropipetten (ein Kanal bis drei Kanäle) verwendet und auf jeder Platte wird ein Deckel
angeordnet. Drei Vertiefungen sind Analysenpunkte und eine Vertiefung stellt die Blindprobe (zum Aufzeigen
chemischer Wechselwirkungen mit Verbindungen im Boden) dar. Es wird die gleiche Anzahl von Platten
vorbereitet, wie Enzyme untersucht werden (eine Platte = je ein Enzym).

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ANMERKUNG 1 Ein Beispiel für ein Mikrotiterplattenschema ist in Bild 1 beschrieben.

ANMERKUNG 2 Es besteht die Möglichkeit, dass für humushaltige Böden größere Spitzen zum Pipettieren benötigt
werden.

Legende
S1 Probennummer
a, b, c dreifacher Ansatz der Probe
T Kontroll-Vertiefung für jeden Boden

Bild 1 — Beispiel für die Anordnung der Proben für jedes Enzym in Platten

7.2.2 Substratzugabe

Eine einfache Organisation liegt vor, wenn eine Platte für ein Enzym verwendet wird. Wenn alle Proben in
Platten verteilt sind, werden Mehrkanal-Mikropipetten zum Verteilen der jeweiligen Substrate in dreifacher
Ausführung und zum Homogenisieren durch zwei oder drei Ansaug-/Entleerungsvorgänge verwendet;
anschließend werden die Mikrotiterplatten (Tabelle 7, Teil A) inkubiert. Nach der Inkubation werden die
Reaktionen gestoppt, die Platten 5 min bei 1 500 g zentrifugiert und die Überstände in neue Platten überführt.
Anschließend wird mit einem Spektralphotometer für Mikrotiterplatten die Extinktion gemessen. In Tabelle 7,
Teil B, sind die Protokolle für alle Enzymmessungen zusammengefasst.

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Tabelle 7 — Spezifische experimentelle Einzelheiten für Messungen der Enzymaktivität

A PHOS
ARN ARS -GAL -GLU -GLU NAG PAC URE
INKUBATION
PAK
Bodenlösung (µl) 125 50
Substrat (µl) 25 40
deionisiertes 150
Wasser (µl) 0 (+40 µl in Kontroll-
Vertiefungen)
Inkubationsdauer 2h 4h 2h 1h 1h 1h 0 h 30 3h
Inkubations-
37 °C 25 °C
temperatur
B
STOP-REAKTION
in jeder Vertiefung: in jeder Vertiefung: in jeder Vertiefung:

25 µl CaCl2 40 µl Salicylat-
150 µl Ethanol, 96%ig
Reagens
Stop-Reaktion
40 µl Cyanurat-
100 µl Tris, pH-Wert 12
Reagens
Homogenisieren Homogenisieren Homogenisieren
25 µl in Kontroll-
Substrat 25 µl in Kontroll-Vertiefungen
Vertiefungen
30 min, RT
Inkubation (Raumtemperatur),
im Dunkeln
Zentrifugation 5 min, 1 500 g
Überführung 100 µl 200 µl
100 µl angesäuertes
Ethanol
Nachweis 100 µl DMCA
20 min, RT (Raum-
temperatur), im Dunkeln
Messung = 540 nm = 405 nm = 650 nm

ANMERKUNG 1 Die Inkubationstemperatur wirkt sich auf die Reaktionsgeschwindigkeiten aus und das Optimum hängt
von den Enzymen ab. Für spezifische Zwecke kann eine andere Temperatur als die in dem vorliegenden Dokument
beschriebene Temperatur verwendet werden, z. B. die in-situ-Temperatur.

ANMERKUNG 2 In Bezug auf die Urease-Aktivität ist es notwendig, das freie, durch die Harnstoff-Lösung eingebrachte
Ammonium quantitativ zu bestimmen und von dem nach der Inkubation des Bodens quantitativ bestimmten Ammonium
zu subtrahieren, um das speziell durch die Urease freigesetzte Ammonium zu erhalten. Eine Harnstoffkontrolle wird aus
40 µl Harnstoff, 200 µl deionisiertem Wasser, 40 µl Salicylat-Reagens und 40 µl Cyanurat-Reagens hergestellt. Nach einer
30-minütigen Inkubation werden 200 µl in neue Vertiefung überführt und die Extinktion wird bei 650 nm bestimmt.

Nach der Inkubation werden die Reaktionen in Übereinstimmung mit den enzymspezifischen Protokollen
(Tabelle 7) gestoppt.

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7.2.3 Extinktionsmessungen

7.2.3.1 Messungen von Enzymaktivitäten mit PNP als Reaktionsprodukt (ARS, -GAL, -GLU, -GLU,
NAG, PHOS, PAC, PAK)

Die Zugabe von 25 µl Calciumchlorid und 100 µl basischer Tris-Pufferlösung, pH-Wert 12, stoppt die Reaktion
und ist die entscheidende Maßnahme, um Kolloide zu entfernen, die zu einer Trübung in Lösungen führen,
und den pH-Wert für die quantitative Bestimmung von PNP zu erhöhen. 25 µl Substrat werden in Kontroll-
Vertiefungen gegeben und mit zwei oder drei Ansaug-/Entleerungsvorgängen gemischt. Zudem werden die
Platten 5 min bei 1 500 g und 20 °C zentrifugiert und 200 µl des Überstands werden in eine neue Platte
überführt. Die Messung der Extinktion erfolgt bei = 405 nm mit einem Mikrotiterplatten-
Spektralphotometer für den UV- und sichtbaren Wellenlängenbereich.

7.2.3.2 Messungen von Arylamidase-Aktivitäten (ARN)

Nach der Inkubation werden in alle Vertiefungen (einschließlich Kontrollen) 150 µl Ethanol, 96%ig, und 25 µl
Substrat-Lösung in die Kontroll-Vertiefungen hinzugefügt. Die Platte wird 5 min bei 1 500 g zentrifugiert und
100 µl Überstand werden in eine neue Platte überführt. Zur Bestimmung der Menge an gebildetem
Naphthylamin werden 100 µl angesäuertes Ethanol und 100 µl DMCA in alle Vertiefungen hinzugefügt und
mittels Mikropipette (zwei Ansaug-/Entleerungsvorgänge) gemischt. Nach 20 min erfolgt die Messung der
Extinktion bei 540 nm mit einem Mikrotiterplatten-Spektralphotometer, welches im UV- und sichtbaren
Wellenlängenbereich misst.

7.2.4 Messungen von Urease-Aktivitäten

Nach einer 3-stündigen Inkubation werden zu jeder Vertiefung, einschließlich Kontrollen, 40 µl Salicylat-
Reagens hinzugefügt. Nach einer Reaktionsdauer von 3 min werden in jede Vertiefung 40 µl Cyanurat-Reagens
gegeben. Die kolorimetrische Reaktion erfolgt in 30 min und ist für zwei Stunden stabil. Zudem werden die
Platten 5 min bei 1 500 g und 20 °C zentrifugiert und 200 µl des Überstands werden in eine neue Platte
überführt. Die Messung der Extinktion erfolgt bei = 650 nm mit einem Mikrotiterplatten-
Spektralphotometer für den UV- und sichtbaren Wellenlängenbereich.

8 Berechnung der Ergebnisse

Die Kalibrierkurve wird durch Auftragen der nanomolaren Konzentration (nmol/ml) von PNP,
-Naphthylamin bzw. Ammoniumchlorid gegen die Extinktion erstellt. Die PNP-, -Naphthylamin- bzw.
Ammoniumchlorid-Konzentration der Blindprobe (Cb) und der Probe (Cs) werden aus der Kalibrierkurve
abgelesen.

Beispiele für Kalibrierkurven sind in Anhang B angeführt.

Das Ergebnis wird durch Subtraktion des Messwertes der Blindprobe von der Dreifachbestimmung der Probe
und Multiplikation der Differenz mit dem Verdünnungsfaktor (D) und Bodenvolumen (Vss) sowie Division
durch die Reaktionszeit und Trockenmasse der Probe (Wds) berechnet.

( s b) × × ss
= (1)
× ds

Dabei ist
A die Enzymaktivität in mU/g trockene Probe (nmol/min/g trockene Probe);
Cs die Konzentration des in der Probe gebildeten Produkts (nmol/ml);
Cb die Konzentration des in der Blindprobe gebildeten Produkts (nmol/ml);

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D die Verdünnung der Probe in der Mikrotiterplatte;

Vss das Volumen der Probenlösung (ml);

RT die Reaktionszeit (min);

Wds die Masse der trockenen Probe (g).

9 Angabe der Ergebnisse

Die Ergebnisse werden als Millieinheit für ein Gramm trockenen Boden angegeben, was je Minute und
g Trockenmasse des Bodens der Probe freigesetzten nmol PNP, -Naphthylamin oder Ammoniumchlorid
entspricht. Die für jede Angabe notwendigen Messungen, die Bestimmung der Trockenmasse in Prozent,
müssen aufgeführt werden.

ANMERKUNG Die praktischere und häufig für Enzymaktivität verwendete Einheit ist Einheiten (U) = 1 mol min 1.
Bei Böden wird die Aktivität als Millieinheit für ein Gramm trockenen Boden (mU/g DS) angegeben.

Bodeneigenschaften variieren aufgrund der Geographie, des Klimas und der Bodennutzung stark. Die
Auswertung der Ergebnisse kann sich derzeit nicht auf festgelegte Grenzwerte für jede Enzymaktivität
stützen. Der Versuchsaufbau muss Vergleiche mit einem Kontrollboden oder zwischen Proben von relevanten
Standorten ermöglichen.

10 Gültigkeitskriterien
a) Die Kalibrierkurve ist gültig, wenn die folgenden Kriterien erfüllt sind (entsprechend den in Anhang B
zusammengefassten Ergebnissen des Ringversuchs):

— r2 0,990;

— die Extinktion für den Bereich der PNP-Kalibrierkurve liegt innerhalb von [0,04 bis 1,8] ± 10 %;

— die Extinktion für den Bereich der -Naphthylamin-Kalibrierkurve liegt innerhalb von
[0,06 bis 2,3] ± 10 %;

— die Extinktion für den Bereich der Ammonium-Kalibrierkurve liegt innerhalb von
[0,05 bis 1,6] ± 10 %.

b) Bezüglich der Proben:

— der CV in Prozent (% CV) der Dreifachbestimmungen muss 15 % sein;

— die Extinktion der Harnstoff-Blindprobe muss 0,2 sein;

— bei den Urease-Messungen muss der Leerwert der Probe 1 sein;

— die Differenzen zwischen der Extinktion für Analyse und Leerwert der Probe müssen in Abhängigkeit
von der Empfindlichkeit und Wiederholpräzision des Spektralphotometers 0,02 bis 0,05 sein.

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11 Methodenvalidierung Ringversuch
Die Zusammenfassung des internationalen Ringversuchs ist in Tabelle 8 enthalten und die gesamten Daten
der Ringversuche sind in Anhang B beschrieben.

Tabelle 8 — Zusammenfassende Auswertung der Ringversuche

-GLU -GLU PHOS PAC PAK ARS -GAL NAG URE ARN

CVr 4,0 bis 2,4 bis 4,2 bis 4,3 bis 3,8 bis 2,7 bis 3,9 bis 5,4 bis 5,5 bis 4,3 bis
27,7 % 15,2 % 9,7 % 13,0 % 14,1 % 10,4 % 18,4 % 23,3 % 16,2 % 13,1 %

CVR 9,7 bis 9,5 bis 27,4 bis 12,6 bis 5,7 bis 15,5 bis 21,7 bis 9,8 bis 14,0 bis 15,9 bis
17,9 % 24,0 % 36,5 % 23,0 % 23,3 % 30,5 % 32,6 % 19,6 % 35,9 % 31,9 %

(Abkürzungen: CVr: Variabilitätsbereich der mittleren intralaboratorischen Variationskoeffizienten für alle

Labore (berechnet für jede Aktivität unter Berücksichtigung aller Böden und eines einzelnen Labors). CVR:
Variabilitätsbereich der mittleren Interlaborkoeffizienten der Variation für alle Böden (berechnet für jede
Aktivität unter Berücksichtigung aller Laboratorien und eines einzelnen Bodens).

12 Prüfbericht
Der Prüfbericht muss folgende Angaben enthalten:

a) eine Verweisung auf dieses Dokument, d. h. ISO 20130:2018;

b) eine angemessene Identifizierung der Probe;

c) Einzelheiten zu Lagerungstemperatur und -dauer;

d) Bodenart, eine physikalische und chemische Charakterisierung des Bodens, Wassergehalt, Boden-
temperatur zum Zeitpunkt der Probenahme (pH-Wert der Bodenprobe);

e) angewendete Inkubationsbedingungen;

f) Prüfergebnisse;

g) sämtliche Einzelheiten, die nicht in diesem Dokument festgelegt oder optional sind, sowie sämtliche
Wirkungen, die die Ergebnisse beeinflusst haben könnten.

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Anhang A
(informativ)

Validierung des Verfahrens und Ringversuche zur Bewertung von

Enzymaktivitäten im Boden mit einem kolorimetrischen Verfahren

A.1 Zweck
Die Gültigkeit des in diesem Dokument beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung der Enzymaktivitäten im
Boden in Mikrotiterplatten mit kolorimetrischen Verfahren wird bewertet. Die Validierung erfolgt aufgrund
von Vergleichsprüfungen in Bezug auf Spezifität, Empfindlichkeit, Linearität, spezifische Betriebsparameter
und die Robustheit in Bezug auf verschiedene Bearbeiter.

A.2 Hintergrund
Der Ringversuch wird in der Arbeitsgruppe ECOSYS, Plattform Biochem-Env, INRA, Frankreich, durchgeführt.

A.3 Prüfmaterialien und Methodologie

Die Auswirkung des Siebens wurde auf die Aktivitäten von PHOS, GLU, ARS, GAL, NAG, URE und ARN an
4 Böden (1 sandiger Boden, 1 lehmiger Tonboden, 2 Schlufflehmböden) untersucht.

Auswirkungen des pH-Wertes: Es wurden zwei Böden auf alle Enzymaktivitäten untersucht. Die Ansätze
erfolgten in Wasser oder Tris-Pufferlösung (50 mmol/l) bei pH-Werten 5 bis 9.

Auswirkung der Inkubationsdauer: Für jedes Enzym wurden 4 Inkubationsdauern gewählt, um die Robustheit
des Verfahrens nach Tabelle A.1 zu bewerten.

Tabelle A.1 — Bereich der an den Enzymaktivitäten untersuchten Inkubationsdauern

PHOS-PAC-
Enzyme ARN ARS -GAL -GLU -GLU NAG URE
PAK
Inkubations- 30-60- 60-120- 60-120- 30-60-90- 30-60-90- 30-60-90- 15-30-45- 60-120-
dauern (min) 120-180 180-240 180-240 120 120 120 60 180-240

Auswirkung des Bearbeiters: Zur Beurteilung wurden alle Enzymaktivitäten von vier Bearbeitern an
drei Böden bestimmt.

Die Spezifität für jedes Enzym wird an einem lehmigen Tonboden mit oder ohne Autoklavieren untersucht.

Validierungsparameter: Linearität des Produktnachweises: Die Kalibrierkurven wurden mit PNP (0 µmol/l bis
600 µmol/l), Ammoniumchlorid (0 µmol/l bis 600 µmol/l) und -Naphthylamin (0 µmol/l bis 300 µmol/l)
erstellt.

Linearität der Bodenreaktion: Bodenlösungen mit 0,5 g bis 12 g Boden und 25 ml destilliertem Wasser wurden
zur Messung von Enzymaktivitäten verwendet.

Bestimmungsgrenzen und Präzision: Streuparameter werden mit einem Genauigkeitsprofil bestimmt, das
ISO 17025 und die Schätzung der Messunsicherheit kombiniert. Das Verfahren beruht auf der Verwendung
des aus den Leistungskriterien, wie z. B. Richtigkeit und Präzision, abgeleiteten Gesamtfehlers. [4] [12]. Vier
Böden (sandiger, lehmiger, Ton- und Humusboden) wurden dreifach mit 3 Wiederholungen (Wiederhol-
präzision) und 6 Reihen (Präzision unter Zwischenbedingungen) analysiert.

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A.4 Datenanalyse
Robustheit des Verfahrens

Auswirkung des Bearbeiters: unabhängig vom betrachteten Enzym liegt keine Auswirkung des Bearbeiters
vor.

Auswirkung des Siebens: bei allen Enzymen und Böden, außer bei NAG in zwei Böden (einige Beispiele sind in
Tabelle A.2 angeführt) wurde kein signifikanter Unterschied festgestellt.

Tabelle A.2 — Auswirkung des Siebens auf Enzymaktivitäten

Maschen- Enzymaktivitäten (n = 3, mU/g trockener Boden)

Böden
weite PHOS -GLU ARS -GAL NAG
5 mm 11,20 ± 0,53 7,67 ± 0,50 1,08 ± 0,04 1,10 ± 0,02 0,82 ± 0,16
sandiger Boden
2 mm 10,47 ± 1,22 7,36 ± 0,12 1,22 ± 0,15 1,13 ± 0,17 0,93 ± 0,39
5 mm 20,09 ± 0,56 11,14 ± 0,17 3,52 ± 0,05 1,39 ± 0,09 1,84 ± 0,08
lehmiger Tonboden
2 mm 21,82 ± 1,37 11,70 ± 0,12 3,69 ± 0,07 1,55 ± 0,09 1,49 ± 0,03
5 mm 18,87 ± 0,16 7,38 ± 0,07 4,47 ± 0,30 0,95 ± 0,07 1,31 ± 0,37
Schlufflehmboden
2 mm 17,34 ± 0,28 7,61 ± 1,25 4,63 ± 0,09 0,93 ± 0,04 1,14 ± 0,35
5 mm 19,10 ± 1,04 4,86 ± 0,40 1,45 ± 0,06 0,94 ± 0,14 1,74 ± 0,29
Schlufflehmboden
2 mm 18,39 ± 0,66 4,75 ± 0,10 1,47 ± 0,08 0,97 ± 0,09 1,05 ± 0,22

Auswirkung des pH-Wertes: für das PNP-Enzymmodell geben mehrere Autoren eine optimale Aktivität bei
einem pH-Wert von etwa 6 an (siehe Literaturhinweise [5], [22]) und für die Aktivität von Arylamidase und
Urease bei einem pH-Wert von etwa 8. Die Ergebnisse zeigten, dass für PNP-Enzyme ( -GLU, -GLU, -GAL,
PHOS, ARS und NAG) [Bild A.1 a)] optimale Aktivitäten in Tris, 50 mmol/l, pH 5 bis 6,5, jedoch höhere
Aktivitäten mit destilliertem Wasser vorlagen. Die Ergebnisse für die Urease-Aktivitäten sind sehr ähnlich
[Bild A.1 b)]. Im Gegensatz dazu ist die Arylamidase sehr empfindlich in Bezug auf den pH-Wert der
Lösung/des Bodens [Bild A.1 c)] und optimale Bedingungen liegen bei Tris, 50 mmol/l, pH-Wert 7,5 bis 8, vor.

a) Auswirkung von Pufferlösung auf die Aktivität von GLU, GAL und NAG

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b) Auswirkung des pH-Wertes auf die Urease-Aktivität

c) Auswirkung des pH-Wertes auf die Arylamidase-Aktivität Legende

Legende
X pH-Wert schluffiger Boden in Wasser
Y Enzymaktivität (mU/g) Tris-Pufferlösung, 50 mmol/l
A Aktivität in Wasser Wasser
Tonboden mit Pufferlösung Schlufflehmboden
schluffiger Boden mit Pufferlösung lehmiger Tonboden
Tonboden in Wasser

Bild A.1 — Auswirkung des pH-Wertes auf Enzymaktivitäten

Auswirkung der Inkubationsdauer: die Ergebnisse zeigten, dass mehrere Enzymaktivitäten in Abhängigkeit
von der Inkubationsdauer sehr robust sind, hauptsächlich bei der PNP-Messung [Bild A.2 a)], solange sie im
linearen Bereich der quantitativen Bestimmung von PNP bleiben. Bei Urease [Bild A.2 b)] ergeben kurze
Inkubationsdauern keine guten Aktivitäten und bei Arylamidase (Daten nicht dargestellt) rufen lange
Inkubationsdauern eine Sättigung der Reaktion hervor. In Tabelle A.3 sind offene Bereiche für Inkubationen
dargestellt (fett gedruckte Daten sind die gewählten Inkubationsdauern in der ISO-Norm).

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Tabelle A.3 — Für Enzymaktivitäten ausgewählte Inkubationsdauern

PHOS-PAC-
Enzyme ARN ARS -GAL -GLU -GLU NAG URE
PAK
Inkubations- 60-120- 120-180- 30-60-90- 30-60-90- 30-60-90- 15-30-45-
60-120 180-240
dauern (min) 180-240 240 120 120 120 60

a) Kinetik von Enzymaktivitäten

b) Kinetik der Urease-Aktivität

Legende
A Enzymaktivität (mU/g trockener Boden); Urease-Aktivität (mU/g trockener Boden)

Bild A.2 — Auswirkung der Inkubationsdauer auf Enzymaktivitäten

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A.5 Validierungsparameter
Tabelle A.5 — Zusammenfassung der Validierungsparameter

ARN ARS -GAL -GLU -GLU NAG PHOS URE

Spezifität Nach der Sterilisation wurde keine Aktivität im Boden nachgewiesen.
Nachweisgrenze (LOD) 4 pmol 0,7 nmol 0,7 nmol 0,7 nmol 0,7 nmol 0,7 nmol 0,7 nmol 0,2 nmol
Bestimmungsgrenze (LOQ) 11 pmol 2 nmol 2 nmol 2 nmol 2 nmol 2 nmol 2 nmol 0,5 nmol
0 µM bis
Linearität des Nachweises 0 µM bis 600 µmol/l
250 µmol/l
Linearität der Reaktion 0,5 g bis 0,5 g bis
1 g bis 10 g
(g Boden in 25 ml Wasser) 8g 12 g
Präzision 4% 4% 4% 4% 4% 4% 4% 3%
Wiederholpräzision (%) nd 9% 9% 9% 9% 9% 9% 9%
Präzision unter Zwischen-
bedingungen (%)
Unsicherheitsbereich 10 % bis 6 % bis
11 % bis 14 %
(U95%) 15 % 15 %

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Anhang B
(informativ)

Internationaler Ringversuch zur Bewertung von Enzymaktivitäten im

Boden mit einem kolorimetrischen Verfahren

B.1 Zweck
Dieser internationale Ringversuch dient zur Messung der Variabilität des in diesem Dokument beschriebenen
Verfahrens zur Bestimmung von Enzymaktivitäten im Boden in Mikrotiterplatten mit kolorimetrischen
Verfahren.

Für jede Tabelle ist die Legende: nd steht für nicht bestimmt; na steht für Wert nicht anwendbar,
* experimenteller Fehler; ** Ausreißer (p < 0,05).

B.2 Hintergrund
Der Ringversuch für dieses Dokument begann im Dezember 2015 und endete im Juli 2016. An dem
internationalen Versuch nahmen acht Laboratorien teil: i) University of Aveiro and Centre of Environmental
and Marine Studies (CESAM), Portugal; ii) Central Institute for Supervising and Testing in Agriculture (CISTA),
Tschechische Republik; iii) Facultad de Farmacia y Madrid, department edafologia, Spanien iv) INERIS,
Frankreich, v) ESITPA, Frankreich, vi) UMR Eco&Sols, INRA, Montpellier, Frankreich vii) Unit ECOSYS,
Biochem-Env Platform, INRA, Frankrreich, viii) University Complutense of Madrid, Spanien.

Auf der einführenden Sitzung wurde ein Film zum Versuchsplan präsentiert.

B.3 Prüfmaterialien und Methodologie

Insgesamt 6 Böden für die Vorversuche (zwei Grünland- und vier Ackerböden) und alle Prüfchemikalien
wurden an die Laboratorien versandt. Die Eigenschaften der Böden sind in Tabelle B.1 dargestellt.

Die Teilnehmer wurden gebeten, die Reagenzien nach dem Eintreffen entsprechend den Empfehlungen dieses
Dokumentes im Dunklen bei Raumtemperatur oder 4 °C aufzubewahren. Vor Beginn des Ringversuchs
wurden Teilnehmer aufgefordert die Standardkurve zu testen, um jedes Mikroplatten-Lesegerät zu
kalibrieren, und Reagenzien nach den Prüfvorschriften herzustellen. Die Böden wurden nach Lufttrocknung
versandt und verwendet.

Tabelle B.1 — Bodeneigenschaften

Ntot Boden-
BÖDEN % SCHLUFF % SAND % TON pH-Wert OC CEC
nutzung
g/kg g/kg
1 13,0 76,2 10,8 5,6 21,9 1,24 nd Grünland
2 56,2 27,1 16,7 7,4 10,0 1,01 11,5 Acker
3 63,5 19,7 16,8 5,5 25,7 2,5 8,1 Grünland
5 78,3 6,70 15,0 6,6 10,5 1,0 7,9 Acker
6 79,3 16,1 14,6 6,0 11,45 1,19 6,1 Acker
7 66,5 9,6 23,4 8,5 14,3 1,2 16,9 Acker

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Die Genauigkeit der Kalibrierkurven und der Bodenmesswerte wurden getrennt nach ISO 5725-2 bewertet.
Die Wiederholpräzision und durchschnittliche Genauigkeit wurden in Anhang A bewertet und die Reprodu-
zierbarkeit in Anhang B. Mittelwerte und relative Standardabweichungen wurden berechnet, um das
Leistungsverhalten des Verfahrens (maximale Streuung) zu schätzen (OC: organischer Kohlenstoff;
Ntot: Gesamtstickstoff; CEC: Kationenaustauschkapazität; nd: nicht bestimmt).

B.4 Auswertung der Ergebnisse der Kalibrierkurve

Die Daten für die Kalibrierung von PNP, -Naphthylamin oder Ammoniumchlorid sind in Tabelle B.2,
Tabelle B.3 und Tabelle B.4 angeführt. Die eingetragenen Werte und unter Anwendung der linearen
Regression angepassten Kurven sind in Bild B.1 für PNP, in Bild B.2 für -Naphthylamin und in Bild B.3 für
Ammoniumchlorid dargestellt.

Die Ergebnisse für die Wiederholpräzision der Kalibrierkurve für PNP (siehe Tabelle B.2) weisen eine gute
Präzision mit CVr 5 % oberhalb von 29 nmol/ml und für die Reproduzierbarkeit mit CVR 13 % unterhalb
von 29 nmol/ml nahe der Bestimmungsgrenze, auf. Dieses Verfahren ermöglicht auch eine gute Vergleich-
präzision mit CV 10 % bei jeder Konzentration.

Tabelle B.2 — Ergebnisse der Extinktionsmessung für PNP-Standards

PNP Stei-
14 29 72 140 220 290 360 r2
nmol/ml gung

LAB1 Mittelwert 0,125 0,201 0,463 0,872 1,270 1,664 2,027

0,005 5 0,999
n=3 % CVr 1,35 % 1,00 % 1,64 % 1,68 % 0,35 % 0,48 % 0,50 %
LAB2 Mittelwert 0,103 0,176 0,396 0,761 1,114 1,481 1,833
0,005 0 1,000
n=2 % CVr 0,00 % 0,00% 0,00% 0,00% 4,23 % 0,00 % 0,00%
LAB3 Mittelwert 0,114 0,192 0,416 0,755 1,145 1,509 1,862
0,005 0 1,000
n = 10 % CVr 13,09 % 5,47 % 2,99 % 5,85 % 2,35 % 1,41 % 1,66 %
LAB4 Mittelwert 0,095 0,167 0,383 0,750 1,128 1,447 1,773
0,004 9 0,999
n=4 % CVr 3,24 % 1,72 % 1,16 % 1,00 % 2,76 % 0,38 % 0,37 %
LAB5 Mittelwert 0,124 0,185 0,380 0,713 1,040 1,372 1,696
0,004 5 1,000
n=5 % CVr 9,43 % 2,48 % 1,13 % 1,09 % 0,50 % 0,72 % 0,96 %
LAB6 Mittelwert 0,104 0,166 0,361 0,696 1,031 1,376 1,712
0,004 6 1,000
n=1 % CVr

LAB7 Mittelwert 0,108 0,176 0,379 0,722 1,049 1,388 1,718

0,004 6 1,000
n = 12 % CVr 10,47 % 6,97 % 4,01 % 2,80 % 2,73 % 2,34 % 1,87 %
Mittelwert 0,110 0,180 0,397 0,753 1,111 1,462 1,803 0,004 9
SD 0,010 0,012 0,031 0,054 0,078 0,096 0,108 0,000 3 1,000
% CVR 9,30 % 6,72 % 7,84 % 7,11 % 6,98 % 6,58 % 6,02 % 6,20

(Abkürzungen: SD: Standardabweichung; %CVr: Variationskoeffizient für die Wiederholpräzision im Labor;

%CVR: Variationskoeffizient für die Reproduzierbarkeit im Labor; n: Anzahl der Messungen)

Bezüglich der Präzision bei -Naphthylamin (siehe Tabelle B.3) ist der CVr der Vergleichpräzision 10 % und
der CVR der Vergleichpräzision 20 % (außer bei 10 nmol/ml nahe der Bestimmungsgrenze).

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Tabelle B.3 — Ergebnisse der Extinktionsmessung für -Naphthylamin-Standards

-Naphthylamin
10 20 50 100 200 Steigung r2
nmol/ml
LAB1 Mittelwert 0,212 0,265 0,545 1,073 2,064
0,010 0,999
n=3 % CVr 7,10 % 7,20 % 9,52 % 4,08 % 5,79 %

LAB2 Mittelwert 0,258 0,388 0,719 1,372 2,949

0,014 0,996
n=2 % CVr 2,52 % 1,03 % 7,65 % 7,91 % 2,53 %

LAB3 Mittelwert 0,135 0,211 0,432 0,889 1,828

0,009 0,998
n = 10 % CVr 8,15 % 3,35 % 1,32 % 4,78 % 2,12 %

LAB4 Mittelwert 0,157 0,283 0,642 1,164 2,270

0,011 1,000
n=4 % CVr 3,18 % 5,49 % 2,88 % 0,21 % 1,37 %

LAB5 Mittelwert 0,144 0,268 0,593 1,251 2,431

0,012 1,000
n=2 % CVr 5,34 % 0,67 % 0,96 % 4,24 % 5,67 %

LAB6 Mittelwert 0,208 0,299 0,752 1,216 2,449

0,012 0,997
n=1 % CVr

LAB7 Mittelwert 0,186 0,279 0,632 1,248 2,417

0,012 1,000
n=6 % CVr 1,99 % 8,10 % 3,21 % 3,55 % 3,69 %

Mittelwert 0,186 0,285 0,616 1,173 2,344 0,011

SD 0,040 0,049 0,100 0,143 0,325 0,002 1,000
% CVR 21,81 % 17,34 % 16,19 % 12,22 % 13,87 % 13,54

(Abkürzungen: SD: Standardabweichung; %CVr: Variationskoeffizient für die Wiederholpräzision im Labor;

%CVR: Variationskoeffizient für die Reproduzierbarkeit im Labor; n: Anzahl der Messungen)

Bezüglich der Präzision bei Ammoniumchlorid (siehe Tabelle B.4) ist der CVr der Vergleichpräzision 6%
und der CVR der Vergleichpräzision 20 % (außer bei 6 nmol/ml, nahe der Bestimmungsgrenze).

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Tabelle B.4 — Ergebnisse der Extinktionsmessung für Ammoniumchlorid-Standards

NH4Cl
6 16 31 62 155 233 310 Steigung r2
nmol/ml
LAB1 Mittelwert 0,085 0,129 0,207 0,376 0,859 1,284 1,667
0,005 5 0,999
n=3 % CVr 2,07 % 2,44 % 2,50 % 6,40 % 1,15 % 1,46 % 0,23 %

LAB2 Mittelwert 0,101 0,147 0,230 0,411 0,907 1,362 1,821

0,004 1 0,953
n=2 % CVr 0,00 % 0,68 % 0,22 % 1,10 % 0,66 % 1,95 % 0,38 %

LAB3 Mittelwert 0,062 0,181 0,330 0,804 1,199 1,606

na 0,003 8 0,946
n = 10 % CVr 13,40 % 6,58 % 4,54 % 1,39 % 1,63 % 1,19 %

LAB4 Mittelwert 0,068 0,074 0,180 0,325 0,766 1,112 1,514

0,003 5 0,958
n=4 % CVr 3,70 % 3,40 % 1,11 % 0,77 % 0,13 % 0,45 % 1,49 %

LAB5 Mittelwert
falsche Lesewellenlänge
% CVr

LAB6 Mittelwert 0,078 0,118 0,176 0,278 0,682 0,977 1,317

0,003 0 0,944
n=1 % CVr

LAB7 Mittelwert 0,072 0,113 0,183 0,327 0,781 1,176 1,572

0,003 6 0,948
n=6 % CVr 8,19 % 5,30 % 3,77 % 2,35 % 1,77 % 2,41 % 2,36 %

Mittelwert 0,078 0,116 0,193 0,341 0,800 1,185 1,583 0,004 9

SD 0,013 0,024 0,019 0,042 0,071 0,122 0,153 0,000 3 1,000
% CVR 16,51 % 20,91 % 9,96 % 12,35 % 8,90 % 10,33 % 9,65 % 6,20

(Abkürzungen: SD: Standardabweichung; %CVr: Variationskoeffizient für die Wiederholpräzision im Labor;

%CVR: Variationskoeffizient für die Reproduzierbarkeit im Labor; n: Anzahl der Messungen)

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Legende
X PNP-Konzentration (nmol/ml)
Y Extinktion bei 405 nm

Bild B.1 — Kalibrierkurve für PNP

Legende
X -Naphthylamin-Konzentration (nmol/ml)
Y Extinktion bei 540 nm

Bild B.2 — Kalibrierkurve für -Naphthylamin

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Legende
X NH4Cl-Konzentration (nmol/ml)
Y Extinktion bei 650 nm

Bild B.3 — Kalibrierkurve für NH4Cl-Standards

B.5 Auswertung der Ergebnisse der Bodenenzymaktivitätsmessungen

Im Allgemeinen haben alle Laboratorien die Messungen der Enzymaktivitäten im Boden erfolgreich
durchgeführt, mit Ausnahme von Laboratorium 5, bei dem ein experimenteller Fehler aufgetreten ist, in Bezug
auf die Urease-Aktivitäten und Laboratorium 2, das bei Urease, saurer und alkalischer Phosphatase Boden 5
nicht bestimmt.

Bei den Messungen der Enzymaktivitäten wurden sechs bis sieben gültige Datensätze erhalten. In den
gesamten Ergebnissen des Ringversuchs wurden nur 2,7 % Ausreißer (11/411) ermittelt, was auf die
Robustheit der Verfahren hinweist. Die Ergebnisse der Variabilität zwischen Laboratorien sind in Tabelle B.5
bis Tabelle B.15 N1) für alle Enzyme angeführt, wobei % CVr für die Wiederholpräzision innerhalb eines
Laboratoriums berechnet wird und % CVR der CV der Vergleichpräzision für jeden Boden zwischen Labora-
torien ist. Die Ausreißer wurden mit den Gubbs-Tests am R-Projekt, (Programm-)Paket „Ausreißer“
bestimmt. [13]

N1) Nationale Fußnote: Die korrekte Verweisung lautet Tabelle B.14.

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Tabelle B.5 — Zusammenfassung der Ringversuchsergebnisse für die -Glucosidase-Aktivität

BODEN1 BODEN2 BODEN3 BODEN5 BODEN6 BODEN7 TOTAL

-GLUCOSIDASE Mittel- Mittel-

%CVr Mittel- %CVr Mittel %CVr Mittel- %CVr Mittel %CVr Mittel- %CVr wert
wert wert wert wert wert wert von CVr

LAB1 0,35 7,11 0,50 1,99 2,00 2,11 0,83 4,3 0,62 9,84 2,43 3,37 4,8
LAB2 0,28 3,09 0,49 1,75 1,50 4,98 0,61 1,2 0,52 5,10 1,96 8,04 4,0
LAB3 0,30 10,97 0,52 42,27 1,80 6,38 8,73* 4,6 0,48 24,21 5,67* 13,97 17,1
LAB4 0,28 6,55 0,46 8,80 1,80 7,81 0,76 9,0 0,47 10,92 1,82 6,65 8,3
LAB5 0,34 18,49 0,42 70,95 1,66 8,05 1,10 10,1 0,42 45,43 2,30 13,10 27,7
LAB6 0,29 9,63 0,51 12,18 1,52 22,51 0,78 9,3 0,52 8,26 1,77 5,39 11,2
LAB7 0,25 18,67 0,62 40,64 1,64 41,90 0,82 0,0 0,71 6,73 2,48 20,24 21,36
Mittelwert 0,30 10,64 0,50 25,51 1,70 13,39 0,82 5,50 0,53 15,78 2,13 10,11 13,49

n Laboratorien 7 7 7 6 7 6
SD 0,03 0,06 0,16 0,15 0,09 0,29
% CVR 11,2 11,4 9,7 17,9 17,1 13,7

Tabelle B.6 — Zusammenfassung der Ringversuchsergebnisse für die -Glucosidase-Aktivität

BODEN1 BODEN2 BODEN3 BODEN5 BODEN6 BODEN7 TOTAL

-GLUCOSIDASE Mittel- Mittel-

%CVr Mittel- %CV Mittel- %CVr Mittel- %CV Mittel- %CVr Mittel- %CV wert
wert wert r wert wert r wert wert r
von CVr

LAB1 7,9 5,3 11,5 0,3 25,1** 0,4** 12,1 1,2 9,84** 7,5** 16,5 2,8 2,4
LAB2 6,7 8,5 9,3 0,6 15,3 28,7 8,4 4,6 6,4 8,6 10,9 8,3 9,9
LAB3 6,0 8,8 7,1 0,4 17,1 4,0 7,5 6,9 7,2 2,2 8,7 6,7 4,8
LAB4 5,4 9,9 7,1 0,4 15,9 7,4 8,2 3,3 5,5 7,9 9,4 2,4 5,2
LAB5 8,1 1,8 8,4 0,3 17,2 3,5 7,2 10,7 6,2 5,2 9,2 12,0 5,6
LAB6 6,6 8,6 8,7 0,5 16,1 6,6 8,9 2,9 6,9 2,9 12,4 11,3 5,5
LAB7 6,5 17,6 9,2 1,5 20,3 15,6 10,6 17,4 7,3 18,8 na 20,24 15,19
Mittelwert 6,74 8,65 8,75 0,59 16,99 10,97 8,99 6,71 6,61 7,58 11,17 9,12 6,94

n Laboratorien 7 7 6 7 6 6
SD 0,88 1,40 1,62 1,63 0,63 2,68
%CVR 13,1 16,0 9,5 18,1 9,5 24,0

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Tabelle B.7 — Zusammenfassung der Ringversuchsergebnisse für die Phosphatase-Aktivität

BODEN1 BODEN2 BODEN3 BODEN5 BODEN6 BODEN7 TOTAL

PHOSPHATASE Mittel- Mittel-

%CVr Mittel- %CV Mittel- %CVr Mittel- %CV Mittel- %CVr Mittel- %CV wert
wert wert r wert wert r wert wert r
von CVr

LAB1 30,6 4,5 19,6 2,4 88,1 2,6 29,2 10,0 36,5 6,8 18,4 2,1 4,7
LAB2 19,2 4,3 15,2 2,8 73,6 1,8 20,4 10,7 23,9 6,9 10,4 14,7 6,9
LAB3 15,9 8,1 12,2 8,9 62,8 5,0 14,4 12,2 23,9 2,2 8,7 18,5 9,2
LAB4 18,4 3,4 13,1 0,5 55,6 8,8 17,4 3,3 20,4 8,2 12,5 0,7 4,2
LAB5 10,0 3,8 8,0 4,2 26,9 3,9 11,6 2,5 11,7 5,3 6,7 6,9 4,4
LAB6 27,2 4,5 21,0 10,0 89,5 3,3 23,3 1,2 36,4 0,8 21,1 16,6 6,1
LAB7 23,0 19,5 16,6 7,6 88,3 7,5 22,6 3,6 25,9 12,4 14,2 7,6 9,73
Mittelwert 20,62 6,89 15,12 5,22 69,25 4,70 19,84 6,22 25,52 6,07 13,15 9,61 6,45

n Laboratorien 7 7 7 7 7 7
SD 6,44 4,14 21,26 5,50 8,11 4,80
%CVR 31,2 27,4 30,7 27,7 31,8 36,5

Tabelle B.8 — Zusammenfassung der Ringversuchsergebnisse für die Aktivität von saurer
Phosphatase
BODEN1 BODEN2 BODEN3 BODEN5 BODEN6 BODEN7 TOTAL
SAURE Mittel-
PHOSPHATASE Mittel- %CVr Mittel- %CVr Mittel- %CVr Mittel- %CVr Mittel- %CV Mittel %CV wert
wert wert wert wert wert r wert r
von CVr

LAB1 33,7** 7,78** 22,9 17,0 84,8 4,0 34,4** 11,3** 44,4 6,4 18,3 2,8 7,5
LAB2 19,7 17,0 15,9 10,0 44,1 9,0 nd 22,4 20,7 9,3 8,4 13,0
LAB3 21,0 0,4 14,7 22,7 71,4 2,8 17,5 4,6 28,0 5,4 11,3 14,0 8,3
LAB4 17,9 5,9 14,2 2,0 56,6 8,7 18,5 3,8 21,7 1,7 10,4 13,1 5,9
LAB5 20,8 8,2 15,3 5,1 53,9 3,0 21,6 5,4 24,8 1,7 11,2 2,5 4,3
LAB6 22,4 7,3 20,7 5,6 69,5 7,8 23,0 1,5 32,5 9,4 15,1 14,4 7,7
LAB7 26,6 16,6 26,0 21,0 80,5 20,7 24,8 7,0 34,3 1,7 14,4 5,0 11,98
Mittelwert 21,41 9,25 18,53 11,90 65,82 7,99 21,08 4,46 29,75 6,71 12,85 8,59 8,39

n Laboratorien 6 7 7 5 7 7
SD 2,70 4,32 13,72 2,75 4,80 2,95
%CVR 12,6 23,3 20,8 13,1 16,1 23,0

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 DIN EN ISO 20130:2021-02
EN ISO 20130:2020 (D)

Tabelle B.9 — Zusammenfassung der Ringversuchsergebnisse für die Aktivität von alkalischer
Phosphatase
BODEN1 BODEN2 BODEN3 BODEN5 BODEN6 BODEN7 TOTAL

ALKALISCHE Mittel-
PHOSPHATASE Mittel- Mittel- %CV Mittel- Mittel- Mittel- %CV Mittel- %CV wert
%CVr r %CVr %CVr r r
wert wert wert wert wert wert von
CVr

LAB1 7,5 9,0 14,8 1,0 34,0 2,4 22,4 3,9 6,5 5,2 30,8 1,2 3,8
LAB2 6,7 6,2 14,5 7,0 26,4 7,0 nd 9,0 2,2 34,0 5,5 5,6
LAB3 9,1 12,9 14,2 10,2 29,4 18,5 21,1 9,1 8,5 29,4 29,9 4,4 14,1
LAB4 7,1 6,1 13,8 1,9 29,1 3,9 21,0 3,7 5,3 4,3 28,4 6,3 4,4
LAB5 13,7** 3,1** 20,1 5,8 34,0 5,0 28,0 5,4 10,6 0,6 29,9 3,2 4,0
LAB6 7,7 9,9 13,5 13,7 23,2 17,6 20,8 1,4 5,7 18,9 29,7 9,5 11,8
LAB7 7,8 4,7 18,1 17,2 31,6 2,8 31,2 8,4 8,0 26,9 2,1** 33,1** 12,01
Mittelwert 7,63 8,14 15,59 8,13 29,65 8,17 24,10 5,31 7,65 12,49 30,44 5,00 7,95

n Laboratorien 6 7 7 6 7 6
SD 0,73 2,34 3,66 4,06 1,78 1,74
%CVR 9,6 15,0 12,4 16,9 23,3 5,7

Tabelle B.10 — Zusammenfassung der Ringversuchsergebnisse für die Arylsulfatase-Aktivität

BODEN1 BODEN2 BODEN3 BODEN5 BODEN6 BODEN7 TOTAL
ARYL- Mittel-
SULFATASE Mittel %CVr Mittel- %CV Mittel- %CVr Mittel- %CVr Mittel- %CVr Mittel %CVr wert
wert wert r wert wert wert wert von CVr

LAB1 5,5** 7,3** 3,6 0,8 11,5 0,2 5,1 1,9 7,1 8,8 7,1 1,9 2,7
LAB2 2,7 13,5 1,6 5,2 12,3 10,3 2,8 11,9 3,1 5,0 3,1 14,5 10,1
LAB3 3,4 8,4 2,6 8,5 15,8 0,6 4,1 3,0 5,4 0,8 5,4 21,8 7,2
LAB4 4,3 5,0 3,0 5,5 17,9 8,3 4,4 2,8 4,7 4,4 4,7 11,1 6,2
LAB5 3,3 12,8 2,5 5,1 13,5 4,4 3,8 7,7 4,7 10,2 4,7 15,7 9,3
LAB6 2,4 6,4 1,3 6,3 12,5 9,1 3,9 1,1 3,7 4,9 3,7 20,8 8,1
LAB7 3,3 13,7 2,2 10,5 13,3 3,4 3,7 14,8 3,7 12,3 3,7 7,8 10,41
Mittelwert 3,22 9,98 2,38 5,99 13,82 5,19 3,98 6,16 4,64 6,65 4,64 13,38 7,72

n Laboratorien 6 7 7 7 7 7
SD 0,60 0,73 2,08 0,64 1,25 1,25
%CVR 18,5 30,5 15,1 16,1 26,9 26,9

33
DIN EN ISO 20130:2021-02
EN ISO 20130:2020 (D)

Tabelle B.11 — Zusammenfassung der Ringversuchsergebnisse für die -Galactosidase-Aktivität

BODEN1 BODEN2 BODEN3 BODEN5 BODEN6 BODEN7 TOTAL
GALACTOSI- Mittel-
DASE Mittel %CVr Mittel- %CVr Mittel- %CVr Mittel- %CV Mittel- %CV Mittel- %CV wert
wert wert wert wert r wert r wert r
von CVr

LAB1 1,1 12,3 1,0 5,2 4,4 0,4 1,1 4,8 1,3 8,5 1,0 17,4 8,1
LAB2 0,6 19,4 0,7 5,1 2,0 4,0 1,1 4,5 0,9 7,8 0,6 7,9 8,1
LAB3 2,0 8,1 1,8 0,9 5,3 6,8 2,0 0,3 2,3 3,6 1,8** 5,7** 3,9
LAB4 1,2 12,0 1,1 10,0 4,2 16,7 1,3 4,4 1,6 7,2 1,1 5,3 9,3
LAB5 1,1 16,6 0,9 8,8 3,4 6,0 1,3 8,8 1,2 6,0 0,8 3,8 8,3
LAB6 1,4 21,8 1,3 7,0 5,0 9,4 1,7 3,5 1,8 3,3 1,2 2,0 7,8
LAB7 1,7 36,8 1,5 21,5 10,1** 8,7** 1,1 3,5 2,5 8,5 1,1 21,7 18,40
Mittelwert 1,29 18,12 1,20 8,34 4,04 7,21 1,37 4,27 1,65 6,42 0,96 9,69 9,14

n Laboratorien 7 7 6 7 7 6
SD 0,41 0,37 1,09 0,33 0,54 0,21
%CVR 31,7 30,8 27,1 23,9 32,6 21,7

Tabelle B.12 — Zusammenfassung der Ringversuchsergebnisse für die NAG-Aktivität

BODEN1 BODEN2 BODEN3 BODEN5 BODEN6 BODEN7 TOTAL

NAG Mittel-
Mittel %CVr Mittel- %CVr Mittel- %CVr Mittel- %CVr Mittel- %CVr Mittel- %CVr wert
wert wert wert wert wert wert von CVr

LAB1 1,2 3,4 0,8 11,1 8,2 3,9 1,4 3,9 2,4 0,9 1,1 8,9 5,4
LAB2 1,8 21,1 1,2 36,3 9,9 4,1 1,9 3,3 2,4 2,0 1,0 8,4 12,5
LAB3 1,6 17,0 1,0 21,0 8,7 10,4 1,6 15,2 2,6 4,1 1,2 29,9 16,3
LAB4 1,4 8,6 0,9 1,6 6,6 12,0 1,7 2,8 2,0 13,8 0,9 7,0 7,7
LAB5 2,2 3,7 1,2 46,6 7,7 5,1 2,2 14,6 2,7 14,3 0,9 22,8 17,8
LAB6 1,7 14,5 1,1 13,2 10,0 6,4 2,0 17,4 2,5 12,8 1,2 16,3 13,4
LAB7 2,1 33,0 1,2 13,9 9,9 24,2 2,2 46,3 2,8 12,1 1,2 10,1 23,27
Mittelwert 1,71 14,47 1,06 20,54 8,71 9,44 1,85 14,80 2,50 8,57 1,07 14,78 13,77

n Laboratorien 7 7 7 7 7 7
SD 0,33 0,14 1,21 0,28 0,25 0,15
%CVR 19,6 13,5 13,9 15,4 9,8 13,9

34
 DIN EN ISO 20130:2021-02
EN ISO 20130:2020 (D)

Tabelle B.13 — Zusammenfassung der Ringversuchsergebnisse für die Urease-Aktivität

BODEN1 BODEN2 BODEN3 BODEN5 BODEN6 BODEN7 TOTAL

UREASE Mittel-
Mittel- %CVr Mittel- %CV Mittel- %CVr Mittel- %CVr Mittel- %CVr Mittel %CV wert
wert wert r wert wert wert wert r
von CVr

LAB1 4,9 18,5 12,8 2,9 15,4 3,6 10,3 3,2 1,4 49,1 10,0 20,0 16,2
LAB2 3,2 8,1 9,5 8,9 12,5 2,4 nd 3,2 4,2 8,6 4,1 5,5
LAB3 4,1 23,2 13,4 19,3 20,5 3,2 12,8 17,2 4,8 14,2 10,1 18,7 16,0
LAB4 4,3 22,5 16,4 4,6 17,7 11,0 12,8 2,0 5,9 8,8 13,1 8,1 9,5
LAB5 nd nd nd nd nd nd
LAB6 4,8 14,3 13,4 5,8 14,5 9,4 9,9 0,5 5,6 11,1 11,9 2,0 7,2
LAB7 3,5 2,4 13,0 9,7 14,8 7,5 9,1 11,0 4,8 5,3 14,4 2,9 6,46
Mittelwert 4,12 14,85 13,08 8,52 15,90 6,18 11,00 6,77 4,29 15,44 11,34 9,30 10,14
n Laboratorien 6 6 6 5 6 6
SD 0,63 1,99 2,57 1,54 1,54 1,99
%CVR 15,2 15,2 16,2 14,0 35,9 17,5

Tabelle B.14 — Zusammenfassung der Ringversuchsergebnisse für die Arylamidase-Aktivität

BODEN1 BODEN2 BODEN3 BODEN5 BODEN6 BODEN7 TOTAL
ARYLAMI- Mittel-
DASE Mittel- %CVr Mittel- %CVr Mittel- Mittel- %CVr Mittel- %CV Mittel %CV wert
%CVr r r
wert wert wert wert wert wert von CVr

LAB1 2,6 7,1 4,1 3,5 8,6 5,2 4,7 6,8 3,9 6,4 7,8 10,9 6,6
LAB2 1,8 5,6 2,3 6,1 4,3 3,2 2,8 3,3 2,2 7,5 5,4 2,0 4,6
LAB3 1,7 13,3 2,4 8,7 6,4 1,7 3,1 5,1 2,6 8,4 5,9 7,8 7,5
LAB4 2,6 6,4 3,2 2,1 7,8 7,7 3,9 4,0 3,2 5,4 6,7 1,8 4,6
LAB5 2,1 5,2 2,6 4,7 6,7 2,2 3,6 5,7 2,9 2,5 6,5 5,8 4,3
LAB6 0,1** 164,1** 1,1 10,7 3,3 18,1 2,9 2,5 1,3 21,0 3,4 12,9 13,1
LAB7 2,3 3,8 3,2 7,4 8,9 4,1 3,5 9,2 3,3 7,5 8,1 4,7 6,09
Mittelwert 2,20 6,89 2,68 6,18 6,55 6,02 3,49 5,23 2,77 8,38 6,23 6,55 6,69
n Laboratorien 6 7 7 7 7 7
SD 0,35 0,86 1,97 0,62 0,68 1,46
%CVR 15,9 31,9 30,1 17,8 24,4 23,5

Bezüglich der Variabilität innerhalb eines Laboratoriums ist CVr (globaler Mittelwert für alle Enzyme) in
8 von 10 Fällen 10 % und bei 6 von 7 Laboratorien ist CVr 10 %.

Bei der Untersuchung der Variabilität zwischen Laboratorien ergaben die Ergebnisse in Bezug auf 60 CVR für
Boden/Enzymaktivitäten (6 Böden mit 10 Enzymaktivitäten) 33 Boden-/Enzym-Analysen mit %CVR 20 %,
17 Boden-/Enzym-Analysen mit 20 % %CVR 30 % und 6 Boden-/Enzym-Ergebnisse mit %CVR > 30 %
(jedoch < 40 %). Wenn das Spektrum an Böden für jedes Laboratorium und alle Enzymdaten betrachtet wird,
zeigen die Daten, dass das Bodenspektrum selbst bei %CV > 30 % berücksichtigt wird.

Schlussfolgerungen: Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung zeigt die Überprüfung der Referenztests, dass diese
Methoden der Messung aller enzymatischen Aktivitäten in Böden mit guter Wiederholpräzision und
Reproduzierbarkeit dienten.

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DIN EN ISO 20130:2021-02
EN ISO 20130:2020 (D)

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